搅拌式生物反应器换液培养脐血造血细胞的研究

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1、搅拌式生物反应器换液培养脐血造血细胞的研究作者：迟占有，姜华，谭文松，戴干策，赵春华【摘要】为进一步提高脐血造血细胞的扩增倍数并达到临床规模，本研究中利用自主开发的有溶氧和pH控制的搅拌式生物反应器进行了脐血造血细胞的换液培养。结果表明，培养中总细胞、CD34+细胞、各系集落形成细胞(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，CFU-Mk)的扩增倍数均高于方瓶培养，而且由于控制了较低的溶氧，所培养细胞中干/祖细胞含量显著高于方瓶培养。该反应器中培养的脐血造血细胞达到了临床应用的规模。结论：反应器中培养环境更有利于

2、干/祖细胞的维持和扩增，而且可达到成人造血干细胞移植所需细胞量。【关键词】脐血　　ExvivoCultureofUmbilicalCordBloodHematopoieticCellsinStirredTankBioreactorultipleofcordblood(CB)hematopoieticcellsandtoreachascaleforclinicalapplication，themononuclearcellsfromCBouslydevelopedstirredtankbioreactorultip

3、leoftotalcells，CD34+cells，andprogenitorscells(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，andCFU-Mk)inbioreactorizedDO.Clinical-scalecultureonesampleofCBinthisbioreactor.TheseresultssuggestedthatthecultureenvironmentinbioreactoralDOandpHcontrollingismorefavorableforstem/progenitorc

4、ellmaintenanceandexpansion，andtheexpandedcellsfromonesampleofCBisenoughtotransplantforanadultpatient.　　Keyatopoieticcell；bioreactor；stirredculture脐血细胞中富含造血干细胞，从而成为除骨髓和外周血之外一个重要造血干细胞来源，在临床上有着广泛应用，但脐血中造血干细胞的绝对数量少，无法满足成人的移植要求，而通过体外培养和扩增有望克服这一矛盾。体外扩增骨髓细胞、外周血细胞、脐血

5、细胞的临床实验都已有所报道［1，2］，证明了体外扩增后细胞用于临床的安全性和可行性。目前开发的体外扩增造血干细胞的培养系统主要有平板灌注腔反应器、固定床和流化床反应器、搅拌式反应器等［3］。其中搅拌式生物反应器能提供均一的培养环境，而且取样和数据采集简单，易于实现自动控制，因此，在造血细胞临床规模培养中有较好的应用前景［3，4］。本研究应用自主开发的搅拌式生物反应器系统，进行脐血造血细胞的换液培养研究。材料和方法　　脐血(CB)和单个核细胞(MNC)的分离　　脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求是身体健康、

6、发育良好的非高龄产妇。脐血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养液洗涤2次。　　培养基和细胞因子　　体外培养液用IMDM（Gibco公司），使用时添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF（50ng/ml）、IL-3（5ng/ml）、IL-6（20ng/ml）、G-CSF（2.0ng/ml）和GM-CSF（2.0ng/ml），其中SCF、IL-6购于北京宝赛生物技术公司，IL-3购于Pepro-Tech公司，G-CSF购于上海三维制药厂，GM-CSF购于上海海济生物技术有限

7、公司。　　造血细胞的反应器换液培养　　将分离得到的脐血单个核细胞以2×106cells/ml的密度在T-175方瓶中培养4天后，再接种到反应器中或T-25型方瓶（Nunc公司）中进行培养，进行的2次实验中接种密度均为0.8×106cells/ml。反应器为自主开发产品，其中反应器中所用材料经过造血细胞的生物相容性检验，反应器工作体积为300-500ml，搅拌系统为磁力搅拌，转速控制为30r/min。反应器的温度控制为37℃，溶氧和pH通过调节空气、氮气、氧气和二氧化碳的流量来控制，通气方式为表面通气。pH控制在7

8、.15，溶氧控制为饱和溶解空气的25％。细胞接种到反应器后，待细胞密度生长至2.0×106cells/ml后进行换液，即取出50％的细胞液，并加入相同体积含有相同细胞因子的新鲜培养液。实验中以T-25方瓶作对照，每瓶装液7ml，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中进行细胞培养，方瓶与反应器中换液比例和频率相同。　　细胞计数及活性分析　　台盼蓝染色后利用血球计数器进行