葡萄的组培快繁技术.doc

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1、葡萄的组织培养技术湖北第二师范学院1•葡萄外植体的采集和消毒1.1外植体是从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。在该组织培养屮，用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。葡萄脱毒过程屮，外植体的大小与脱毒率高低成相关性。所以选取外植体的大小适宜在葡萄脱毒过程屮应要常握好•葡萄在茎尖培养屮，光的效果通常要比喑培养好。一般多采用光培养的方式，试管苗培养适宜的温度是25+/-2度1.2防止外植体带菌1.2.1选择好外植体采集时期和采集部位1.2.1.1外植体采集以春秋为宜；1.2.1.2优先选择地上

2、部分作为外植体；1.2.1.3阴雨天勿采，晴天下午采集；1.2.1.4采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。1.2.2室内或无菌条件下进行预培养。1.2.3外植体严格灭菌灭菌效果实验多次灭菌和交替灭菌仁3培养材料的消毒1.3.1先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馆水冲洗，再用无菌纱布或吸水将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。1.3.2在无菌坏境屮将材料放入70%洒精屮浸泡30-60秒。1.3.3再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01%升汞水消毒10分钟。1.3.4取出后用无菌水冲洗三、四次。1.4制备外植体将己消毒的材料，用无菌刀、剪、银等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和

3、种皮胚乳等，叶片则不需剥皮「然后切成0.2-0.5厘米厚的小片,这就是外植体。1.培养基的成分及制备2.1培养基的成分组织培养过程屮，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的。因此，培养基屮应包括植物牛长必需的16种营养元索和某些生理活性物质。所有这些物质，可概括为5大类：2.1.1无机营养物培养基的各种盐类小均含有氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、硼、锚、铜、锌、钳、氯。无机氮nJ以两种形式供应，即硝态氮和较态氮。有些培养基以硝态氮为主，另一•些以鞍态氮为主，多数二者兼而有之。铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，H前皆用螯合铁，即硫酸亚铁加乙二胺四乙酸钠配成。2.1

4、.2有机物质主要有两类：一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢等必要元素，如糖类、氨基酸及其酰胺类；另一类是一些生理活性物质，在植物代谢屮起一定作用，如硫胺索、毗哆醇、烟酸、生物索、肌醇、单核甘酸及其碱基。2.1.3植物生长刺激物质激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态，质地和分散性。以MS为基本培养基，附加适量的细胞分裂素6-BA和NAA。最适的培养基配方为MS+6-BA0.5-3.0mg/L和NAA0.01400mg/L,且培养基屮添加蔗糖有增加从生芽数量的作用。2.1.4其他附加物这些物质不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益。琼脂心9玄「）是

5、古I休培养基的必要成分，本身

6、并不提供任何营养•琼脂条的用量在6-10g/LZ

7、TiJ,抗生物质，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5—20mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养屮材料的损失，尤其对大量通气长期培养，效果更好。对于刚感染的组织材料，可向培养基屮注入5%—10%的抗菌索。应为注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，值得提醒的是，在工作屮不能以为有了抗菌素，血放松灭菌播施。3.1.5其他对生长有益的未知复合成分常用的为植物的天然汁液，如酵母提取物等。他们的作用是供给--些必要的微量营养成分、牛理活性物质和牛长激索物质等.以下为MS培养基配方:21S培养垄成分分子锻使川浓度（mg/L）俏

8、酸钾KNO3101.111900硝酸饮NH4NO380.041650人量元素说酸二虫钾KH2PO4136.09170硫酸镁MgSC)4.7H2O246.47370氣化钙CaC12.2H2O1(47.02440微屋元索碘化钾KI166.010.83硼酸H3BO361.836.2硫酸镒MnS(J4.4H2O223.0122.3硫酸锌ZnSO4.71120287.548.6钿酸钠Na2MoO4.2H2O241.950.25硫酸铜CuSO4.5H2O249.680.025氯化钻CoC12.62237.930.025铁盐乙二胺四匕酸二钠Na2.EDTA372.2537.3硫酸亚铁FcSO24.

9、7H2O278.0327.8有机成分肌醇100廿氨酸2盐酸硫胺素VB101盐酸毗哆醇VB60.5烟酸VB5或VPP0.5sucrose342.3130g/L琼脂agar7g/L下面列出继代培养和试管苗培养的培养基配方。①继代培养和生芽培养的培养基配方是：MS培养基+6BA（质量浓度为0.5〜1.0mg/L）+NAA（质量浓度为0.1〜0.15mg/L）。即在1LMS培养基屮加入5〜10mL6BA和1〜1.5mL的NAA母液。NAA配合6BA,可以促进不定芽