游离亚油酸对胰腺腺泡细胞的影响及其机制的探讨

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1、游离亚油酸对胰腺腺泡细胞的影响及其机制的探讨作者：王亚军孙家邦李非孙海晨　【摘要】目的探讨游离亚油酸对胰腺腺泡细胞的影响及其可能的机制。方法分离胰腺腺泡细胞，分别与0.1、0.5、1.0mmol/L亚油酸共同孵育30、60、90min，测定细胞的LDH释放率，DNA片段梯度分析腺泡细胞凋亡，流式细胞仪测定细胞凋亡率，ethodsPancreaticacinarcellsfromadultratsmol/L,0.5mmol/Land1.0mmol/Lfor30,60and90minutesrespectivelytomeasuretheLDHreleaserateofaci

2、narcells.DNAladderanalysisetrytodetermineapoptosisrate,)toobserveintracellularcalciumchanges.ResultsAfterincubationaged,eanddosedependentfashionedbyagarosegelelectrophoresismol/Llinoleicacid,asprovedapoptosisofacinarcells.Also,acinarcellapoptosisrateandPKCmembranetranslocationleveleand

3、dosedependentfashion.Inaddition,intracellularcalciumexistedatadosedependentfashionagingacinarcellisdependentlyrelatedtodoseandtime.FreefattyacidstimulatingincreaseofintracellularcalciumandactivationofPKCinducingapoptosisisoneofpathogeicmechanismsofhyperlipaemicpancreatitis.【Key高脂血症是继胆石和

4、酒精之后急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)的又一常见病因。目前还没有可以用来研究高脂血症诱导AP理想的动物模型，高脂血症引起AP的机制仍不清楚。高脂血症的胰腺毒性主要源于甘油三酯(Triglyceride,TG)分解产物游离脂肪酸(Freefattyacid,FFA)的毒性。近年来，已有FFA通过激活细胞内蛋白激酶C(ProteinkinaseC,PKC)调控胰岛素的分泌或诱导胰腺内分泌细胞凋亡造成2型糖尿病的报道［1］。亚油酸是TG中常见不饱和FFA，因此，探讨亚油酸对胰腺腺泡细胞损伤的可能机制，对AP的诊治有着重要的意义。1材料与方法1.1动物及主

5、要试剂雄性SD大鼠(200～250g)购自军事医学科学院实验动物中心；大豆蛋白酶抑制剂、胶原酶Ⅺ、透明质酸酶Ⅱ、亚油酸、PKC抗体等均为美国Sigma公司产品；Fluo3/AM购自美国BioRad公司。1.2方法与步骤1.2.1胰腺腺泡细胞的分离和分组参照2.2LDH释放率用不同浓度亚油酸作用胰腺腺泡细胞后台盼蓝染色观察，部分腺泡细胞出现蓝染，证明存在细胞损伤。LDH的释放率可以反映腺泡细胞损伤的严重程度，LDH的释放率与亚油酸剂量和作用时间呈依赖关系。见图1。图1亚油酸诱导腺泡细胞损伤呈时间剂量依赖效应，LDH反映细胞损伤的程度a：P<0.001，b：P<

6、;0.05，与对照组比较2.3腺泡细胞DNA片段化为了证实亚油酸对胰腺细胞的毒性，是否为通过诱导细胞凋亡而引起的，进一步行琼脂糖凝胶电泳DNAladder的检测。DNAladder检测结果，1.0mmol/L亚油酸作用60min出现清晰的DNA梯状条带，从而证明了随着亚油酸浓度的增高可以诱导细胞凋亡。见图2。图2亚油酸诱导胰腺腺泡细胞凋亡出现DNA梯状条带1：对照组；2：FFA0.1mmol/L；3：FFA0.5mmol/L；4：FFA1.0mmol/L2.4亚油酸对腺泡细胞凋亡的影响为了证实亚油酸的胰腺腺泡细胞毒性与诱导细胞凋亡的关系，用碘化丙碇对细胞DNA进行染色，流

7、式细胞仪检测。实验结果表明腺泡细胞的凋亡率与亚油酸呈剂量和作用时间依赖关系。见图3。图3PI染色流式细胞仪检测亚油酸诱导的细胞凋亡2.5亚油酸对腺泡细胞内钙离子［Ca2+］i的影响研究表明，细胞钙超负荷是细胞损害的一条共同途径，细胞钙超负荷与AP形态学损害有关［3］。细胞经Fluo3/AM负载，亚油酸刺激细胞，［Ca2+］i曲线上升的幅度随亚油酸的浓度增大而增大，0.1、0.5和1.0mmol/L组［Ca2+］i平均上升(3.18±3.04)、(5.13±9.43)和(12.60±2.64)mmol/L。对照组给药前后［Ca