生存素启动子调控hsv1tk真核表达载体的构建

《生存素启动子调控hsv1tk真核表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、生存素启动子调控HSV1TK真核表达载体的构建【摘要】目的：构建生存素(survivin,SURV)启动子调控的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1TK)基因表达载体，检测该启动子的活性和特异性，观察该基因对大鼠体内肺癌生长的抑制功能。方法：酶切回收SURV启动子、CMV启动子;PCR扩增HSV1TK基因;将上述片段与含有报告基因荧光素酶基因(Luciferase，Luc)的载体pGL3Basic的多克隆位点连接，分别构建成为SURV、CMV启动子调控的HSV1TK、Luc真核表达载体(pSURVTK、pCMVTK，pS

2、URVLuc、pCMVLuc)，用脂质体法将表达载体转染A549细胞系，蛋白质印迹法检测TK基因的表达，更昔洛韦细胞毒实验观察TK蛋白的酶活性，肿瘤生长抑制实验证实pSURVTK的抑瘤功能。结果：成功地将SURV基因启动子、CMV启动子，HSV1TK克隆到报告基因载体pGL3的多克隆位点，酶切鉴定和DNA序列分析无误，蛋白质印迹证实pSURVTK在肺癌细胞A549中可特异性表达出TK蛋白，更昔洛韦细胞毒实验表明表达的TK蛋白具有酶活性，并可有效抑制体内肺癌的生长。结论：SURV启动子调控的TK基因治疗载体，可特异性调控TK

3、基因在A594肺癌细胞的表达并抑制肺癌细胞的生长，为应用自杀基因治疗肺癌提供了新的途径。【关键词】肺癌;基因治疗;生存素;启动子;单纯疱疹病毒1型胸苷激酶　[Abstract]Objective:Toconstructalungcancerspecifictheherpessimplexvirus1thymidinekinase(HSV1TK)expressionvectorregulatedbysurvivinpromoter(SURV)anddetectitsactivationandpotentialtoinhibitthe

4、groidpGL3TKidpSURVTKandpCMVTKeansoflipofectamine.TheexpressionofHSV1TKorigenesisexperimentstoexplorethepotentialusingthisvectortotreatlungcancer.Results:ThevectorpSURVTKhasbeensuccessfullyconstructedeactivationrelatedtotheconcentrationofganciclovirandsuppressionof

5、tumorgrootercaneffectivelydrivetheHSV1TKtoexpress.TheexpressionofTKgeneor.Thispresentedaneploymentsucidegenesfortreatmentoflungcancer.　　[Keyoter;herpessimplexvirus1thymidinekinase　　肺癌已成为恶性肿瘤死亡的首要病因，传统的治疗方法包括化疗、放疗和手术，总的生存率不到15%[1]。随着免疫学和分子生物学的飞速发展，肺癌的基因治疗越来越受到研究人员的重视。采

6、用非病毒载体携带治疗基因，如自杀基因单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1TK)基因是目前肺癌基因治疗的研究热点之一。这些非病毒载体一般使用真核细胞启动子如巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)，该启动子无组织特异性，在正常细胞中也能高表达TK基因，通过使无毒的前药如更昔洛韦(GCV)转化成有毒的磷酸化产物，对正常组织也会造成损伤[2，3]。所以，研究在肺癌细胞高表达，而在正常组织低表达，甚至不表达的特异性启动子是肺癌自杀基因治疗成功的关键。　　生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosispr

7、oteins,IAP)家族的新成员，其组织分布特征具有明显的细胞选择性，在胚胎及多种肿瘤细胞系中高表达，但是不表达于终末分化的正常组织[4-6]。Survivin主要通过转录水平调控mRNA或蛋白的表达[7-8]。　　本研究构建了生存素基因启动子(survivinpromoter)调控的HSV1TK基因表达载体，通过体内外对肺癌细胞的杀伤效应研究，证实生存素启动子在肺癌细胞中特异性活化，可以驱动其调控的下游TK基因的表达，在更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)的作用下，可有效抑制肺癌细胞的生长，为应用自杀基因治疗肺癌提供了新

8、思路。　　1材料和方法　　1.1试剂和工具酶　　异丙基β半乳糖苷(IPTG)、低分子质量蛋白标准品、核酸标准参照物、限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ、NcoⅠ、XhoⅠ和TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、质粒DNA纯化试剂盒、