抗禽流感病毒m2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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　　抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定【摘要】目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法:利用纯化的融合蛋白GSTM2免疫BALB/c小鼠,然后以GSTM2和GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GSTM2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIVM2mAb的杂交瘤细胞株。mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验（AGP）测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3和5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1∶4。抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2F8和5G6为IgG2b。抗原捕获ELISA表明,2F8mAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒（NDV）和鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）反应。IFA和免疫组化试验表明,2F8mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合。结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂。【关键词】禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体 禽流感病毒的基因组由8个单股RNA片段组成,这种多节段性的特点决定了基因组除本身易发生基因突变、小片段基因重组外,还特别易与禽流感病毒、猪流感病毒或人流感病毒等进行完整片段的基因重排,因而禽流感病毒亚型众多,变异性极强[1,2]。自1878年意大利首次报道禽流感发生以来,禽流感相继在世界各地暴发,而且不断出现新的亚型和变异株,以致于1997年香港及2004年南亚地区发生了感染人的事件[3,4]。我国自1993年在鸡、鸭、鹅、鸽、珍禽中分离到禽流感病毒以来,鸡群中已存在H9、H5、H7及H14等多个血清亚型,给我国养禽业构成极大威胁。因此加强禽流感疫情监测工作特别重要,尤其是定期、持续、监测和及时、准确的预测预报,只有如此,才能将禽流感尤其是高致病力禽流感消灭在萌芽状态。2002年,秦爱建等报道,利用杂交瘤技术获得了抗AIV的H5和H9亚型血凝素特异性的单克隆抗体(mAb)[5],并建立了诊断高致病性毒株H5和低致病性H9亚型病毒的方法,使检测结果更加准确可靠。尽管如此,只能对在一定时期内发生特定亚型（如H9或H5）禽流感病毒感染时具有鉴定作用,无法对可能发生的新变种的禽流感病毒感染做出诊断。因此研究一种可广泛检测禽流感病毒的方法,对提高人们在疫情预测预报方面的能力很有帮助。 M2蛋白是禽流感病毒中高度保守的蛋白,它在禽流感病毒各亚型的不同毒株之间都具有很高的同源性,因此可用于所有禽流感的诊断中[6,7]。本研究中,我们利用获得的高度纯化的融合蛋白GSTM2作为免疫原免疫BALB/c小鼠,然后运用杂交瘤技术,来研制抗禽流感病毒M2蛋白mAb,以期为建立快速准确诊断禽流感病毒感染的方法奠定基础,进而为该病的大流行预警预报提供技术保证,也为及时扑灭和防止疫情的扩散提供科学依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　8周龄雌性BALB/c小鼠,由军事医学科学院实验动物中心提供;骨髓瘤细胞系Sp2/0由中国农业大学动物医学院传染病教研室提供。　　DMEM、HAT、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）均为Invitrogen公司产品;辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG、弗氏佐剂、HRP标记羊抗鸡IgG、PEG1450、FITC标记的羊抗小鼠IgG以及鼠源mAb亚类试剂盒均为Sigma公司产品;优级胎牛血清为Hyclone公司产品。禽流感病毒:AIVA/goose/Guangdong/96(H5N1)、AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)由国家流感中心提供。鸡传染性法氏囊病病毒BJ836株（IBDV）、鸡新城疫病毒（NDV）LaSota株,抗H9N2、H5N1的AIV, 抗IBDV、NDV的SPF鸡血清及阴性血清由本研究所保存。　　1.2方法　　1.2.1抗原的制备　　利用本研究所构建原核表达载体pGEXM2（M2基因于AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)）以及pGEX5X1在大肠杆菌中BL21诱导表达,获得的可溶性产物用GlutathineSepharose4B（AmershanPharmacia产品）进行亲和层析得到纯化的融合蛋白GSTM2及GST蛋白。融合蛋白GSTM2已被证实保留了天然AIVM2蛋白的免疫原性,可作为本研究的免疫原[8,9]。　　1.2.2动物免疫　　首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原,间隔3周后,采用弗氏不完全佐剂乳化抗原,背部皮下多点注射8周龄BALB/c小鼠,如此进行第3、4次免疫并用ELISA检测每只小鼠的抗体水平。第4次免疫间隔3周后进行加强免疫,每只小鼠腹腔注射不加佐剂的融合蛋白200μg。　　加强免疫后3d,选取抗体水平最高的小鼠处死,按常规方法进行细胞融合[10]。　　1.2.3间接ELISA方法建立以及阳性杂交瘤的筛选标准 　　分别以融合蛋白GSTM2和pGEX空载体菌体蛋白GST包被酶标板孔,进行平行反应。然后分别以1∶1000的免疫小鼠阳性和阴性血清作为一抗,酶标羊抗小鼠IgG的工作浓度为1∶5000（10mmol/LpH7.2稀释）进行抗原抗体反应通过方阵滴定确定抗原最适包被浓度。酶联免疫检测仪测定A490值,以≥2.1且最接近的P/N值的M2融合蛋白抗原和GST的稀释度来作为以后检测时的抗原包被浓度。检测时,平行设置GSTM2和GST蛋白包被的酶标板孔,吸取杂交瘤细胞上清2份,相对应地分别加到上述2个板孔中,阳性对照为1∶1000的免疫鼠血清,阴性对照为正常小鼠血清。阳性杂交瘤判定标准:细胞上清的A490值在GSTM2包被的板孔中大于阳性血清的A490值,而在GST包被的酶标板孔中则小于阴性血清A490值,同时符合上述2个条件的细胞,确定为可分泌抗M2mAb的杂交瘤细胞[11]。　　1.2.4细胞融合和克隆化　　按常规方法,处死免疫鼠,采集血清备用。取小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞（Sp2/0）进行细胞融合。融合剂为500g/L的PEG1450,取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞,HAT营养液（DMEM完全培养液中加入10mL/L的100×HAT及200mL/L的胎牛血清）为融合用选择培养液,融合后分装于96孔板中,置于37℃、50 mL/LCO2培养箱中培养。5d后更换新鲜HAT营养液,继续培养至第8天进行第1次检测筛选,以后改换HT（DMEM完全培养基中加入20mL/L50×HT）培养液,经常观察,当杂交瘤细胞长至孔面积的1/4左右时,开始筛选、检测。将M2融合蛋白抗原检测阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞按有限稀释法进行3次克隆,挑选反应性较强的克隆化细胞移至24孔板扩大培养,作为建株细胞。　　1.2.5小鼠腹水的制备　　取500μL高压灭菌过的液体石腊注射于BALB/c小鼠的腹腔内,14d后腹腔注射约1×106个杂交瘤细胞,密切观察动物的健康状况与腹水征象,接种细胞7～10d后产生腹水,待腹水尽可能多,而小鼠濒于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水收集到离心管中,10000r/min离心10min。吸取上清冷冻保存。　　1.2.6mAb效价测定　　（1）ELISA效价:用抗原包被酶标板,腹水mAb及杂交瘤细胞上清1∶100稀释后进行2倍系列稀释,另设同样稀释度阴、阳性血清作为对照,按常规间接ELISA测其效价。（2）琼脂扩散效价:按双向双扩散试验进行:用8.5g/L生理盐水配置10g/L琼脂糖浇注平皿,按常规方法打孔,抗原稀释后加于中央孔,周围孔分别加2倍系列稀释的mAb腹水,置于湿盒中37℃过夜孵育,观察沉淀线。 　　1.2.7mAb的IgG亚类及轻链种类鉴定　　用Sigma公司鼠mAb亚类检测试剂盒进行鉴定,即以1∶1000倍稀释的羊抗鼠亚类二抗包被酶标板孔,对各杂交瘤细胞上清进行夹心ELISA测定。　　1.2.8mAb特异性的鉴定　　（1）2融合蛋白及GST为抗原,经120g/LSDSPAGE凝胶电泳后,转印至醋酸纤维膜上,然后以1∶1000稀释的mAb腹水作为一抗,1∶8000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行免疫检测。（2）抗原捕获ELISA:以包被液将杂交瘤细胞上清作1∶20稀释包被酶标板,每孔100μL,置37℃温箱2h后于4℃包被过夜,PBST洗涤3次后,50g/L的脱脂奶封闭2h,再洗涤3次后,以分别从1∶50开始作倍比稀释的AIV（H9N2）、AIV（H5N1）、NDV、IBDV作为抗原,每孔100μL,37℃作用1h后,洗涤3次,再以用封闭液1∶100稀释的各病毒相应血清作为一抗,1∶2000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG作为二抗进行ELISA,测定结合不同病毒的滴度,同时设无抗原对照。（3）间接免疫荧光:将AIVA/goose/Guangdong/96(H5N1)感染长成单层的MDCK细胞,待CPE出现“＋”时,用胰酶消化细胞,PBS重悬细胞,将细胞滴到带孔的玻片上,自然干燥并用冷丙酮固定,制备抗原片。将1∶10稀释的mAb腹水进行2倍系列稀释后, 依次加到抗原片上,37℃孵育30min,PBS洗涤3次,干燥后,加入FITC标记的羊抗小鼠IgG,37℃孵育30min,PBS洗涤3次后,荧光显微镜下观察。设未感染AIV的MDCK细胞制备的抗原片为阴性对照。（4）免疫组化:以禽流感病毒于负压隔离器中对SPF鸡进行攻毒,发病后立即宰杀,并取不同部位的组织进行固定,封蜡切片,再以2F8mAb作为一抗进行免疫反应并染色[12]。　　将4株mAb腹水和混合细胞上清进行倍比稀释,然后以P/N≥2.1稀释度的倒数为ELISA效价;mAb腹水与GSTM2融合蛋白抗原之间出现沉淀线最大稀释度的倒数来确定不同细胞株的琼脂扩散效价（AGP）,结果具有很高的ELISA效价和一定的AGP效价（表1）。表1M2mAb的ELISA和AGP效价（略）　　2.3mAb的Ig类及亚类的鉴定　　经夹心ELISA鉴定获得的mAb1E1和4E3为IgG2a,2F8和5G6为IgG2b。　　2.4mAb特异性的鉴定　　2.4.12融合蛋白及GST为抗原,经120g/LSDSPAGE凝胶电泳后,转印至醋酸纤维膜上后,mAb作为一抗进行2显示Mr35000的条带, 而GST则没有任何显示（图1）。　　2.4.2抗原捕获ELISA　　以2F8杂交瘤细胞上清包被的夹心ELISA对mAb捕获病毒检测结果表明,mAb捕获禽流感的效价分别为:H5N1=1∶2560,H9N2=1∶5120,而mAb和NDV、IBDV不发生反应,表明mAb对禽流感病毒的反应是特异的。　　2.4.3间接免疫荧光　　在荧光显微镜下可以观察到,AIV感染的MDCK细胞的表面发出绿色荧光,而细胞核被伊文氏兰染成暗红色,表明mAb腹水能结合AIV感染的细胞,而对未感染AIV的细胞无反应,整个细胞在伊文氏兰染料映衬下发出红色光（图2）。经测定2F8mAb腹水结合AIV的效价为1∶1000。　　2.4.4免疫组化　　对AIV（H5N1）感染的鸡脾脏组织切片进行过氧化物酶染色,结果M2mAb能够结合脾细胞质中的禽流感病毒,在DAB及苏木精的映染下,表现为黄褐色,而对未收到禽流感病毒感染的SPF鸡的脾细胞则不表现结合现象（图3）。　　3讨论M2蛋白是A型流感病毒的非糖基化多肽, 它不需要任何翻译后修饰就能成为病毒的抗原成分,因而在原核表达系统获得的重组蛋白具有天然蛋白相同的抗原性,其可作为免疫原制备针对流感病毒M2蛋白表位的mAb[13,14]。Liu等[15]用流感病毒M2膜外区（M2e）与GST的融合蛋白制备了M2e的特异性mAb,该mAb能使75%的经腹腔注射后的小鼠能够抵抗5LD50的流感病毒A/PR/8/34的攻击。在本研究中,我们制备了针对AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)的M2蛋白的mAb,其生物学特性表明,它既能结合H9亚型也能结合H5亚型的禽流感病毒。说明它不仅可以应用到禽流感的诊断中,而且也可能交叉保护方面起作用。为获得针对M2蛋白的mAb,我们克隆了AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)的M2基因,然后将缺失跨膜区的M2基因在大肠杆菌中获得可溶性表达并制备了高度纯化的GSTM2融合蛋白[8,9],然后以此为免疫原来制备mAb。在进行阳性克隆细胞株筛选时,必须去除针对GST等大肠杆菌成分产生的阳性抗体的干扰。为此,研究者特地设计了ELISA的A值相减法筛选。即将同一孔的细胞上清平行作2个抗原包被的ELISA,然后选择GSTM2融合蛋白抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆筛选,这样不仅完全筛除分泌抗GSTmAb的杂交瘤细胞,而且还 能有效地避免不完全纯化产生的假阳性克隆。2蛋白特异性的抗体,还具有M2线性表位,说明它将在未来禽流感病毒的M2基因各种表达科研鉴定工作中起作用。经过夹心ELISA捕获抗原试验和间接免疫荧光试验表明,我们制备的该M2mAb不仅对尿囊液中的AIV有特异性结合作用,而且还可结合AIV感染的MDCK细胞。在MDCK细胞的免疫荧光照片中可以看出,AIV表达的M2蛋白呈现在细胞膜的表面,这和以前有关M2的报道是一致的[16],说明我们制备的M2mAb可用于AIVM2蛋白细胞定位的研究。本研究中,我们制备的M2mAb2F8对感染细胞的AIV的结合有较好的敏感性,表明了它有希望应用到日后建立禽流感病原检测方法中。此mAb能够结合鸡脾脏细胞中的禽流感病毒的结果进一步表明,它将在禽流感病理学的诊断工作发挥重要作用。【参考文献】　　[1]TrampuzA,PrabhuRM,SmithTF,etal.Avianinfluenza:aneicthreat?[J].MayoClinProc,2004,79(4):523-530.　　[2]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版,北京:科学出版社,1997:731-735. 　　[3]BridgesCB,Limed,2004,350(12):1171-1172.　　[5]秦爱建,邵红霞,钱昆,等.抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制及应用[J].中国预防兽医学报,2003,25（3）:161-163.　　[6]SugrueRJ,HayAJ.StructuralcharacteristicsoftheM2proteinofinfluenzaAviruses:evidencethatitformsatetramericchannel[J].Virology,1991,180(2):617-624.　　[7]FraceAM,KlimovAI,RomunityagainstinfluenzaAvirus[J].Vaccine,1999,17(18):2237-2244.　　[8]李永清,杨敬,杨汉春.禽流感病毒M2基因在大肠杆菌中表达及其抗原性分析[J].畜牧兽医学报,2005,36（7）:739-744.　　[9]李永清,韦莉,杨汉春. 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