姜黄素对骨髓瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制讨论

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1、姜黄素对骨髓瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制讨论多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一种起源于B淋巴细胞系并能够产生单克隆免疫球蛋白(M蛋白)的恶性增生性疾病，中老年人易患，是血液系统第二大常见恶性肿瘤。MM的发病是一个极其复杂的病理生理过程，其中遗传学异常、骨髓微环境、细胞因子X络，在MM的发病机制中起着重要作用。　　姜黄素(curcumin)是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的酚类色素。近年被证实其主要药理作用是通过调控特定的靶基因如生长因子、转录因子等发挥抗炎、抗肿瘤、抗

2、动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒等作用。已有报道姜黄素能抑制人体多种肿瘤细胞的生长，包括小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌等。不同的肿瘤细胞系涉及不同的机制。姜黄素对骨髓瘤细胞的作用主要集中在其抑制肿瘤细胞的生长、增殖及促进凋亡，但对其迁移侵袭能力并无相关研究。含IQ模序的RasGTP酶活化蛋白1(IQmotif-containingGTPase-activatingprotein1，IQGAP1)是一个细胞骨架结合蛋白，通过接收和发射各种信号调节细胞迁移和细胞间黏附，促进细胞的迁移。我们的前

3、期工作已证实IQGAP1在骨髓瘤细胞中表达增高。IQGAP1是否在骨髓瘤细胞的迁移和侵袭中起到重要作用?姜黄素是否能对IQGAP1在骨髓瘤细胞的迁移和侵袭中发挥的作用有抑制或阻断?本研究期望为MM的临床治疗提供新思路及实验依据。　　材料和方法　　1主要药品和试剂　　姜黄素(Sigma)用二甲基亚砜配成8mmol/L储存液，使用前用无菌PBS稀释至工作浓度。RPMI-1640培养液为Gibco产品，胎牛血清(fetalcalfserum，FCS)购自杭州四季青生物公司，其它生化试剂均为进口分装或国

4、产分析纯。Matrigel胶购自BectonDickinson。Costar3422Transes;109/L密度接种于6孔板内。姜黄素0、20、30及40μmol/L作用RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞24h，行2.3.3步骤实验。　　2.3.3抽提蛋白，电泳，转膜，经5%脱脂奶粉封闭后，与1∶500稀释度的抗IQGAP1抗体和适宜稀释度的Ⅱ抗(羊抗鼠Ig-HRP)孵育，经Odyssey显色系统显色，收集蛋白印迹图

5、。　　2.4迁移能力的测定　　2.4.1取对数生长期细胞，按1109/L密度接种于6孔板内。细胞分为姜黄素0μmol/L组、20μmol/L组、30μmol/L组和40μmol/L组，亚组分3组:RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，每组设3个复孔。培养箱中培养24h后行2.4.2步骤迁移实验。　　2.4.2将0.8μm孔径的Transu;LRPMI-1640培养液，37℃放置1h。收集各组细胞，用无

6、血清培养液洗涤和重悬各组细胞，并将细胞浓度调整至1109/L。小心弃除Transu;L各组细胞悬液至小室上腔。通过间隙加入600μL含10%FBS的RPMI-1640培养液至下腔，避免产生汽泡，培养箱培养48h后将Transu;L细胞悬液。吸取少量悬液充满计数板池，在显微镜下计数细胞。　　2.5Matrigel侵袭实验　　2.5.1取对数生长期细胞，按1109/L密度接种于6孔板内。细胞分为姜黄素0μmol/L组、20μmol/L组、30μmol/L组和40μmol

7、/L组，亚组分3组:RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，每组设3个复孔。培养箱中培养24h后行2.5.2步骤Matrigel侵袭实验。　　2.5.2将-20℃保存的Matrigel，在冰上4℃过夜融化，在冰上用预冷的枪头吸取100μLMatrigel加入冰预冷的300μL无血清培养液中，充分混匀。取上述稀释的Matrigel50μL加入Transin，使Matrigel聚合成胶。细胞接种密度为2108/L。接种

8、方法、观测时间及细胞收集、计数方法同迁移实验。　　2.6RT-PCR法检测　　姜黄素作用后IQGAP1mRNA的表达取对数生长期细胞，按1109/L密度接种于6孔板内。姜黄素0或40μmol/L作用于RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞24h，采用RNeasyMini试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。参照OneStepRT-PCR试剂盒实验操作说明进行RT-PCR。　　3统计学