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灵芝多糖对糖尿病大鼠肾组织TGF-B1和CO-IV表达的阻碍毛春谱，李小毅，张红梅，林桂芬，李伟【摘要】目的观看转化生长因子Bl(TGF-81)及IV型胶原(C0-IV)在糖尿病大鼠肾组织中的表达及灵芝多糖干与后的阻碍。方式腹腔注射链胭佐菌素(STZ)诱导大鼠造成糖尿病模型，分组予不同剂量灵芝多糖(GLP)进行医治性灌胃。8周后，用免疫组化方式和RT-PCR方式检测各组大鼠肾皮质TGF-8—、④-八/的蛋白和由皿人表达。结果糖尿病组大鼠肾小球TGF-3一、CO-IV蛋白和mRXA表达较正常对照组明显升高(PO；灵芝多糖各组较糖尿病组表达降低(POo结论灵芝多糖可能通过下调糖尿病大鼠肾脏中TGF-P1和CO-N的表达，减少细胞外基质积聚，起到对糖尿病大鼠肾脏爱惜作用。【关键词】灵芝多糖；糖尿病肾病；转化生长因子81；N型胶原Abstract：ObjectiveToinvestigatetheexpressionsoftransforminggrowthfactor-Betal(TGF-P1)andtypeIcollagen(CO-IV)inthekidneyofdiabeticratsandtheeffectsofGanodermalucidumpolysaccharides(GLP)onsuchratmodelwasinducedbystreptozocin(60mg/kg)andtheratsweredividedinto5groupsrandomlyandtreatedwithdifferentdoseweekslater,theexpressionofTGF-P1andCO-IV inkidneytissuewasdeterminedbyimmunohistochemistryandRT-PCRwithgroupC，theexpressionsofproteinandmRNATGF-B一、CO-Isignificantlyincreasedinglomeruli(P<).Theabnormalexpressionsoftheseproteins>mRNAweredramaticallyimprovedindiabeticratsbyGLPtreatment(P<).ConclusionGLPhassomerenalprotectiveeffectondiabeticrats,throughinhibitionofexcessivedepositionofglomeruliextracellularmatrixbyinhibitingtheexpressionofTGF-P1anddecreasingthesynthesisofCO-IV.Keywords：Ganodermalucidumpolysaccharides；Diabeticnephropathy；Transforminggrowthfactor-P1；TypeIVcollagen随着人们生活水平的提高和人口的老龄化，糖尿病的发病率逐年升高。糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最重要的慢性微血管并发症之一，也是糖尿病要紧的死亡缘故之一。目前,单纯西药尚不能有效阻止糖尿病肾损害的自然进程，灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，为滋补强壮，扶正固木的珍品，它的有效成份超级丰硕，要紧有灵芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides,GLP)、三葩类化合物、灵芝酸、腺甘等，其中GLP是最有效的活性成份之一。灵芝的药理活性大多和GLP有关，其具有普遍的药理活性［1］,能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，排除自由基，抗氧化［2］,抗辐射和降低血脂［3］等作用，但对DN的作用报导很少。本研究采 纳免疫组化和RT-PCR方式观看灵芝多糖不同剂量组对糖尿病大鼠肾组织的转化生长因子Bl（transforminggrowthfactor-P1,TGF-Bl）和IV型胶原（typeNcollagen,CON）的表达转变，旨在探讨GLP对DN的爱惜机制［4〜1材料与仪器清洁级雄性SD大鼠50只，体质量180〜220g（徐州医学院实验动物中心）。STZ（美国Sigma公司），灵芝多糖（河北保定施达科生物工程技术，批号：RM051215）。一抗别离为兔抗大鼠TGF-13一、CO-IV抗体、SP-6001试剂盒及DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术）,TotalRNA提取试剂、RT-PCR试剂盒（大连宝生物）。LEICAQwin图像处置与分析系统（德国），罗氏血糖仪（上海罗氏公司），日立7600型全自动生化分析仪检测（日今日立公司）。2方式糖尿病模型的成立和实验分组将50只SD大鼠随机分为：正常对照组（C组，n=10）,糖尿病组未医治组（DM组，n=10）,灵芝多糖低剂量组（GLP-1组，n=10）,灵芝多糖中剂量组（GLP-2组,n=10）,灵芝多糖高剂量组（GLP-3组，n=10）,分笼饲养。DM组和GLP—一、GLP-二、GLP-3组大鼠在禁食12h后，于左下腹腔一次性注射STZ（溶于mmol/L柠檬酸缓冲液,pH）60mg/kg,72h后,尾静脉采血测随机血糖2mmol/L, 持续3d以上作为模型纳入本实验。C组仅予以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。40只大鼠经检测均造模成功。模型成立3d后GLP-一、GLP-二、GLP-3组别离给予灵芝多糖水溶液100,200,400mg/kg剂量进行医治性灌胃，C组和DM组用等体积生理盐水灌胃。所有大鼠实验期间自由饮水进食，不利用胰岛素及其他降糖药物。每隔1周测量体质量（BodyWeight,BW）以调整用药量。标本搜集持续观看8周后搜集标本。代谢笼中搜集24h尿,离心保留于一20℃的冰箱待测尿微量白蛋白（UAER）o称量体质量后,用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血测血糖（BG）、糖化血红蛋白（HbAlc）、尿素氮（BUN）、血肌酎（Ser）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）0用4℃冰凉生理盐水灌洗后摘除双肾，去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾，左肾重（KW）和体质量的比值作为肾脏指数（KI）的指标。取肾皮质置于10%中性福尔马林中固定，以备光镜、免疫组织化学研究；余肾皮质置DEPC水处置过的EP管，液氮冻透后保留于-70C的冰箱待测RT-PCRo生化指标的测定BG采纳葡萄糖氧化酶法检测，UAER采纳胶体金双抗体夹心法检测，HbAlc采纳亲和层析法检测，BUN、Scr、TC、TG由日立7600型全自动生化分析仪检测。常规光镜检测肾组织经10%福尔马林固定，常规脱水、包埋，切片厚4um,行HE染色和免疫组化。 免疫组化研究采纳SP二步法，石蜡切片厚4Um后常规脱蜡至水，3%H202阻断内源性过氧化物酶后，微波加热暴露抗原，滴加一抗TGF-B1（1：100）、CO-IV（1：120）,4℃冰箱留宿，PBS洗片后滴加二抗，37℃孵育lh,DAB显色操纵在3〜5min,复染、脱水、透明、封片。以吸光度值（A）表示，显色强度用LEICAQwin图像处置与分析系统进行分析，以每张切片随机取10个视野的肾小球进行半定量分析。RT-PCR研究由基因库别离查得大鼠TGF-B—、C0-IV及3-actin的mRNA核甘酸序列，PCR引物用PrimerPremier引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术效劳合成（见表1）。表1大鼠转化生长因子-Bl（TGF-P1）、CO-IV及B-actin引物序列（略）取肾皮质100mg,加液氮研碎后，用Trizol（大连宝生物工程）提取总RNA。提取的总RNA测0D值：0D260/0D280值在〜之间。别离取1Ug总RXA以AMV1（大连宝生物工程）为逆转录酶作逆转录反映，cDNA产物保留于-20℃。优化PCR扩增条件，使PCR扩增在对数期内进行。别离进行TGF-Bl、CO-IV与B-actin扩增。在DA扩增仪(EppendorfMastercylergradient)上进行PCR扩增。TGF-P1的反映参数为94℃2min,94℃45s、62℃45s、72℃45s共35个循环；CO-IV的反映参数94℃2min,94℃45s、64℃45s、72℃45s共35个循环；B-actin反映参数为94℃2min»94℃45s、57℃45s、72℃45s共35个循环。取PCR扩增产物5u1在%琼脂糖中电泳，ImagemasterVDS成像系统摄影存盘后应用运算机图像分析软件(TotallabV1.01)行灰度扫描分析。以目的基因与［-actin 的PCR产物条带灰度Volume之比作为反映目的基因mRXA水平的相对指标。统计学处置计量资料用土s表示，应用SPSS统计软件进行统计分析，组间比较采纳单因素方差分析。3结果一样情形和常规生化指标DM组大鼠在实验期间多饮、多尿、多食、体质量减轻、毛色无光泽、生长发育迟缓等病症十分明显。8周时DM组与C组相较，BG,KI,HbAlc,UAER显著升高，而KW明显下降(P<),Scr,BUN,TC,TG各组不同无统计学意义，GLP各组医治后BW增加，KI降低，UAER指标明显改善，尤以灵芝多糖高剂量组明显(P<),但BG、HbAlc不同无统计学意义。结果见表2。表2灵芝多糖对糖尿病大鼠血生化指标、肾脏指数及尿微量白蛋白的阻碍（略）一样形态学改变DM组大鼠较C组系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭小，GLP各组较DM组上述病理改变有不同程度改善。免疫组化结果免疫组化染色显示阳性颗粒要紧定位于肾小 球和肾小管：DM组较C组比较，TGF-B—、CO-N棕黄色颗粒染色强度明显升高，染色面积增多（P<；GLP各组较DM组相较均不同程度降低（P<。结果见表3及图loRT-PCR结果8周时，与C组相较，DM组TGF-BlmRXA、C0-IVmRNA表达增多；与DM组相较，GLP各组TGF-BlmRXA.CO-JVmRXA表达减少（P<，见表3及图2。表3灵芝多糖对各组糖尿病大鼠TGF-P1和CO-IV表达的阻碍（略）4讨论本实验结果说明STZ诱导的糖尿病大鼠模型，8周后大鼠显现毛色无光泽、生长发育迟缓等病症，BG、KI、HbAlc、UAER显著升高，病理上肾小球系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭小，提示已显现DN初期表现。GLP给药8周后糖尿病大鼠BW增加、KI降低，UAER指标明显改善，肾脏病理损害取得不同程度的改善，呈现剂量依托趋势，尤以灵芝多糖高剂量组明显。但对BUN、Scr、TC、TG无阻碍，这可能与糖尿病大鼠模型时刻较短，尚未显现全面的代谢紊乱有关。【参考文献】[1]林志彬.灵芝的药理作用[A].林志彬.灵芝的现代研究,第 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