虎杖提取物白藜芦醇的抗白血病作用及其可能的分子机

《虎杖提取物白藜芦醇的抗白血病作用及其可能的分子机》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、虎杖提取物白藜芦醇的抗白血病作用及其可能的分子机【摘要】目的探讨白藜芦醇在体外对白血病细胞的抑制作用及其分子机制。方法MTT比色法测定细胞生长抑制率；流式细胞术、HE染色、激光共聚焦显微镜等方法观察各组白血病细胞的细胞周期与细胞凋亡情况；ethodsMTTcolorimetryeasurethetumorcellgroeasuredbyTT购自Sigma公司；RPMI1640、胎牛血清(FCS)购自Gibco公司；抗人(鼠)Bcl2抗体购自Labvision公司；抗鼠(人)pSTAT3多克隆抗体购自SantaCruz公司；AnnexinVFIT

2、C试剂盒购自晶美生物工程有限公司；小鼠淋巴细胞白血病细胞株(L1210)由西安交通大学生命科学与技术学院王一理老师惠赠；人皮肤T细胞淋巴瘤(HuT78)、人T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat,CloneE61)由西安交通大学医学院第一附属医院陈颖老师惠赠。　　1.2形态学观察37℃、5%(体积分数)CO2培养箱，含10%(体积分数)胎牛血清的完全1640细胞培养基培养细胞。传代时，800r/min离心5min，收集细胞悬液。按1∶3或1∶4分入新的培养瓶中，再加入适量1640完全培养基。锥虫蓝染色法活细胞计数>95%后，于NikonTMS

3、F倒置显微镜下观察各白血病细胞在白藜芦醇作用前后的形态、结构及数量的变化。　　1.3苏木素伊红(HE)染色0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25、50、100μmol/L白藜芦醇处理细胞12、24、48h后，涂片，HE染色观察白血病细胞的凋亡情况。　　1.4MTT比色法进行细胞增殖分析将细胞以完全RPMI1640培养基配成5000个/mL细胞悬液，按照文献[3]方法进行白血病细胞增殖分析，同时设小鼠成纤维细胞3T3作正常细胞对照。　　1.5流式细胞术分析细胞周期各组细胞培养24h，换含0.5%(体积分数)血清的RPMI1640培

4、养基同步化12h[4]，调细胞浓度为1×105个/mL细胞悬液。实验组加3mL含白藜芦醇的培养基，对照组加等体积培养基，5%(体积分数)CO2，37℃，培养6h。PI染色后在FACSCalibur型流式细胞仪上测定。　　1.6磷脂酰丝氨酸外翻分析调细胞浓度为1×105个/mL细胞悬液。实验组加含白藜芦醇的培养基，对照组加等体积培养基，5%(体积分数)CO2，37℃，分别培养12、24、48h。FITC标记的AnnexinV和PI染色后立即用激光共聚焦显微镜和FACScan流式细胞仪检测。　　1.7g/L。SDSPAGE电泳，半干法转膜1.5-2h

5、。加入Bcl2单抗(TBST1∶200稀释)，HRP标记的二抗(TBST1∶5000稀释)，ECL法检测，图片扫描并且定量分析。以βactin作内标参考。　　1.8SP法检测HuT78、Jurkat、L1210细胞pSTAT3的表达实验步骤依据试剂盒说明。其中pSTAT3抗体为1∶100稀释，DAB显色、苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。阴性对照以0.01mol/LPBS代替一抗。在排除非特异性染色的情况下，以胞膜或胞质出现棕黄色连续或灶性颗粒性状分布为阳性表达。按照胞质和胞膜有无棕黄色染色及染色程度分为：(-)无阳性或

6、阳性细胞<10%；(+)阳性细胞10-40%；()40-70%；()阳性细胞>70%。　　1.9统计学处理所有数据均用SPSS13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(oneol/L白藜芦醇分别作用HuT78、Jurkat、L1210细胞12、24、48h，细胞形态发生较大改变，呈一定的时间、剂量依赖性。药物处理后，可见细胞数量减少、部分胞体缩小、胞膜皱缩、胞间隙增大、胞质中出现大小不等的不规则空泡(图1)。　　2.2细胞凋亡情况经HE染色后，光镜下观察其形态。对照组细胞体积较大，细胞呈圆形，透光性好，核大而明显，核

7、仁清楚，胞浆少，核质比高。经白藜芦醇处理后，白血病细胞数量减少，细胞皱缩，核直径减小，核仁减少或消失，核染色质浓集呈紫蓝色致密的球状或呈圆形分布于核膜下，胞浆皱缩、嗜碱性增加(图2)。　　2.3白藜芦醇对白血病细胞的生长抑制作用白藜芦醇作用不同时间后，3种白血病细胞HuT78、Jurkat和L1210均受到不同程度的生长抑制，且呈一定的时间－剂量依赖性(图3A-图3C)。同等条件下，白藜芦醇对L1210细胞的抑制作用最强，生长抑制率最高可达66.17%；对HuT78及Jurkat细胞的生长抑制率最高分别为62.24%、45.98%。虽然白藜芦醇对

8、这3种白血病细胞具有明显的抑制作用，但是并不影响正常细胞的生长(图3D)。经统计分析，各白血病细胞与正常3T