rnai在探究egf生理效应机制中应用

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1、RNAi在探究EGF生理效应机制中应用【摘要】目的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是发生在mRNA水平上的一种基因沉寂现象，即在外源性双链RNA导入细胞后可以引起细胞内与其同源的mRNA特异性降解，使该基因在RNA水平上被关闭而导致其不表达，即转录后基因沉寂。小干扰RNA（smallinterferringRNA,siRNA）已经发展成为研究基因功能的有效工具，具有相当高的特异性；可以高效、特异地阻断体内同源基因的表达,促进同源mRNA降解。而表皮生长因子能诱导成纤维细胞的移动，促进EGF受体激活与推动力

2、产生的分子链接，构成完整的信号传递链，从而使EGF信号完成传递，最终引发一系列的细胞生化反应。�【关键词】RNAi;EGF;siRNAs;EGFR7RNA干扰是上个世纪兴起并发展起来的一种技术，但因其在基因功能研究中的巨大优势和潜力使得其迅速发展，同时其研究也不断深入。RNAi沉默机制主要表现在抗病毒、基因调控、染色质浓缩、转座子沉默、基因组重组等领域，它主要用于高通量的基因功能研究、基因敲除、基因治疗及药物筛选方面［1］。越来越多的科学工作者把它引入到表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,简称EGF）及表

3、皮生长因子受体（EGFreceptor，简称EGFR）的功能研究中。因为此效应机制中存在众多的功能蛋白质，利用RNAi技术对其编码基因进行阻遏，用这一突变型与原野生型比照，便可分析得出此蛋白在整个效应机制中的作用，而且结果很具说服力，因为此种技术本身就很可靠，它是从基因的角度进行操作，排除了在转录翻译过程中容易出现的干扰因素，所以RNAi在研究EGF的效应机制中很具有研究价值且应用前景十分广泛。�1RNAi的作用机理研究�7RNA作为核酸，它本身不具有蛋白酶类的任何功能，但它却能在胞内引发如此大的功能变化，其过程相当复杂。目前

4、对其研究已很清楚，dsRNA(doublestrandRNA,>19bp)是RNAi的效应源，其进入细胞后激活胞内自然存在的加工活性，引起对侵入的外源dsRNA具有同源序列的单链RNA降解（包括内源性的mRNA）［2］。研究表明dsRNA开导的同源靶mRNA的RNAi分三步进行［5］：首先，细胞内RnaseⅢ样核酸内切酶（Dicer酶）在ATP供能条件下将长的双链RNA(dsRNA)切割加工成21-25nt的正义和反义链组成的小片段双链RNA-小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）;然后siRNA在

5、ATP参与下被RNA解旋酶解旋为两条单链，接着在其反义链的指导下形成由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成的RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），活化后的RISC在单链siRNA引导下特异性识别并互补结合同源mRNA序列，进一步将之切割；最后被切割成片段的mRNA再被核酸外切酶进一步降解,从而在翻译水平干扰基因表达。但表皮生长因子的信号传递过程的具体效应机制目前尚不十分清楚。本文总结国内外此研究领域使用RNAi技术来探究EGF及表皮生长因子受体效应

6、机制的方法，为其更深入的研究提供参考。�2EGF及EGFR的发现及性质研究�2.1EGF与EGFR的发现及结构性质EGF是Cohen在1962年从鼠颌下腺分离出的一种具有神经生长活性的成分，由53个氨基酸组成，其对酸热比较稳定，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶的消化［3］。EGFR是一分子量为170000的跨膜糖蛋白，主要通过Ras/MAPK系统、P13K/AKT系统和�PLC/PKC�系统实现信号转导的级联放大效应，将有丝分裂信号从细胞外传递到细胞内，调节正常细胞的生长、分化、调控细胞周期，促进损伤修复。EGFR过度表达不仅可导致细

7、胞异常增生、存活，黏附迁移和分化，而且与损伤修复关系密切。�7EGFR最初是从人的磷状癌细胞株（A431）中分离出来的，编码EGFR的核酸序列位于第7条染色体上，其初步编码的EGFR为单链跨膜蛋白，含1186-1210个氨基酸残基，分子量134-135KD，该肽链片段在第11-12个天门冬氨酸残基部进一部糖基化后，分子量增加至170KD，即为成熟的EGFR［3］。�2.2EGFR激活过程当EGF与其受体结合后，导致受体聚合（酪氨酸激酶被激活所必需因素之一）并加强受体C末端至少3个酪氨酸残基（丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）的自身磷酸化

8、，酪氨酸激酶的磷酸化可使胞内磷脂酶C-γ（PLC-γ）和微管相关蛋白（MAP）激活，后者的激活可引发胞内GTPase激活蛋白（GAP）磷脂酶-C和脂肪皮质素等胞内底物磷酸化，引起级联反应，导致许多重要的核蛋白磷酸化，从而发挥EGF的生物学作用。�3RNAi在EGF研究中的应用