抗菌肽cecropinb对鸡生长发育及免疫功能的影响

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　　抗菌肽CecropinB对鸡生长发育及免疫功能的影响：王秀青，朱明星张爱君，丁淑琴，杨风琴【摘要】目的探讨基因工程重组抗菌肽CecropinB对鸡生长发育及免疫功能的影响。方法250羽健康雏鸡随机分成5组，每组50羽，设盐酸环丙沙星药物对照组，抗菌肽CecropinB低、中、高剂量组(分别为2、4、6mL·L-1)及正常对照组，均以混饮水的方式饲喂，检测各组鸡体重;各组分别随机抽取5羽鸡，称重后经静脉放血将鸡处死，将每只鸡的胸腺、脾脏和法氏囊完整地取下称重，计算脾脏指数、法氏囊指数、胸腺指数，取鸡腹腔巨噬细胞检测吞噬指数和吞噬率。结果抗菌肽低、中、高剂量组鸡的平均日增重与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，抗菌肽中、高剂量组鸡的平均日增重较药物对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);在21、28日龄时中、高剂量组鸡的胸腺、脾脏和法氏囊指数提高(P<0.05或P<0.01)，而35日龄以后各组间各免疫器官指数差异均无统计学意义;高、中、低剂量组鸡腹腔巨噬细胞的吞噬率与吞噬指数均高于药物对照组和空白对照组(P<0.05)。结论 基因工程抗菌肽CecropinB可以增加雏鸡的平均日增重以及雏鸡发育早期的免疫器官重量，增强鸡的腹腔巨噬细胞吞噬功能。【关键词】抗菌肽;健康蛋雏鸡;免疫器官;盐酸环丙沙星“无毒、无残留、无耐药性”是新一代抗菌制剂的发展趋势和要求。具有高效抗菌活性、且有利于人体健康的抗菌肽成为近年该领域的研究热点之一。研究发现[1]抗菌肽不仅可直接杀灭侵入体内的病原微生物，还在宿主固有免疫应答的不同阶段表现出多种有益的作用。本文拟在证实基因工程抗菌肽CecropinB体外抑菌作用的基础上[2]，研究其对鸡体重、腹腔巨噬细胞的吞噬功能以及免疫器官增重的影响，为CecropinB的应用提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1实验动物1日龄来杭蛋雏鸡，由江苏省家禽所提供;试验在江苏省农业科学院兽医研究所进行;雏鸡饲喂所用的全价料，购于南京市青龙山养殖厂。前期雏鸡以浅盘喂料、饮水器饮水;后期均自由采食与饮水。光照时间1～3日龄为23h，从4日龄起，每天减少2h，直至8h光照为止;鸡舍温度1～3日龄为30～33℃，4～7日龄为28～30℃，以后每周降低2℃，降至18～20℃为止，以后鸡舍内温度保持在18～20℃。其预防接种均按常规免疫程序进行[3]。　　1.2实验分组及药物 试验从7日龄起，至49日龄结束，实验期共计6周。选择体重基本一致的雏鸡250只，随机分成5组，即低、中、高抗菌肽CecropinB剂量组，药物对照组，空白对照组，每组50只。低、中、高抗菌肽组(用量分别为2、4、6mL·L-1)，从第2周龄开始抗菌肽饮水，饮1周停喂1周，直到49日龄。该批次基因工程抗菌肽CecropinB(冻干粉)的表达量大约为0.05mg·mL-1，MIC为0.54μM[2]。药物对照组采用2%盐酸环丙沙星可溶性粉，石家庄瑞田生化有限公司产品，2.5g·L-1混饮。实验组和对照组每只鸡均分别在7、14、21、28、35、42、49日龄称体重，计算各组每周的平均体重。　　1.3实验方法(1)在7、14、21、28、35、42、49日龄，各组分别随机抽取5羽鸡，称重，取其平均值并记录实验数据。(2)在21、28、35、42、49日龄，各组分别随机抽取5羽鸡，称重后经静脉放血将鸡处死，将每只鸡的胸腺、脾脏和法氏囊完整地取下称重，按照下述公式计算每只鸡的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数[4]。胸腺指数=胸腺重量(mg)/鸡体重(g)，脾脏指数=脾脏重量(mg)/鸡体重(g)，法氏囊指数=法氏囊重量(mg)/鸡体重(g)。(3)每组各取49日龄鸡5只，检测前1d每只鸡腹腔注射质量分数为0.5%的淀粉生理盐水溶液1.0mL，检测时每只鸡腹腔注射体积分数为5%的鸡红细胞悬液1.0mL;30 min后颈静脉放血致死鸡，拔掉腹部羽毛，从腹部正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注射生理盐水3.0mL，轻揉腹部，然后吸出腹腔洗液1.0mL，平均滴于2片载玻片上，37℃孵育30min，PBS漂洗，晾干，丙酮-甲醛(1∶1)固定，姬姆萨染色，每片油镜下计数200个巨噬细胞，按下列公式计算巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数[5]。吞噬率=已吞噬红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100%，吞噬指数=已吞噬的红细胞数/200个巨噬细胞。　　1.4统计学方法应用SPSS10.0统计软件建立数据库，各指标数值以(±s)表示，各指标比较采用F检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。　　2结果　　2.1抗菌肽CecropinB对鸡体重的影响见表1。　　抗菌肽低、中、高剂量组鸡的平均日增重与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，抗菌肽中、高剂量组鸡的平均日增重较药物对照组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，说明抗菌肽CecropinB低、中、高剂量组均对雏鸡有明显的促生长作用。其它组别之间差异无统计学意义。表1抗菌肽CecropinB对鸡体重的影响　　2.2各组间鸡脾脏指数、法氏囊指数、胸腺指数比较见表2～4。表2不同日龄鸡脾脏指数分析结果表3不同日龄鸡法氏囊指数分析结果表4 不同日龄鸡胸腺指数分析结果(n=5)从表2～4中可以看出，在21、28日龄时中、高剂量抗菌肽饲喂组的法氏囊指数、胸腺指数及脾脏指数与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与抗生素对照组差异有统计学意义(P<0.05);其它日龄及组别之间差异无统计学意义。　　2.3CecropinB对鸡腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响见表5。　　CecropinB高、中、低剂量组的吞噬率与吞噬指数均高于药物对照组和空白对照组(P<0.05)。表5抗菌肽CecropinB49日龄对鸡腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响　　免疫增强剂一般可使免疫器官增重，而免疫抑制剂可使之减重。免疫药理学 试验常以药物对免疫器官的增重作为衡量其免疫功能强弱的指标之一[7]。免疫器官指数可反映机体免疫器官的重量变化，且能将个体差异的影响降低到最低限度。本试验结果表明，高剂量饲喂重组基因工程抗菌肽CecropinB，在21、28日龄时中、高剂量组鸡的胸腺、脾脏和法氏囊指数提高(P<0.05)，而35日龄以后各组间各免疫器官指数差异均无统计学意义。分析原因可能由于35日龄之后雏鸡进入了快速生长期，其体重增长速度加快，而脾脏、法氏囊和胸腺的发育已经到了成熟期，所以其免疫器官指数差异无统计学意义;同时也提示重组抗菌肽CecropinB对35日龄之前鸡免疫器官的发育会产生影响。　　本实验证实CecropinB能增强雏鸡腹腔巨噬细胞的吞噬能力，以高剂量组效果最佳。巨噬细胞被称为多功能细胞，其强大的吞噬，以及抗原提呈、免疫调节等功能，在非特异性和特异性免疫中均发挥重要作用，因此，CecropinB增强雏鸡巨噬细胞吞噬功能的作用，提示CecropinB的体内抑菌作用除了直接效应外，可能还与增强机体免疫功能有关。【参考文献】1]BomanHG.Peptidesantibioticsandtheirroleininnateimmunity[J].AnnuRevImmunol，1995，13：61-92.　　[2]王秀青，张素芳，曹瑞兵，等.抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达[J].南京农业大学学报，2007，30(3)：120-123.　　[3]黄永彤，黄自然.抗菌肽与抗生素饲喂肉鸡的效果比较[J].广东饲料，2004，13(2)：24-25. 　　[4]甘肃农业大学.兽医微生物学实验指导[M].北京：农业出版社，1979：30.　　[5]张丽，梁中琴，顾振纶，等.蘑菇多糖对小鼠腹腔巨噬细胞作用的体外研究[J].苏州大学学报(医学版)，2003，23(1)：10-12.　　[6]FehlbaumP，BuletP，MichautL，etal.Insectimmunity：septicinjuryofDrosophilainducethesynthesisofapotentantifungalpeptidesologytopalntantifungalpeptides[J].JournalofBiologicalChemistry，2004，269：33159-33163.　　[7]马卫明，余锐萍，彭芳珍，等.猪小肠抗菌肽的提取及部分生物活性研究[J].科学技术与工程，2004，4(3)：202-205.　　[8]皮灿辉，彭永鹤，李永新，等.抗菌肽制剂对母猪死胎率和仔猪成活率的影响[J].中国畜牧兽医，2008，35(6)：90-91.