一种牡丹花瓣总rna的提取方法

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1、万方数据河南农业科学一种牡丹花瓣总RNA的提取方法高双成，施江，王世华，孔祥生，张苗霞(河南科技大学农学院，河南洛阳471003)摘要：利用CTAB改良法，以富含花青素类物质的牡丹花瓣为材料提取总RNA，经紫外光谱分析A260／A280比值为1．9--,2．0，电泳检测到28S，18S和5SrRNA3条清晰的带，带的亮度强，且28S是18S亮度的2倍左右，说明提取的RNA完整、未降解。关键词：牡丹；花辩；总RNA}CTAB法中图分类号：$685．11文献标识码：A文章编号：1004—3268(2007)10—00

2、93—02牡丹(PaeoniaSU厂厂ruticosa)为芍药科(Paeo—niaceae)植物的一种，是原产我国的传统名花，已有1500多年的栽培历史。牡丹花硕大，多姿多彩、雍容华贵、富丽端庄，被誉为“国色天香”、“花中之王”．牡丹实生苗养护4"-5年后方可开花，因而其常规杂交育种周期较长，选育一个品种往往要十几年，甚至数十年。因此，开展牡丹的分子生物学研究，通过基因工程途径进行牡丹品种的改良，成为牡丹育种工作者近年探索的课题。高质量的牡丹花瓣RNA提取方法的建立是进行牡丹基因克隆的一个前提条件。目前，关于植物

3、RNA的提取方法也很多[1叫]，每一种植物及其本身的不同部位都有各自的特点，这些特点反映在自身的结构和组成上，因此很难用一种方法来适应所有的植物组织[7~121。对于牡丹来说，组织中的多糖含量高，花瓣中的多种花色素苷物质更是高质量核酸提取难以去除的干扰成分。本研究采用改良的CTAB法成功地提取牡丹花瓣的总RNA，可直接用于RT—PCR、差异显示、North-ern杂交等试验。1材料和方法1．1供试材料供试材料为牡丹品种洛阳红花瓣，在液氮中速冻，一70℃保存备用。1．2试剂1．2．1提取RNA的试剂CTAB提取液：

4、100mmol／LTris—HCI(pH8．O)．1．4mol／LNaCl，25mmol／LEDTA(pH8．0)，2％CTAB，2％PVP，12．5mmol／L硼砂；SSTE缓冲液：10mmol／LTris—HCl(pH8．0)，1mmol／LEDTA(pH8．0)，0．5oASDS，1．0mol／LNaCI；氯仿／异戊醇(24l1)，口一巯基乙醇，0．1％DEPC水，70％乙醇(用0．1％DEPC水配制)，10mol／LLiCl，无水乙醇；RNA提取所用的塑料、玻璃器皿均用0．1％的DEPC浸泡24h后，高压

5、灭菌30min。1．2．2检测RNA的试剂电泳缓冲液1×MOPSBuffer：2mmol／LMOPS，1mmol／LEDTA(pH8．O)，2mmol／LNaOACI1％琼脂糖凝胶；溴化乙锭(EB)，终浓度为0．5#g／mL。1．3RNA的提取流程(1)称取0．19新鲜或一70℃保存的花瓣于液氮中迅速研成粉末，将粉末转入2mL离心管中，加入600弘L65℃预热的CTAB提取液，同时加入10弘L口一巯基乙醇，立即剧烈涡旋振荡30s，于65℃水浴5min，期间剧烈涡旋振荡3．-一5次。(2)稍微冷却后加入等体积的氯仿

6、／异戊醇(24I1)涡旋振荡1min混匀，室温下，10000r／min离心10min，取上清，转入另一新1．5mL离心管中。(3)氯仿／异戊醇再抽提一次，转移上清至另一离心管中。(4)加入1／4体积的10mol／LLiCI，使终浓度为2mol／L，4℃过夜沉淀。(5)4℃，10000r／rain离心20min，去上清，用500弘L70％乙醇漂洗沉淀。(6)稍稍晾干沉淀后加入500弘LSSTE缓冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿／异戊醇再抽提1～2次。(7)转移上清后加入2倍体积的无水乙醇，一70℃放置30rain。4

7、℃，10000r／min离心20min，沉淀RNA。收稿日期：2007一04—12基金项目：河南省科技发展计划项目(42301200)，河南科技大学博士科研启动经费(09001163)资助作者简介。高双成(1976一)，男．山西夏县人。讲师，主要从事植物分子生物学研究．·93·万方数据2007年第10期(8)用500弘L70oA乙醇、500}

8、L100％乙醇漂洗沉淀后，室温晾至无酒精味，用50弘LDEPC处理过的水溶解沉淀，放人一70℃储备。1．4总RNA的质量和浓度检测通过紫外分光光度计和凝胶电泳检测总RNA的

9、质量和浓度。2结果与分析2．1RNA浓度的紫外检测取5肛LRNA样品用DEPC水稀释100倍后，用BANKMANDU640紫外可见分光光度计测量A260和A280，一般A260／A280=1．8～1．9是指高纯度的DNA；A260／A280—1．9～2．0是指高纯度的RNA，本试验提取总RNA的A260／A280比值在1．9～2．0之间，浓度在31t卫g／mL左右(表1)