毛竹硝酸还原酶基因的结构预测及分析

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1、毛竹硝酸还原酶基因的结构预测及分析齐兵生科111201101220238摘要：应用电子克隆技术，以麻竹其中一条EST序列为种子序列，获得了麻竹纤维合成酶基因的一条CDNA序列。采用生物信息学方法，对该基因的核苷酸序列分析，包括核酸序列组分分析，限制性核酸内切酶分析，ORF阅读框识别并进行可靠性验证；并且对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜区、疏水性、信号肽、Coil区、空间结构及结构域等方面进行预测和分析；同时,利用siDESIGN™设计了siRNA，并利用ClustalX与其他物种同源序列比对，利用MEGA5软件通过NJ

2、法构建系统发育进化树，并对该CDNA进行了引物设计，以便于为今后麻竹纤维素合成酶基因的实验克隆和功能验证奠定基础。结果表明：麻竹纤维合成酶基因的CDNA序列全长为822bp,氨基酸数为290个，分子量约为33320.0，等电点为8.01，分子式为C1480H2273N407O425S21Se1，在组成20种氨基酸中，ILe和Gly所占比例最高，均为7.9%，而Trp所占的比例最低，为1.7%.纤维素合成酶的不稳定系数为47.53，脂肪指数75.69，根据Guruprasad方法表明麻竹纤维素合成酶不稳定。麻竹纤维素合成酶蛋白大约在

3、250-280位氨基酸之间含有一个典型的疏水性区域，没有预测出明显的信号肽，利用CoilsServer在线分析麻竹纤维素酶蛋白Coils区，均检测到麻竹纤维酶蛋白含有两个典型的卷曲螺旋结构，其中在140-190为氨基酸的置信值非常高，并且利用SMART服务器搜索麻竹蛋白结构功能域，发现该蛋白在第128-271位之间有个保守的结构功能域----Cellulose-synt，该Cellulose-synt家族成员共有的典型的结构域，该结构功能域由植物纤维素合酶的CesA蛋白，有高度的保守性残基，具有结构分子活性。同时也对麻竹纤维素酶基

4、因RNA的二级结构进行预测，其结构在最小自由能为-226.68千卡/摩时能量最低最稳定图。并利用DNAMAN软件对该麻竹纤维素酶基因进行siRNA预测，并且在对该蛋白进行相关数据分析的基础上，又利用siDESIGN™设计了siRNA，在50条结果中选出7条打分值在85以上的。通过NJ法构建系统发育进化树中，葡萄科属植物与麦类植物亲缘关系较近，麻竹与这两种物种趋于同一等级，且与豆科类植物亲缘关系较远。关键词：麻竹纤维素合成酶电子克隆生物信息学进入21世纪以来，人类在能源、资源、环境等方面面临着越来越严峻的挑战。中国的问题特别突出：一

5、方面，中国的石油对外依存度已经过半，大部分石油消费要靠进口，国家的能源安全和经济安全无法得到保证；同时，大量使用矿石燃料又严重污染环境，中国已经成为最大的温室气体排放国之一，面临国际上巨大的减排压力。寻找替代石油的可再生资源已成为紧迫任务。生物质资源是可以大量再生的，其利用过程中产生的CO2又会被植物吸收，形成碳封闭循环，不会影响环境。随着石油资源的日益短缺，利用工业生物技术将生物质快速转化为液体燃料和化工产品，经过充分利用后再排放，将形成新的封闭循环，实现人类社会的持续发展。因而，化学工业已经开始逐步形成由石油资源向生物质资源的

6、历史性、革命性转变。木质纤维素是地球上来源最丰富的生物质资源[1−3],若能将其有效降解成葡萄糖并用于燃料乙醇生产,对于改善目前资源紧张的状况将具有重要意义。竹子是世界重要的森林资源之一,随着全球环境的变化和森林资源的锐减,竹子作为一种生长迅速、再生性强的非木质植物资源,在缓解木材供需矛盾方面发挥着重要作用,其开发利用受到了国际社会的高度关注。竹子纤维素含量直接影响到其应用价值,而纤维素合成酶是纤维素生物合成的关键酶和特征酶,纤维素合成酶基因的转录与表达水平直接影响到纤维素的含量和品质,从而影响到竹子的经济价值。电子克隆法是近年来

7、基于表达序列标签(expressedsequencetag,EST)和基因组数据库发展起来的基因克隆新型技术,其利用生物信息学知识和计算机技术对EST或基因组数据库中进行同源性比较分析、整理拼接出新基因的编码序列,并通过生物学实验进行编码序列和功能验证,为人类功能基因组学与蛋白质组学研究提供新的线索和基础。电子克隆技术是加速基因克隆的一条有效途径。本论文以麻竹（DendrocalamuslatiflorusMunro）的一条EST序列为种子序列，通过BLASTn程序搜索Genbank的麻竹的EST数据库，利用电子延伸的方法，合成一

8、条CDNA，并对该基因及编码的蛋白质进行生物信息学分析。1、材料和方法1．1材料登陆美国国立生物技术信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），以“D.latiflorusMunro”为关键词搜索麻竹EST数据，共得到95