丹酚酸b体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

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1、丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究：徐秀梅，郭茂娟赵旭范英昌【摘要】　　目的　观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs，对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250μg/L与10μmol/L)，诱导24h后继续培养4周，观察其形态学变化，免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a

2、-actinmRNA的表达。结果诱导后的MSCs体积增大，增殖减慢，并出现肌管样结构；免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT，与5-aza组相比，SalB组cTnT表达较低，SalB联合5-aza组cTnT表达升高；实时荧光定量RT-PCR结果显示各组均表达心肌分化早期基因，SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他两组。结论SalB可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞，其与5-aza联合诱导可明显提高MSCs向心肌细胞分化的能力。【关键词】丹酚酸B；骨髓间充质干细胞；体外诱导；免疫细胞化学；实时荧光定量RT-PCR　　

3、骨髓间充质干细胞(MSCs)系自体,取材容易,扩增能力强,是一种体内外均有极强的分化潜能的干细胞［1］。1995年，SCs体外可被5-aza诱导分化为心肌样细胞。但5-aza作为抗肿瘤药物具有一定的毒副作用,故寻找安全、有效的诱导剂应是目前的重要课题。我们前期的研究结果表明SalB可以减小心肌梗塞的面积［3］，并能有效地促进梗塞灶内成纤维细胞的增生，加速心脏的修复过程。那么，它对有心肌分化潜能的MSCs起什么作用呢？为进一步研究其机制，我们进行了中药单体丹酚酸B(SalB)体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究。现将研究结果报道如下。　　1器材　　1.1动物　　（200±20）g体重

4、的EM培养液、1∶250胰蛋白酶、EDTA、双抗，Gibco公司；胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）,Hyclone公司；D-Hanks缓冲液；percoll淋巴细胞分离液，Pharmacia公司；CD44兔多克隆抗体〔RabbitAnti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗体（RabbitAnti-CD34）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒、PBS缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠单克隆抗体TroponinT,CardiacIsoformAb-3(CloneCT-3)，美国Labvision公司；即用型SP免疫组化染色试剂盒

5、(cat.no.MSP859143)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；TaqManReverseTranscriptionReagents、SYBRGreenPCRMasterMixreagentkits试剂盒(AppliedBiosystems)、Trizol总RNA提取试剂，天津润泰科技发展有限公司；5％CO2恒温培养箱（modelTC2323CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-10198010）；SSCs的分离培养　　　将大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量D-Hank's液冲洗骨髓，100目筛网过滤，将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于

6、试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液，离心（1800r/min,20min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次（800r/min,5min）后接种于完全培养液（含10%胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素的L-DMEM培养液），置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，24h后首次换液，以后每3d更换1次培养液，2周后细胞长满瓶底。　　2.2MSCs的传代及纯化　　待原代MSCs长满瓶底时，用1∶1配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA对细胞进行消化2～3min，以完全培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞，制成

7、单细胞悬液,按1∶3进行传代培养，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时,重复上述操作,反复传至第9代。　　2.3MSCs的鉴定　　　选用生长状况良好的第9代MSCs，用免疫细胞化学方法检测细胞表面抗原CD44和CD34。将第9代的大鼠MSCs培养于6孔板，孔板内预置无菌盖玻片，周后，细胞80%长满瓶底，用95%乙醇（加少量冰醋酸）固定15min，PBS彻底清洗。滴加5%BSA封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体，不洗。滴加以1∶100浓度稀释的一抗（兔IgG