口蹄疫病毒2C3ABC基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

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1、内蒙古农业大学硕士学位论文口蹄疫病毒2C3ABC基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达姓名：郑立运申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：关平原;刘在新2003.5.1摘要本试验旨在利用毕赤酵母表达系统，对FMDV非结构蛋白2C3ABC基因在体外进行大量表达，从而建立一种口蹄疫的分子鉴别诊断方法。首先，用P2和3ABC阳性克隆通过连接PCR方法获得目的基因并将其克隆到pGEM—TEasy载体上，并转化E．coliDH5a感受态细胞中，经PCR、酶切以及测序证明得到了完整的2C3ABC基因．并与国内外参考序列进行比较分析。然后，将目的基因亚克

2、隆于pPICZaA表达载体并转化大肠杆菌DH5a，以Zeocin“抗性筛选阳性克隆，大量提取重组表达质粒并用PmeI酶线性化后电转化入毕赤酵母SMDll68感受态细胞，通过Zeocinl。抗生素梯度浓度筛选，获得重组酵母用0．5％甲醇诱导表达，通过SDS—PAGE电泳、Westernblotting分析，结果表明，2C3ABC基因在毕赤酵母中成功表达，其表达产物为一95ku的融合蛋白，并能被口蹄疫病毒阳性血清识别。经薄层扫描分析，表达量占总蛋白量的lj％以上。该项研究为应用FMD非结构蛋白基因表达声物为抗原建立鉴别诊断方法提供了材料。关键

3、词：FMD；2C3ABC基因；克隆：毕赤酵母；真核表达CloningofFoot—and-MouthDiseaseVirus2C3ABCGeneanditsexpressioninPichiaPastorisSystemAbstractInthisstudy，PichiaPastorisSystemhadbeenutilizedforexpressionofFMDV2C3ABCgenewhichaimedforestablishingasensitiveandspecificmoleculardignosismethod．First，2C

4、and3ABCgeneswereamplifiedindividuallyfromP2and3ABCpostiveclonesandligatedtogetherusingPCRmethod，thenthis2C3ABCproductwasClonedintopGEM-TEasyvectorandtransformed曼coliDH5acompetentcell。Apostiverecombinantplasmidwhichcontainedwhole2C3ABCgenehadbeenconfirmedbyPCR，enzymedigest

5、ionandsequencing．Afterthat，the2C3ABCgenewassub·clonedintopPICZaAexpressionvectorandtransformedE．eoliDH5acompetentcellandselectedbyZeotinTMantibiotic．Thepostiverecombinantexpressionvectorwaslinerizedandelectro-transformedPichiaPastorisSMDl168competentcell．ArecombinantPichi

6、口PastorishadbeenobtainedbyZeoci—Mantibioticsselectionandinducedwith0．5％methanolfortargetproteinexpression．TheexpressionproductwasanatysisedbySDS·PAGEandWesternblowingassay．Theresultshowedthat2C3ABCgcneWasexpressedsuccessfullyinPichiaPastorisandtheproductwasa95kufusionprot

7、einwhichcouldberecognizedbyanti-FMDVserum．Theamountoftargetproteinwasover15％ofthetotalbacteriaproteinbygelthinlayerscanninganalysis．ThisresearchhadsuppliedmaterialsforestablishingaFMDdiagnosismethodtodifferentiateinfectedanimalsfromvaccinatedanimals．KeyWords：FMDV：2C3ABC,{

8、gene：PichiaPastoris,；expressionDiretedby：Prof．GUANPingyuanLIUZalx}nSHENZhiYiAppIlcantforMarterde