重组人白细胞介素课件.ppt

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1、重组人白细胞介素-2RecombinantHumanInterleukin-2白细胞介素-2基本信息为多肽类免疫增强剂，是一种淋巴因子。刺激B细胞增殖分化和分泌抗体。诱导干扰素和多种细胞因子的分泌用于肿瘤辅助治疗和癌性胸、腹水的治疗。也可各种自身免疫病的治疗。对乙型肝炎、麻风病、肺结核、白色念珠菌感染等具有一定的治疗作用。免疫作用机理IL-2能与任何能形成IL-2受体的细胞,如辅助性T细胞(TH)、细胞毒性T细胞(Te)、B细胞和自然杀伤细胞结合,但结合的强度以Tc细胞为最高。IL-2与相应受体结合后,细胞即从G相进入S相并开始分化增殖。2021/7/30

2、3临床应用1.肿瘤治疗：在恶性肿瘤的发病机制中,肿瘤病人的白介素-2含量较正常的水平低,不能使NK、CTL、LAK等杀伤细胞活化和增殖,使肿瘤细胞逃逸，得不到清除。此时必须提供外源白介素-2,帮助病人完成免疫监视功能,这就是白介素-2治疗肿瘤的免疫学基础。2.抗病毒感染3.对感染性疾病的治疗作用4.对其他疾病的治疗：白介素-2在急性白血病、抗高血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。2021/7/305二、生产制备生产制备的方式主要有两种：1、传统工艺制备2、基因工程制备其中以第二种方法为主传统工艺流程IL-2一级结构IL-2为螺旋状的长肽链，由1

3、33个氨基酸组成，其中共有三个半胱氨酸（cys)分别在第58、105、125位，其中58位与105位的cys生成的二硫键为活性所必需，且易错配或生成二聚体，降低生物活性。基因工程重组IL-2用点突变的方法把125位的cys改成Ser或Ala，使IL-2分子稳定性增强。如果用点突变的方法把58或105位的cys变成其他氨基酸，则rIL-2的活性几乎完全丧失。2021/7/308改造后的优点1.提高白细胞介素2的比活性2.提高白细胞介素2的稳定性：由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二硫

4、键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。2021/7/3093.易于纯化：在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2。由于125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦，另一方面比活性降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题，因而有利于IL-2的纯化。4.降低毒性：125位cyt被ser或Ala取代的I

5、L-2由于比活性进一步提高，在给予同等活性的IL-2时，新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治疗的进行。2021/7/3010化学修饰：对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力,延长其在体内的作用时间,提高药效，降低或消除其在体内的免疫原性。对IL-2进行修饰的主要为PEG,。1992年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG修饰rIL-2,作用时间提高10倍，而且免疫原性下降,抗肿瘤性能提高,毒副作用有所降低。1994年和1997年及其后都有人用PEG修饰rIL-2得到生物活性基本不变而抗原性降低的修饰

6、蛋白的报道;随后白介素-2的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了研究的热点。2021/7/3011基因工程制备流程IL-2cDNA文库的构建利用探针杂交筛选IL-2cDNA阳性克隆与质粒载体pBV220连接，并转入大肠杆菌DH5aIL-2基因表达分离纯化包涵体溶解，复性，纯化纯化的rIL-2T细胞mRNA反转录cDNA制备方法：1.构建工程菌：将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛选出目的菌。2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30℃振荡培养8-10小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，30℃下培养11-13小时，再在42℃下培养5

7、-6小时，发酵后收集菌体。3.包涵体提取：取菌体，用PH8.5，浓度为50mMolTris.Hcl-1mMolEDTA-1mMolDTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同样缓冲液中，加溶菌酶，4℃下作用30分钟，冰浴超声至完全破裂为止，离心除去可溶性杂志，沉淀悬于PH8.5浓度为50mMolTris.Hcl-1mMolEDTA-2mMolDTT。搅拌下缓慢滴加同体积PH8.5，浓度为50mMolTris.Hcl-1mMolEDTA-8mMol尿素，室温下缓慢搅拌20-40分钟，离心除去可溶性杂志，沉淀再用缓冲液洗两遍，再将沉淀溶于PH8.5，浓度为50mMolT

8、ris.Hcl-10mMolDTT-7至8MolGuHCL,溶解1