pcr法检测hbv

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1、实用标准文案PCR法检测HBV精彩文档实用标准文案摘要：目的了解乙型肝炎病毒的相关知识及PCR技术在乙型肝炎病毒检测方面的应用，并通过实验的方法加深理解。方法将已导入乙肝病毒特定段基因的质粒用基因扩增仪进行扩增，然后分两组进行电泳，并设置阴性对照、阳性对照、空白对照和Marker对照组。电泳完毕后将胶板放在UVP凝胶成像系统下观察，对照。结果实验组1弱阳性，实验组2阴性。讨论分析了实验结果及误差产生的可能原因。关键词：HBVPCR琼脂糖凝胶电泳一、引言1.现状乙型肝炎病毒感染是一个全球性的公共卫生问题。据估计，全世界大约有20亿人是过去或

2、现在的HBV感染者以及超过350万人长期感染乙肝病毒。在受感染的青少年或成人中，5％-10％将发展成慢性携带者，而在受感染的新生儿达90％慢性化发展。在慢性HBV感染者中，70％-80％可以持续正常多年或终身。进一步持续病毒感染，可以导致慢性活动性肝炎，甚至可能发展至肝硬化和肝癌。[1]在我国，乙肝病毒携带者约有1.2亿人。精彩文档实用标准文案2.HBV的形态与结构[2]感染者血清中用电镜观察可见三种不同形态的HBV颗粒，即大球形颗粒、小球形颗粒和管形颗粒。大球形颗粒亦称Dane颗粒，是具有感染型的完整成熟的HBV，呈球形。病毒外层有7n

3、m厚的包膜，内层为病毒核心（核衣壳）结构，成二十面体立体对称。HBV核心内部含有双股不完全环状的DNA基因组和DNA多聚酶。小球形颗粒，主要为HbsAg，不含HBVDNA和DNA多聚酶，无感染性。管形颗粒，是由小球形颗粒“串联”而成，不含病毒核酸，无传染性。3.HBV基因结构及抗原组成[3]精彩文档实用标准文案HBV-DNA分为负链(长链)及正链(短链)，其中负链有4个开放阅读框架，分别称为S、C、P和X基因区，他们彼此间相互重叠，以不同的启动子编码多种蛋白。⑴S基因区：S区基因有3个不同的启动子，分别形成S基因、PreS1基因与PreS

4、2基因，分别编码HbsAg、PreS1Ag和PreS2Ag三种包膜蛋白多肽；⑵C基因区：由前C基因和C基因组成,分别编码HBeAg及HBcAg；⑶P基因区：P区基因最长，编码HBV-DNA多聚酶、反转录酶及RNA酶H（RnaseH）等；⑷X基因区：X区基因编码的蛋白称为HbxAg，可反式激活HBV的基因，增强HBV基因的复制和表达。4.HBV的检测近二十年以来，人们在乙肝诊断方法方面做了大量的研究工作。早期阶段主要应用生化检查方法即肝功能检查，还有免疫学方法，主要采用血清学方法检测血清HBV抗原、抗体，检测HBVDNA多聚酶等。近来随着分

5、子生物学的快速发展，分子生物学技术检测血清HBVDNA（HBV感染的直接标志）的方法开始被应用于乙肝的诊断，并且不断发展完善。聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。将PCR技术和琼脂糖凝胶电泳结合，可用于HBV精彩文档实用标准文案DNA的检测，并且具有以上优点。[4]一、实验材料和主要实验仪器1.模板：重组质粒（将乙肝

6、病毒特定段基因导入到质粒中）2.特异性引物上游引物：5’-CACCTCCTCCTGCCTCCACCAATC-3’(1299-1322)24bp下游引物：5’-GGCCCCCAATACCACATCATCCAT-3’(2133-2157)24bp3.DdH2O,缓冲液10×buffer+Mg2+，dNTP,Taq4.溴酚兰：BIOER，LotNO.20071002,storage-20℃5.Marker：BIOER，BioDL2000，LotNO.200710026.电泳仪，生产厂家：北京百晶生物技术有限公司，型号BG-Power6007.基

7、因扩增仪，生产厂家：EPPENDOF8.UVPBioimagingsystems，AmericanUVPcorporation，GDS-8000system9.微型漩涡混合器，上海康华仪器制造有限公司，型号WH86110.微量加样器，生产厂家：北京百晶生物技术有限公司11.EP管二、实验方法1.PCR⑴将反应体系各成分加入EP管中，用微型漩涡混合器震荡混匀，各种成分的量见下表：精彩文档实用标准文案DdH2O缓冲液引物1引物2dNTPTap总量体积（μl）991566121.2139.2⑵从管中分别吸取23μl混合液加入到另外5个EP管中，

8、然后分别向其中4个管中加入阴性对照、阳性对照、实验组1、实验组2四种模板2μl，另一管中加入2μlH2O做空白对照。⑶将以上五管放入离心机中离心，封口，放入基因扩增仪中扩增，反应条件如下：94