卡介苗热休克蛋白70基因转染人原代白血病细胞瘤苗的制备及其抗瘤机制.pdf

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1、216·中华实用儿科临床杂志2015年2月第30卷第3期ChinJApplClinPediatr,F——··血液／He瘤疾病·卡介苗热休克蛋白70基因转染人原代白血病细胞瘤苗的制备及其抗瘤机制李晓玲刘春雷孙立荣【摘要】目的通过体外培养白血病细胞，制备膜表面表达卡介苗(BCG)热休克蛋白70(HSP70)瘤苗，研究其抗瘤作用和机制。方法含重组人干细胞因子(SCF)、重组人nt一3配体(FL)、白细胞介素(IL)-3和IL-6的无血清培养液Stemspan~体外培养急性髓系白血病(AML)细胞，含SCF、FL、I

2、L一3和IL-7的无血清的改良Iscove培养基(IMDM)体外培养B系急性淋巴细胞白血病(B—ALL)细胞，通过观察细胞生长形态和免疫表型测定验证培养的白血病细胞。利用脂质体2000将重组载体pDisplay—HSPT0转染到已被鉴定的白血病细胞，免疫荧光单克隆抗体进行细胞表面修饰鉴定。对转染后的白血病细胞免疫原性进行检测：实验组分为未进行转染的白血病细胞组(wt．LC组)，转染空载体pDisplay的白血病细胞组(pDisplay—LC组)及转染重组载体pDisplay—HSP70的白血病细胞组(HSP7

3、0．LC组)。收获各组细胞，与自体外周血T淋巴细胞混合培养72h，羟基荧光素双乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，流式细胞术测定淋巴细胞增殖指数，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测干扰素(IFN)一水平；各组白血病细胞与T淋巴细胞混合培养6d后，加入新鲜白血病细胞(效：靶分别为10：1、20：1、40：1、80：1)共培育12h，乳酸脱氢酶(LDH)释放改良法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性。结果短期培养的白血病细胞呈集落样悬浮生长，并保持增殖特性；1—10d细胞增殖较快，以后逐渐变慢。对培养10d

4、的细胞进行免疫表型测定，AML细胞的CDCD表达与培养前比较差异无统计学意义(P>0．05)；B。ALL细胞的CDCDCD表达与培养前比较差异无统计学意义(P>0．05)。共聚焦显微镜观察证实BCGHSP70表达在转染后的白血病细胞表面。转染后的白血病细胞免疫原性检测结果：(1)自体淋巴细胞增殖：HSP70一LC组CFSE阳性率明显高于wt—LC组和pDisplay—LC组(t=17．89、19．58，P均<0．05)，pDisplay—Lc组与wt—LC组问比较差异无统计学意义(P>0．05)。(2)细胞因

5、子水平：HSP70．LC组IFN一水平明显高于wt—LC组和pDisplay—LC组(t=24．72、24．81，P均<0．05)。(3)CTL杀伤活性：固定效：靶比例，与实验wt—LC组、pDisplay-LC组比较，HSP70-LC组能明显提高CTL的杀伤活性(F=13．66，P<0．05)；当效：靶从10：1至8O：1，HSP70-LC组组内CTL细胞杀伤活性逐渐增强(F=19．69，P<0．05)。结论体外成功培养人原代急性白血病细胞，短期培养可以明显增加细胞数量，且对细胞表面抗原表达影响不大，能维持

6、其生物学特性。成功制备膜表面表达BCGHSP70的白血病细胞瘤苗，且BCGHSPTO基因转染后能明显增强白血病细胞的免疫原性。【关键词】卡介苗；热休克蛋白70；白血病细胞；肿瘤疫苗PreparationofleukemiacellvaccineexpressingBacilleCalmette—Gu6rinheatshockprotein70anditsanti—leukemiatherapeuticefectLiXiaoling，LiuChunle，SunLirong．DepartmentoftheThir

7、dPediatrics，LinyiPeo—plesHospita1．Linyi276ooo。ShandongProvince．ChinaCorrespondingauthor：SunLirong，Emaif：sunlr@加．sina．com【Abstract】ObjectiveToculturetheacuteleukemiacellsinvitro，andtopreparecancervaccineexpressingheatshockprotein70(HSP7O)ofBacilleCalemette—G

8、e&in(BCG)ontothecellsurface．soastostudyitsanti—tumoreffectandmechanism．MethodsAcutemyeloidleukemiafAML)cellswereculturedinaserum—freeStemspancuhuresupplementedwithcytokines[stemcellfactor(SCF)，fit一3lig