不同佐剂增强小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤细胞免疫效应的比较

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1、不同佐剂增强小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤细胞免疫效应的比较作者：周伊，齐旭，马军，来宝长，司履生，王一理【摘要】目的评价5种不同配方佐剂在低免疫原性小鼠黑色素瘤瘤苗保护性免疫中的细胞免疫增强作用。方法实验组用5种不同配方的佐剂（FCA,FCA+IL2+GMCSF,FIA+IL2+GMCSF,FIA+SWZY,FIA+SWZY+IL2+GMCSF）和照射灭活的D5黑色素瘤细胞制成瘤苗免疫小鼠，对照组免疫用单纯灭活D5黑色素瘤细胞。末次免疫后3天各组取半数动物检测DTH反应、NK细胞活性及特异性CTL活性，剩余半数动物接种活D5黑色素瘤细胞，3周后再次检测上述各免疫学参数。结果与

2、对照组相比，经免疫后的各实验组DTH反应、NK细胞活性、CTL活性均明显升高（P<0.05），但成瘤后随肿瘤增大，则呈下降趋势。结论5种佐剂配方制成的瘤苗均能诱导免疫小鼠对低免疫原性肿瘤的细胞免疫应答。其中佐剂SWZY和FCA增强免疫的效果相当，而毒副作用较小，可望成为一种人类肿瘤免疫治疗的新型佐剂。【关键词】佐剂；肿瘤疫苗；黑色素瘤　　0引言10随着对肿瘤免疫机制不断的深入了解，肿瘤疫苗即肿瘤的特异性主动免疫治疗越来越引起人们的关注[1]，而应用肿瘤细胞制成瘤苗的前提是肿瘤细胞表达具有免疫原性的肿瘤相关抗原，但人体自发性肿瘤多数免疫原性较弱，很难诱发宿主有效的抗肿瘤免疫效

3、应，而最直接的且行之有效的方法就是应用有效的佐剂提高其免疫原性[2，3]。本研究中，我们用FCA、FIA、IL2、GMCSF、SWZY等组成5种配方的佐剂和照射灭活的弱免疫原性D5黑色素瘤细胞制成瘤苗免疫小鼠，并对其免疫效果进行评价，试图筛选出一种毒副作用小、能增强弱免疫原性肿瘤抗原所诱发的保护性抗瘤效应的新型佐剂。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物和细胞株　　C57BL/6小鼠，雌性，8～10周龄，购自第四军医大学实验动物中心。小鼠低免疫原性黑色素瘤细胞株D5，由美国OregonHealthScienceUniversity胡宏明博士馈赠；人胃低分化粘液腺

4、癌细胞MGC803，由本室保存；小鼠白血病细胞YAC1，由第四军医大学免疫学教研室馈赠。10　　1.1.2主要试剂　　rhIL2由四川肿瘤研究所提供；rmGMCSF由美国胡宏明博士馈赠；弗氏不完全佐剂（FIA）、弗氏完全佐剂（FCA）由本室保存；佐剂SWZY由本室自制；MTT为Promega公司产品。　　1.2方法　　1.2.1瘤苗制备　　收获生长良好的D5细胞，经10000rad的60Co照射灭活，调整细胞浓度至2×107/ml备用。按下列配方制备5种佐剂瘤苗，即瘤苗A：FCA+灭活D5细胞，瘤苗B：FCA+rhIL2+rmGMCSF+灭活D5细胞，瘤苗C：FIA+

5、rhIL2+rmGMCSF+灭活D5细胞，瘤苗D：FIA+SWZY佐剂+灭活D5细胞，瘤苗E：FIA+SWZY佐剂+rhIL2+rmGMCSF+灭活D5细胞，并制备不加佐剂的灭活D5细胞瘤苗作为对照。瘤苗中的IL2按14×104U/kg、GMCSF按14μg/kg加入，各组佐剂与灭活的D5细胞的体积比为1∶1，混合后分别制成油包水的乳剂疫苗及不含FIA或FCA的水剂疫苗(其余成分同上)，于4℃保存备用。　　1.2.2主动特异性免疫保护实验10　　将小鼠随机分为6组，即注射瘤苗A、B、C、D、E的实验组和对照组，每组16只。各组小鼠接种不同瘤苗的量均为100μl（含1×

6、106细胞数）。初次免疫后2、3、4周各强化免疫1次。其中前2次免疫用油包水的乳剂疫苗，后2次免疫用水剂疫苗。对照组免疫用单纯灭活D5细胞。末次免疫后3天，各实验组和对照组小鼠均处死一半，进行有关免疫学参数的测定，剩余小鼠皮下接种D5细胞3×105个（50μl），3周后处死存活的小鼠，再进行有关免疫学参数的检测。　　1.2.3DTH反应　　采用足垫肿胀试验检测特异性迟发型超敏反应（DTH）。每批小鼠在处死前1天，于每只小鼠的左后足垫注射1×105个（50μl）D5细胞冻融液，24h后用游标卡尺测量左、右足垫的厚度（101mm），以左足垫的厚度减去右足垫的厚度计算肿胀反应。　　1

7、.2.4NK细胞活性检测　　用MTT法检测NK细胞活性，效应细胞为小鼠脾细胞，浓度1×106/ml。靶细胞为YAC1细胞，浓度1×105/ml。效靶比例为10∶1，每个样本3个平行样。在酶联检测仪于570nm波长测A值。按下述公式计算NK活性，以杀伤率（%）表示。10NK细胞活性（%）=[1（实验孔（效+靶）A值效应细胞对照孔A值）/靶细胞对照孔A值]×100%　　1.2.5特异性细胞毒性（CTL）测定　　用MTT法检测，效应细胞为小鼠脾细胞，靶细胞为D5细胞，其余方法、步