茅苍术多糖的分离纯化及组成分析

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1、茅苍术多糖的分离纯化及组成分析作者：段国峰，欧阳臻，余伯阳【摘要】目的对茅苍术多糖的提取、分离纯化和单糖的组成进行了分析。方法茅苍术经热水提取乙醇沉淀得多糖粗品(APan，Glu，Gal组成，其摩尔比为0.16：0.17：0.24：0.55：0.89：1.00；APan，Gal组成，其摩尔比为0.82：1.00：0.32；APan，Gal组成，其摩尔比分别为0.24：1.00：0.48：0.53及0.22：0.34：1.00：0.58；为茅苍术多糖的进一步研究提供了基础。【关键词】茅苍术；多糖；分子量；组分　　Abstract：Objective

2、TopurifyandanalysethepolysaccharidesfromrhizomesofAtractylodeslanceaDC.MethodsThecrudepolysaccharides(APolecularan公司）、SephadexG-100、分子量标准品葡聚糖Dextran系列、单糖标准品（Sigma公司），其他化学试剂均为国产分析纯。　　1.2仪器　　JASCOLC1500高效液相色谱系统，日本分光公司；TSK-G4000Pl蒸馏水，90℃提取4次，合并提取液，减压浓缩至一定体积。冰浴条件下加三氯乙酸脱蛋白，离心除去变性蛋

3、白，上清液迅速用NaOH中和至pH=7.0，浓缩至适量，透析除去小分子杂质，再减压浓缩，加4倍体积的95%乙醇，4℃放置过夜，离心收集沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥干乙醚后，复溶于水，冷冻干燥。即得水提粗多糖AP×2.6cm）析层析，依次用0.00～2.00mol/L的NaCl溶液洗脱，分别收集洗脱液（每管10ml），以改良的苯酚硫酸法［7］跟踪检测，根据洗脱曲线收集。取0.02～0.20mol/L的NaCl溶液洗脱部分，蒸馏水透析3d，冷冻干燥，再经SephadexG-100柱层析（60cm×1.0cm）层析，0.1mol/LN

4、aCl洗脱，以改良的苯酚硫酸法跟踪测定，根据洗脱曲线收集，并经HPLC凝胶柱检测，得到较为纯化的茅苍术多糖APol/L醋酸钠，流速为0.5ml/min。　　2.3.1标准曲线的制作分别称取平均分子量为2000,500,70,40,10kDal的Dextran系列标准葡聚糖5.0mg，用1ml流动相溶解，0.45μm滤膜过滤后,吸取20μl注入高效液相色谱中，以分子量的对数为纵坐标,以各糖的保留时间为横坐标,绘制标准曲线。　　2.3.2样品分子量测定取纯化后的样品各5mg与1ml流动相溶解，按与Dextran标准品相同的色谱条件操作，求得各自相应

5、的保留时间，按标准曲线计算分子量。　　2.4茅苍术多糖组成单糖的组分分析　　2.4.1红外色谱分析分别称多糖各1mg干燥样品，与KBr研磨混合后压片，采用Avatar360红外光谱仪扫描分析，波长范围为4000～400cm-1，尤其观察800～900cm-1的吸收峰。　　2.4.2多糖的水解取APg干燥样品，加入2.0mol/L的H2SO4溶液0.5ml，封管，100℃水解12h，取出，加入BaCO3中和，3000r/min离心除去BaSO4沉淀，上清液冷冻干燥，供分析用。　　2.4.3薄层色谱分析分别称取Ｌ鼠李糖、Ｄ阿拉伯糖、Ｄ甘露糖、Ｄ

6、葡萄糖、Ｄ半乳糖和D木糖各15mg，分别定容于10ml容量瓶中，得各单糖标准品溶液。另取各单糖标准品溶液1ml等量混合，得单糖标准品混合溶液。取单糖标准品溶液和混合单糖标准品溶液，分别点于含0.3mol/L的磷酸二氢钠的硅胶G板上，以丙酮∶水=24∶1及正丁醇∶醋酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水∶吡啶=7∶20∶12∶7∶6∶7进行二次展开，取出，晾干后，喷苯胺-邻苯二甲酸显色,计算Rf值。样品APg，加入盐酸羟胺10mg，内标肌醇7mg和吡啶0.5ml，于90℃水浴加热30min并振荡，取出冷却至室温，加入醋酸酐0.5ml，在90℃继续加热30m

7、in进行乙酰化，产物浓缩至干，加入0.5ml氯仿溶解，溶液经0.45μm滤膜过滤后，注入气相色谱仪进行分析。色谱条件：DB-530000mm×0.53mm弹性石英毛细管色谱柱；载气：高纯氮气；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；程序升温：100℃（5℃/min）→190℃，190℃（4℃/min）→240℃（5min）；汽化温度280℃；检测器260℃。　　3结果　　3.1茅苍术多糖的提取纯化茅苍术粉末经脱脂、水提、脱蛋白、醇沉，冷冻干燥后得到APin，代入回归方程得平均分子量分别约为：5.3×103，5.4×104，7.0×105，2.0×1

8、06。　　3.3茅苍术多糖APan，Glu，Gal组成，APan，Gal组成；APan，Gal组成。　　3.3.3气相色谱分析结果标准单