白藜芦醇对重症急性胰腺炎大鼠肝脏的保护作用

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1、白藜芦醇对重症急性胰腺炎大鼠肝脏的保护作用：沙焕臣，马清涌，徐复国，马振华【摘要】目的探讨白藜芦醇对实验性重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis,SAP)大鼠肝功能的保护作用。方法96只成年雄性SD大鼠随机分为假手术(shamoperation,SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)组、地塞米松(dexamethasone,DEX)治疗组和白藜芦醇(resveratrol,RES)治疗组。各组大鼠均于制模后3、6、12h采集标本。生化方法进行肝功能测定；酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)测定血清TNFα和IL

2、6含量；透射电镜观察胰腺和肝脏超微结构的变化；RTPCR检测凋亡调控基因Bax、Bcl2和caspase3mRNA表达；ODS)和其继发的多器官功能衰竭(multipleorganfailure,MOF)。由于解剖位置、生理功能和血流动力学等因素，肝脏成为SAP时最易发生损害的胰腺外器官之一。SAP患者肝脏功能损伤的发生率可高达80%～100%不等[1]。而肝脏损害又反过来促进其他脏器的损害。肝脏作为机体代谢中心，其特殊和复杂的生理功能使之成为对急性胰腺炎病情进展影响最大的脏器。急性胰腺炎产生的炎性介质可以被肝脏降解灭活，同时也可以导致肝脏的损害，而肝脏损害可以通过直接或间接介导作

3、用引起其他胰外脏器的损害。急性胰腺炎，尤其是SAP引起的肝脏损害机制复杂。近年来的研究发现，可能与胰酶激活、炎症介质、肝脏血流紊乱及肝脏细胞凋亡等因素密切相关。我们前期大量的动物实验证实，白藜芦醇(resveratrol,RES)具有较好的治疗大鼠重症胰腺炎的作用[26]。本研究的目的是观察白藜芦醇对大鼠肝脏损伤的保护作用以及其作用的可能通路，从而进一步探讨白藜芦醇治疗SAP的机制。1材料与方法1.1材料健康成年雄性SD大鼠96只，体重250～300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供；牛磺胆酸钠由美国Sigma公司提供；白藜芦醇由西安奥塞斯生物有限公司提供；TNFα、IL6EL

4、ISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供；PCR试剂盒为日本TaKaRa生物技术公司产品；引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；Bax、Bcl2、caspase3、细胞色素C单克隆抗体，由美国Santa公司提供；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ⅱ抗、小鼠抗βactin单克隆抗体，由北京博奥森生物技术公司提供；线粒体提取试剂盒由美国Genmed生物工程有限公司提供；ECL增强化学发光剂由美国Pierce公司提供；透射电镜由日本东芝公司提供。1.2实验动物与模型制作方法96只成年雄性健康SD大鼠，随机分为假手术组(SO)组、胰腺炎模型组(SAP)组、白藜芦醇治疗组(RES)和地塞米松对照

5、(DEX)组，每组分为3、6、12h三个时间点各8只。大鼠禁食12h，禁水4h，25g/L戊巴比妥钠(1.2mg/kg)腹腔注射麻醉。动脉夹夹闭胰胆管近端和远端，40g/L牛磺胆酸钠(1mL/kg)经胰胆管逆行注射，保持1min后拔出穿刺针，取出动脉夹。SO组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁。RES组在建立模型后立即经阴茎背静脉注射白藜芦醇10mg/kg。DEX对照组在建立模型后立即经阴茎背静脉注射地塞米松0.5mg/kg。大鼠分别在造模后3、6、12h剖杀取材。1.3大鼠12h腹水计量和死亡率记录以10mL注射器收集大鼠腹水并计量。未到12h死亡的大鼠从本组中排除，另选大鼠补齐，以死亡的大

6、鼠数量和总计应用的大鼠数量比值计算大鼠死亡率。1.4血浆ALT、AST和TBIL含量的检测大鼠剖杀前从门静脉取血4mL，1500g离心2min收集血浆，部分标本-80℃保存用于ELISA检测，部分标本应用自动生化分析仪测定血浆中谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)和总胆红素(totalbilirubin,TBIL)水平。1.5血浆TNFα和IL6的ELISA检测应用晶美生物工程有限公司提供的ELISA检测试剂盒检测血浆中TNFα(tumornecrosisfactoralpha

7、)和IL6(interleukin6)的含量。详细步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。1.6肝组织和胰腺组织的病理学观察胰腺组织40g/L多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，作HE染色，光镜下观察胰腺组织病理学改变。另取肝脏和胰腺组织1mm3以25mL/L戊二醛4℃固定8h，梯度酒精脱水，环氧树脂Epon812浸透，LKBV型超薄切片机进行超薄切片(50～70nm)，电镜下观察组织超微结构的改变。1.7肝组织总RNA提