诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化实验探究

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诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化实验探究作者：郭茂娟姜希娟马东明范英昌【摘要】目的观察乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB、5氮胞昔(5aza)及SalB联合5aza体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs,培养乳鼠心肌细胞，收集条件培养液对其进行分组诱导：①SalB(终浓度为250Ug/L),②5aza组(终浓度为10ug/L),③SalB联合5aza组(终浓度分别为250ug/L与10umol/L),④乳鼠心肌细胞条件培养液，⑤未加诱导剂的阴性对照组。选取MSCs进行诱导，诱导周期为4wo倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化，免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)表达，实时荧光定量RTPCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA4mRNA的相对表达量。结果细胞形态学显示，诱导后的MSCs体积增大，增殖减慢，并出现肌管样结构；免疫细胞化学结果显示，诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5aza组相比，SalB组和条件培养液两组蛋白表达较低，SalB联合5aza组蛋白表达升高；实时荧光定量RTPCR结果显示除阴性对照组外，其他四组表达心 肌分化早期基因，SalB联合5aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他三组。结论SalB联合5aza诱导MSCs表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT；上调心肌早期基因NKX2.5、GATA4mRNA的表达，证实其能够向心肌细胞分化能力；条件培养液不能上调心肌细胞的早期基因和蛋白，不能诱导其分化。【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；丹酚酸B；5氮胞昔[Abstract】ObjectiveToexploretheroleandmechanismofbonemarrowmesenchymalstemcells(MSCs)differentiatedintomyocardialcellsinducedbyneonatairatmyocardialcellsconditionedmedium,salvianolicacidB(SalB),andSalBcombinedwith5azacytidine・MethodsMSCsofratswereseparated,culturedandindentified.Neonatairatmyocardialcellswereculturedandconditionculturefluidwascollected.MSCswereinducedbySalB(terminalconcentration250ug/L),5azacytidine(5aza)(250Pg/L),SalBcombinedwith5aza(250ug/Land10Pmol/L),Neonatalratmyocardialcellsconditionculturefluid,andwihoutanyinducerrespectivelyfor4weeks・Cellsgrowthconditionandmorphologicchangewereobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope,cTnT expressionwasindentifiedbyimmnocytohistochemicalassay,andmyocardialearlygeneNKX2.5,andGATA4mRNAexpressionweredetectedbyRTPCR・Results①Cellmorphologicobservation：afterinducing,MSCsvolumeenlarged,proliferationspeedsloweddownandappearredstruetureofmyotube.©ExpressionofcTnT：cTnTwasdetectedininducedMSCs.Comparedwith5azagroup,thecTnTexpressionsinSalBgroupandconditionculturefluidgroupwerelowinSalBgroupandconditionculturefluidgroupandhighinSalBcombinedwith5azagroup・©Expressionsofmyocardialearlygene：myocardialearlygenewasmeasuredinother4groupsexceptnegativecontrolgroup,andwashighinSalBcombinedwith5azagroupthaninother3groups・ConelusionsSalBcombinedwith5azacaninduceMSCstoexpressmyocardialspecifictroponin(cTnT),upregulateearlygeneNKX2.5andGATA4mRNA,whichconfirmMSCscandifferentiateintomyocardialcellsandconditionculturefluidcan'tupregulatetheexpressionsofmyocardialearlygeneandprotein,andinduceMSCsdifferentiation.[Keywords]Marrowmesenchymalstemcells；Inducedanddifferentiated；SalvianolicacidB；5 azacytidine骨髓间充质干细胞(MSCs)系自体来源，取材容易，扩增能力强，是一种体内外均有极强的分化潜能的干细胞(l)oWakitanis等〔2)研究发现体外分离培养的大鼠MSCs体外可被5aza诱导分化为心肌样细胞。但5氮胞昔(5aza)作为抗肿瘤药物具有一定的毒副作用，故寻找安全、有效的诱导剂应是目前的重要课题。以往的研究结果表明SalB可以减小心肌梗死的面积〔3),并能有效地促进梗死灶内成纤维细胞的增生，加速心脏的修复过程。本研究运用乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB、5aza以及SalB联合5aza体外诱导，分别从诱导后细胞的形态学、心肌特异性蛋白cTnT表达及心脏早期分化基因NKx2.5、GATA4mRNA表达方面进行比较。1材料与方法1.1动物清洁级，Wistar雄性大鼠(由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk20050001),体质量(200±20)go新生Wistar乳鼠。1.2仪器、试剂与药品LDZX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；SWCJ2FD型单人双面净化工作台，ModelTC2323C02细胞培养箱，微量移液器（法国Gilson）；ELWDO.3相差显微镜，，HH6数显恒温水浴锅，LDZ52离心机，6孔培养板，50ml离心管（美国 Corning公司）；台式髙速低温离心机（Hermlez323K美国）；UV530紫外分光光度计（上海生物仪器厂），ABI7300实时定量PCR仪，EP管，Tip头,PCR管，微量移液器,DMEM低糖培养基，胰蛋白酶（美国GiBco公司）；优级胎牛血清（美国Hyclone公司）；双抗,EDTA（美国Sigma公司）；小鼠抗大鼠单克隆抗体TroponinTcardiacIsoformAB3（美国LaBvision公司）；即用型SP免疫组化染色试剂盒，浓缩型DAB试剂盒（天津潮洋生物制品科技有限责任公司）；TaqManReverseTranscriptionReagents,SYERGreenPCRMasterMixreagentkits试剂盒（AppliedBiosystems）；Trizol总RNA提取试剂（天津润泰科技发展有限公司）。5aza（Sigma公司）；SalB（天津天士力制药股份有限公司）。1.3细胞的培养及鉴定1.3.1骨髓间充质干细胞的原代培养大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量DHank's液冲洗骨髓，100目筛网过滤，采用Percoll分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，收获位于界面层灰白色的单个核细胞。以1.0X106/cm2的密度接种LDMEM完全培养液（含体积分数为0.1的胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素），置于37°C.5%的C02饱和湿度培养箱中继续培养,48h后首次换液，以后每隔3d更换1次培养液，2w后细胞长满80%瓶底，进行传代。 1.3.2骨髓间充质干细胞的鉴定选用生长状况良好的第2代骨髓间充质干细胞，采用SABC法检测细胞表面抗原CD44+、CD34-的细胞即为所需细胞。1.3.3新生大鼠心肌细胞分离与培养新生Wistar大鼠，无菌条件下取出心脏，用眼科剪剪碎心肌组织，加入0.25%胰酶消化，反复吹吸消化5〜6min,收集消化液至含10%FBS培养液中，然后继续向残余组织中加胰酶消化，反复至组织完全消化为止。消化液经筛网过滤后离心，用含10%FBS培养液重悬沉淀，37°C5%C02培养，贴壁2h后、转培养液入培养板。1.4诱导培养液的制备、条件培养液的制备及MSCs的条件培养液培养每2d更换培养液，并收集心肌细胞培养的培养液，过滤后加入等体积的含10%FBS的DMEM/F12C1:1）培养液，即为条件培养液。将传至第9代的MSCs按每孔1X106细胞数接种入置有盖玻片的6孔培养板中，加入条件培养液，作用48h,更换为普通培养液；对照组为普通培养液培养，每48h换液共1woMSCs的诱导分化：将第9代MSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板中，培养2d,将完全培养液换为无血清培养液，24h后进行分组诱导：SalB组（终浓度为250ug/L）.5aza组（终浓度为10umol/L）.SalB联合5aza组（终浓度分别为250ug/L,10umol/L）,并设空白阴性对照组，仅用LDMEM诱导。 诱导剂作用24h后，更换完全培养液继续培养，每3d换液1次，共4w。1.5测定指标免疫细胞化学鉴定心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）o取诱导后4w的细胞，用95%乙醇（加少量冰醋酸）固定15min,PBS彻底清洗。用羊血清封闭，滴加cTnT（l：50）,阴性对照用PBS代替一抗，4工冰箱过夜。其余步骤按超敏SP试剂盒操作程序进行，最后苏木素复染,梯度酒精脱水，中性树脂封固。显微镜下观察，胞质中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。每组选取染色较好的8张玻片,在显微镜下每张玻片取5个视野，由数码摄像机摄入，用ImageProPlus6.0图像分析软件对结果进行分析。骨髓间充质干细胞诱导后心肌早期基因的表达：采用嵌合荧光检测法，试剂盒中的SYBRGreenI与双链DNA结合后发出荧光,以便在PCR扩增反应中对每一个循环产物荧光信号进行实时监测，并通过荧光强弱检测产物量的变化以实现对起始模板的定量分析。所得CT值经转换后以2-AACT相对定量法获得每个样本目的基因相对表达量数值。1.6统计学分析采用SPSS11.5软件进行方差分析，结果以x土s表示。2结果2.1细胞形态学观察5aza组诱导2w后，细胞有部分死亡，还有部分细胞体积开始变大，形态各异，呈梭形、长方形、不规则形；SalB组诱导2w后细胞增殖能力减弱， 部分细胞因接触抑制死亡的细胞数量相对增加。3〜4w后细胞有大量死亡，但数量较阴性空白组少。联合组诱导2w细胞呈梭形、长方形的细胞数量相对增多，细胞增殖能力减弱,3w后个别胞浆中可见明显颗粒状物质，部分视野可见肌管样结构，四周细胞形态均一，细胞间发生融合，排列具有方向性。条件培养液组诱导lw后长满培养瓶底，细胞呈梭形,2w后细胞形态变化同前。3〜4w后，细胞接触抑制死亡的细胞数量增多。阴性对照组细胞在诱导1w后基本长满培养瓶底，2w后因生长抑制开始死亡，细胞重叠生长，状态不佳。3〜4w后阴性对照组的细胞大片死亡，镜下形态不清。2.2诱导后骨髓间充质干细胞心肌早期基因的表达除空白阴性对照组外，其余四组均表达心肌分化早期基因，SalB联合5aza组诱导后的MSCs心肌早期分化基因表达最咼。见表1。表1各诱导组MSCs两种基因mRNA相对表达量（略）与5aza组比较：1）P<0.052.3诱导后MSCs的免疫细胞化学鉴定骨髓间充质干细胞的胞浆出现棕黄色颗粒状物质为阳性表达。未诱导的MSCs空白对照组未发现cTnT阳性细胞，其余各组中cTnT免疫细胞化学染色均可见阳性细胞，与5aza组〔(22.42±9.97)%〕相比，SalB联合5aza组[(28.21±3.80)%]的cTnT表达明显增加，阳性表达率为28.21%,SalB组1( 11.67±5.39)%)和条件培养液组[(10.27±6.21)%]的阳性表达率较低。3讨论随着骨髓间充质干细胞分离、培养和纯化技术的不断发展和成熟，越来越多的研究者关注于诱导其定向分化为所需的细胞，其中处于心脏细胞与组织再生工程领域的人们正热衷于诱导其向心肌细胞分化的研究(4,5)。但是对于MSCs选择诱导的代数，众说纷纭。本研究过程中，曾经对选择细胞的诱导代数进行了对比研究，发现第9代的MSCs无论细胞纯度、细胞活力、细胞被诱导分化能力均比第二代强(6〕,故本实验选择了第9代MSCs。本研究首先通过形态学观察发现，诱导后的骨髓间充质干细胞形态及排列均不断发生变化，表现为细胞体积增大，向四周延伸，细胞内形成类肌管状结构，细胞间发生融合，排列方向趋于一致；其次进一步利用免疫细胞化学技术对上述两代诱导后的骨髓间充质干细胞进行心肌特异性标志物cTnT表达进行了检测。cTnT是心肌肌钙蛋白中具有较高特异性的亚型，是鉴定心肌源性细胞的特异性标志物〔7,8）；最后本研究应用与常规PCR相比自动化程度高且特异性更强的实时荧光定量PCR技术检测了具有代表性的 两种心肌早期分化基因Nkx2.5、GATA4mRNA的表达。Nkx2.5基因在心脏中特异表达，在胚胎、胎儿心肌细胞中保持一定的表达水平，是心脏前体细胞分化的最早期标志之一（9）°GATA4作为GATA转录因子家族成员，最初表达于原始心肌中层，然后在血管和心脏内膜及肌层中表达，不仅直接参与调节心肌细胞结构基因和相关调控基因的表达，还可与几种心肌基因调控区DNA结合，参与心肌细胞的分化过程（10,11）。NKX2.5、GATA4在心肌细胞发育的早期即出现表达，两者单独或协同作用可促进正常心肌细胞的特化、分化和成熟。本研究从体外探讨了条件培养液、SalB、5aza、及联合组诱导MSCs分化为心肌样细胞的机制，认为联合组诱导MSCs向心肌细胞分化的可能机制一方面是由于联合组作用MSCs后分泌某些有利于心肌细胞生长的因子，从而影响了其向心肌细胞分化的相关基因及蛋白的表达；另一方面可能是由于其上调了心肌分化相关基因的表达。本实验中利用了条件培养液组，因为条件培养基中含有心肌细胞培养过程中释放的生长因子、细胞因子等物质，代表了心肌细胞微环境中的大量可溶性因素。将条件培养基作用于MSCs,在体外模拟可溶性因素对于MSCs的诱导作用，将此因素从心肌细 胞微环境中分离，并独立控制。但研究显示诱导后心肌细胞无论早期蛋白，还是基因表达均很低，明显低于5aza组。SalB诱导MSCs的心肌分化率较低。本研究表明联合组可以提高心肌分化率，其中的原因可能是SalB能够减小5aza本身由于甲基化作用所带来的负面影响，提高了5aza诱导其向心肌分化的能力，具体的机制仍需要进一步的实验。【参考文献】1WhitelawML,MeGuineJ.Heatshockprotein90regulatesdioxinreceptorfunctioninvivo(J〕.ProcNatlAcadSciUSA,1995；92(10):4437.2WakitaniS,SanitoT,CaplanAl.Myogeniccellsderivedfromratbonemarrowmesenchymalstemcellsexposedto5azacytidine(J〕・MuscleNerve,1995；18:417.3范英昌，赵桂峰,张文治.SalB对大鼠心肌梗塞过程中病理形态学的影响(J)•天津中医学院学报，2004；23(1):12.4高羽亭，范洪学•骨髓间充质干细胞的研究进展口〕•国外医学•老年医学分册,2006；27(3):10912.5李焕萍，刘春蓉，张永亮•骨髓间充质干细胞在医学 领域中的研究与应用(J〕•中国组织工程研究与临床康复,2007；11(28):56225.6郭茂娟，范英昌，徐秀梅，等.5氮胞昔诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化(J).中国组织工程研究与临床康复，2007；11(46):963841.7PanteghiniM・Presentissuesinthedeterminationoftroponinsandothermarkersofcardiacdamage〔J〕.ClinBiochem,2000；33(3):1616.8MoscosoI,CentrnoA,LopezE,etal.Differentiationinvitroofprimaryandimmortalizedporcinemesenchymalstemcellsintocardiomyocytesforcelltransplantation〔J〕・TransplantProc,2005；37(l)：4812.9UeyamaT,KasaharaH,IshiwataT.MyocardinexpressionisregulatedbyNkx2.5,anditsfunctionisrequiredforcardiomyogenesis(J)・MolCellBiol,2003；24(23)：922232. 9VenturaC,MaioliM.0pioidpeptidegeneexpressionprimescardiogensisinembryonalpluripotentpluripotentstemcells〔J)・CircRes,2000；87(3):18994.10NemerG,NemerM.Regulationofheartdevelopmentandfunctionthroughcombinatorialinteractionsoftranscriptionfactors(J)・AnnMed,2001；33(9)：60410.