2015年重庆地区儿童诺如病毒性胃肠炎分子流行病学研究

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分类号：R373.2+5UDC：密级：重庆医科大学硕士学位论文2015年重庆地区儿童诺如病毒性胃肠炎分子流行病学论文题目研究作者姓名陈岑指导教师姓名（职称、单位名称）许红梅教授重庆医科大学附属儿童医院重庆市渝中区中山二路136号（400014）申请学位级别硕士学科、专业名称儿科学（感染消化）论文答辩年月2016年5月2016年5月 重庆医科大学．研究生学位论文独创性声明本人申巧所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知了文中特别加ｌ和致谢的地方外，除ｉＵ示注，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得重庆医科大学或共他教育机构的学位或，近书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均巴在论文中作了明确的说明并表示谢意。，申请学位论文与资料若有不实之处一，本人承担切相关责任。＂学位论文作者签名：曰期．：名Ｗ、麥《？学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，目Ｐ；研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论义或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可Ｗ公布学位论文的全部或却分内容（保密内容除外），并编入有关数据库进行枪索、．，可Ｗ采用影印缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用本授权书。论文作者签若指导教师签名：＇日期：Ｗ叫 目录英汉缩略语名词对照............................................................................................................1中文摘要..................................................................................................................................2英文摘要..................................................................................................................................4论文正文：2015年重庆地区儿童诺如病毒性胃肠炎分子流行病学研究...................6前言..................................................................................................................................61标本来源、实验材料与方法...................................................................................71.1标本来源.........................................................................................................71.2实验材料.........................................................................................................71.2.1实验仪器......................................................................................................71.2.2主要实验试剂..............................................................................................81.3实验步骤.........................................................................................................81.3.1实验前准备..................................................................................................81.3.2标本预处理..................................................................................................81.3.3RNA提取.....................................................................................................91.3.4RNA逆转录.................................................................................................91.3.5NoVRT-PCR.............................................................................................101.3.6NoVRT-PCR产物鉴定............................................................................121.3.7NoV基因测序与分析..............................................................................121.3.8NoV重组分析............................................................................................131.4统计学分析...................................................................................................152结果...........................................................................................................................152.1NoV检出情况...............................................................................................152.2NoV基因型分析...........................................................................................182.3NoV重组分析...............................................................................................203讨论...........................................................................................................................23结论...............................................................................................................................25 参考文献.......................................................................................................................25文献综述...............................................................................................................................30诺如病毒致病机制的相关研究进展.................................................................................301诺如病毒感染临床表现.........................................................................................302病毒样颗粒和P颗粒.............................................................................................303诺如病毒受体..........................................................................................................314NoV与HBGAs的结合模式..................................................................................315NoV感染宿主的免疫应答.....................................................................................326治疗现状...................................................................................................................337总结与展望...............................................................................................................33参考文献.......................................................................................................................34致谢........................................................................................................................................37攻读硕士学位期间论文发表情况.....................................................................................38 重庆医科大学硕士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称NoVNorovirus诺如病毒RT-PCRReversetranscription-polymeraseChain逆转录聚合酶链式反应ReactionRNARibonucleicAcid核糖核酸BPBase-pair碱基对ORFOpenreadingframe开放阅读框RdRpRNAdependentRNApolymeraseRNA依赖的RNA多聚酶HBGAshisto-bloodgroupantigens组织血型抗原HPHighpowerfield高倍视野mlMilliliter毫升μLMicroliter微升rpmRevolutionsperminute转/分钟TAETris-acetata-EDTATris乙酸PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液cDNAComplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸VLPsvirus-likeparticles病毒样颗粒FUTfucosyltransferase岩藻糖转移酶1 重庆医科大学硕士研究生学位论文2015年重庆地区儿童诺如病毒性胃肠炎分子流行病学研究摘要目的了解2015年重庆地区诺如病毒感染所致儿童急性胃肠炎的临床表现、分子流行病学特点及基因重组情况。方法收集2015年1月至12月因急性腹泻于重庆医科大学附属儿童医院门诊患儿的部分临床资料，并对其粪便标本进行诺如病毒（GI、GII）的衣壳蛋白（Capsid）区域基因片段扩增（RT-PCR），对阳性的PCR产物进一步基因测序、分型并构建进化树；并统计分析其在不同月份、性别、年龄组之间差异。再次通过RT-PCR同时扩增NoV阳性标本的RdRp区和Capsid区部分基因片段，并基因测序、分型，对NoV基因重组情况进行分析、鉴定。结果研究期间共收集到符合条件的粪便标本485例，NoV总检出率为10.7%(52/485)，其中NoVGII型52例，无NoVGI型检出。8-10月为NoV检出高峰，不同月份之间的检出率差异有统计学意义（χ2=41.514，P＜0.05）。其中男性患儿36例，占12.9％（36/279），女性16例，占7.8％（16/206），男女之间的检出率差异不具统计学意义（χ2=3.266，P＞0.05）。低于6月龄患儿NoV检出率最低，7至12月龄组NoV检出率最高且在全部NoV阳性患儿中所占比例最大，2岁以内患儿占NoV阳性的88.5%。NoV阳性患儿大便性状多为水样便，其中23.1%（12/52）患儿仅有腹泻表现，65.4%（34/52）的患儿伴随程2 重庆医科大学硕士研究生学位论文度不一的呕吐，26.9%（14/52）患儿伴有发热，38.5%（20/52）的患儿合并咳嗽、流涕等呼吸道症状。NoV阳性中包含GII.4Sydney2012型27例（51.9%），GII.3型16例（30.8%），GII.6型5例（9.6%），GII.7型2例（3.8%），GII.17型2例（3.8%）。共检测出3种类型的GII型组内重组株，包括GII.e|GII.421例（21/34），GII.12|GII.39例（9/34），GII.7|GII.62例（3/43）。结论诺如病毒是重庆地区儿童病毒性胃肠炎的常见病原。其流行高峰主要集中在8-10月，发病年龄以低于2岁的婴幼儿为主(88.5％)，其中7-12月龄为NoV检出率最高的年龄组。NoV基因型别多样，且重组现象明显，GII.e|GII.4Sydney2012、GII.P12|GII.3、GII.P7|GII.6、GII.P7|GII.7、GII.P17|GII.17为2015年重庆地区的主要流行株关键词：诺如病毒性胃肠炎，基因型，基因重组3 重庆医科大学硕士研究生学位论文MOLECULAREPIDEMIOLOGYSTUDYOFPEDIATRICNOROVIRUSGASTROENTERITISINCHONGQING,2015ABSTRACTObjectiveTostudytheprevalentsituationandmanifestationofnorovirusgastroenteritisinchildren,andanalyzethemolecularepidemiologyandrecombinationinChongqing,2015.MethodsWecollectedfecalsamplesandrecordtheclinicaldatafrom485childrenwithacutegastroenteritisintheoutpatientdepartmentofChildren’shospitalofChongqingMedicalUniversityfromJanuarytoDecemberin2015.WedetectedthenucleicacidaboutmajorcapsidproteingeneofNoVgenogroupGIandgenogroupGIIbyRT-PCR,thensequencingallthepositiveproductsandthenanalyzedthegenotypesandstructurethephylogenetictreeandtheprevalenceofthepositivesamplesbycategorizedmonth,sex,andage.Inaddition,weamplifiedpartialRdRpandmajorCapsidproteingeneofallthepositiveproductsandthensequencing,andanalyzedthegenotypesandrecombination．Results485specimenswerecollected.ThepositiverateofNoVis10.7%(52/485),allthe52positivearegenogroupGII,noonewaspositiveforgenogroupGI.NoVprevalencemajorfromAugusttoOctober,andtheNoVdetectionratebetweendifferentmonthwassignificantlydifference(χ2=41.514,P＜0.05).Andthemalepositiveratewas12.9%（36/279）,thefemalespositiveratewas7.8％(16/206).Thedetectionrate4 重庆医科大学硕士研究生学位论文offemalesandmaleswasnostatisticaldifference(χ2=3.266，P＞0.05).Thedetectionrateintheagegroupyoungerthan6monthswaslowerthanothergroups.Therewasahigherdetectionrateandconstituentratiointheagegroupbetweenseventotwelvemonths.AndChildrenyoungerthan2yearsoldaccountedfor88.5%ofthetotalpositivecases.MostoftheNoVpositivechildrenhavewaterystool.Dirarrheawastheonlysymptomin23.1%(12/52)children,andtheother65.4%(34/52)hadaccompaniedwithvomiting.Thepositiverateofrespiratoryandfeverwere38.5%(20/52)and26.9%(14/52).Therewere27(51.9%)GII.4Sydney2012,16(30.8%)GII.3,5(9.6%)GII.6,2(3.8%)GII.7,2(3.8%)GII.17.Wedetected3NoVGIIrecombinationtypesconsistingof21GII.e|GII.4Sydney2012,9GII.12|GII.3and2GII.7|GII.6.ConclusionsNoVisacommoncauseofpediatricviralgastroenteritisinChongqing.TheepidemicpeakofNoVwereAugust,SeptemberandOctober.Andchildrenyoungerthan2yearsoldaccountingfor88.5%ofthetotalpositivecases.Therewasahigherdetectionrateintheagegroupbetweenseventotwelvemonths.TheprevalentstrainsofNoVcharacterizedbygeneticdiversityandcommonlyrecombination.GII.e|GII.4Sydney2012,GII.P12|GII.3,GII.P7|GII.6,GII.P7|GII.7,GII.P17|GII.17werethepredominantstraininChongqing,2015.Keywords:Norovirus,Gastroenteritis,Genotypes,Recombination5 重庆医科大学硕士研究生学位论文2015年重庆地区儿童诺如病毒性胃肠炎分子流行病学研究前言急性胃肠炎是影响全球儿童健康的主要疾病之一，随着医疗卫生的不断进步，其造成的影响逐步得到控制，但在发展中国家，急性胃肠炎仍是导致儿童死亡的重要原因。诺如病毒作为引起急性胃肠炎的主要病原，约占总体发病率的18%，每年大约导致110万患者住院治疗，在英国，每年有将近15%的小于5岁的儿童感染诺如病毒[1]，而在发展中国家，每年有将近20万儿童死于诺如病毒性胃肠炎。NoV隶属杯状病毒科，为单股正链RNA病毒，基因全长约7.5-7.7kb，在5’端以共价连接病毒蛋白（VPg），在3’端连接多聚腺苷酸，包含三个开放阅读框（openreadingframes,ORFs），其中ORF-1编码6种非结构蛋白，包括诺如病毒蛋白酶和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase,RdRp）；ORF-2和ORF-3分别编码主要衣壳蛋白（VP1）及次要衣壳蛋白（VP2），VP1包含S区和P区两个部分，其中P区可与组织血型抗原（histo-bloodgroupantigens,HBGAs）结合，是NoV抗原性的主要体现部位。有研究发现，GV型NoV还存在ORF-4，其与OFR-2部分重叠，并且可替代OFR-2翻译，编码毒粒因子(VF1)，可能与先天性免疫调节有关[2]。成熟的病毒颗粒直径27-40nm，呈二十面体对称，包含90个VP1二聚体。基于VP1氨基酸序列的不同，目前至少可将NoV分为7个不同的基因组，而每个基因组又包含不同的基因型，其中GI和GII为感染人类的主要基因组，分别可分为至少9个和22个基因型[3]。加之NoV复制过程中易发生重组和突变，产生新的变异株，使病毒抗原性发生变化，逃避人群免疫压力，以致每2-3年发生NoV的全球周期性流行。由于NoV检测方法的局限性，目前并未将NoV纳入胃肠炎的常规检测项目（如轮状病毒），极大的限制了NoV流行病学的研究。本研究通过收集急性腹泻患儿的临床资料及对应大便标本的病原学检测，了解2015年重庆地区儿童NoV感染后的临床表现、分子流行病学特点及基因重组情况，丰富了重庆地区NoV感染的流行病学资料，为我国制定NoV感染的防控措施提供有效的参考。6 重庆医科大学硕士研究生学位论文1标本来源、实验材料与方法1.1标本来源经过实验设计组专业培训的标本收集人员，收集2015年1月份到12月份，因急性腹泻于重庆医科大学附属儿童医院门诊就诊的患儿的粪便标本（纳入标准：①腹泻病程≤2周；②有粪便性状的改变：水样便、稀糊状便；③每日排便次数≥3次；④大便常规镜检白细胞数≤10/HP，且无真菌、寄生虫；⑤近期无其他感染性疾病史，且无长期抗生素使用史），同时填写相应的腹泻个案调查表（包括患儿年龄、性别，腹泻天数及每日最多腹泻次数，是否有其他伴随症状，是否使用抗生素等），并将标本与调查表对应编号。将采集后的标本尽快存放于-70℃冰箱以待进一步检测分析。1.2实验材料1.2.1实验仪器仪器名称制造厂家标本放置冰箱SONY（日本）超纯水系统Millipore（美国）生物安全柜FORMA1149ThermoScientific（美国）Thermo微量离心机WXH微型涡旋混合器跃进医疗器械厂（上海）微量移液枪Eppendorf（德国）电热恒温水箱HH.W21-Cr420长安永创科学仪器有限公司（北京）TOMYOMC-860离心机TOMY（日本）加热微波炉连云港电子工业七七八厂JT102N天平六一仪器厂（北京）DYY-7C型电泳仪PCR仪BIO-RAD（美国）凝胶成像系统7 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.2.2主要实验试剂试剂名称生产厂商QIAamp核酸提取试剂盒Qiagen公司（德国）SuperScriptIII逆转录试剂盒Invitrogen公司（德国）引物ExTaqDNA聚合酶试剂包宝生物工程（大连）有限公司（中6×LoadingBuffer国）琼脂糖100bpDNALadderMarker天根生化科技有限公司（中国）1.3实验步骤1.3.1实验前准备实验所需溶液的配制：PBS过滤液：分别加1.42gNa2HPO4▪12H2O、0.27gKH2PO4、8gNaCl、0.2gKCl于烧杯中，再加去离子水至1L，充分摇匀并测定溶液的PH值（7.2-7.4）后，抽滤分装，消毒灭菌后储存于4℃冰箱备用。0.25TAE:量取15ml50%TAE，用ddH2O定容至2.5L，充分混匀，常温备用。实验所需物品提前打包消毒消毒物品：枪头（10μL、200μL、1000μL），去酶EP管（1.5ml）、八连管、PBS过滤液、ddH2O。实验所需耗材编号分别编号与粪便标本相对应的4组去酶EP管（分别标记为A组、B组、C组、D组）、1组QIAamp离心柱。1.3.2标本预处理将700μLPBS过滤液加入A组去酶EP管中。将粪便标本置于室温环境，待其自然融化，吸取约0.5ml粪便标本于上述对应EP管内，盖紧外盖。8 重庆医科大学硕士研究生学位论文将上述混合液置于漩涡混合器震荡，充分混匀。再将上述EP管置于离心机高速离心（12000rpm）5分钟，充分分离粪便残渣和所需上清液。若无法及时进行下一步实验，可将上述离心液短暂存放于4℃冰箱。1.3.3RNA提取严格按照QIAampRNA提取试剂盒使用说明书进行实验操作，具体实验步骤如下：分别将25ml及30ml无水乙醇加入AW1和AW2中混匀，将1400μLAVE加入装有蛋白酶K冻干粉的试剂瓶中混匀待用。取25μL配置成的蛋白酶K溶液加入B组EP管内，再分别对应加入200μL预处理后的标本上清液。再向上述混合液中加入200μL的LysisBuffer及6.2μL的carrierRNA，盖紧外盖，充分摇晃15秒混匀后短暂离心，将EP管放入56℃恒温水浴箱内孵育15分钟，取出EP管，短暂离心。向上述EP管内加入250μL无水乙醇，混匀，置于室温环境裂解5分钟，短暂离心。将EP管中液体全数仔细移至已编号的QIAamp离心柱中，盖紧盖子后8000rpm离心1分钟，丢弃离心液，将离心柱转入新的收集管。加入500μL配制好的AW1缓冲液，盖紧盖子后8000rpm离心1分钟，丢弃离心液，将离心柱转入新的收集管。加入500μL配制好的AW2缓冲液，盖紧盖子后8000rpm离心1分钟，丢弃离心液，将离心柱转入新的收集管。加入500μL无水乙醇，盖紧盖子后8000rpm离心1分钟，丢弃离心液，将离心柱转入新的收集管，再次离心（1400rpm）3分钟。弃离心液，将离心柱移入对应的C组去酶EP管中，加入62μLAVE，盖紧EP管外盖，室温放置5分钟。将上述EP管放入离心机，1400rpm离心1分钟，弃离心柱，此时EP管内的离心液即为RNA。1.3.4RNA逆转录9 重庆医科大学硕士研究生学位论文严格按照SuperScriptIII逆转录试剂盒使用说明书进行实验操作，具体逆转录实验步骤如下：1）向D组去酶EP管中加入对应的上述提取的RNA15μL，再分别加入2μLrandomhexamer和2μL10mMdNTPmix，将盖子盖紧后充分混匀，短暂离心。2）放入65℃水浴箱保温5分钟，快速将其移至冰上冷却1分钟，短暂离心。3）加入11μL混合溶液：10×RTbuffer（3μL），MgCl（24μL），0.1MDTT（2μL），SuperScriptTMIIIRT（1μL），RNaseOUTTM（1μL）。4）充分混匀，待室温中反应10分钟后将EP管放入50℃水浴箱50分钟。5）将EP管移至85℃恒温箱内5分钟高温灭活逆转录酶终止反应，迅速冰上冷却1分钟。6）短暂离心，此离心液为cDNA，室温放置20分钟后置入-20℃冰箱备用。1.3.5NoVRT-PCR通过RT-PCR方法对NoV进行基因片段扩增，所用引物如下表（表1.1）：表1.1：诺如病毒RT-PCR所用引物Table1.1：theNoVprimersforRT-PCRVirusRegionPrimerPolaritySequence(5’-3’)ProductSizeCTGCCCGAATTYGTAAANoVG1SKF＋TGACapsid330bp（GI）G1SKR－CCAACCCARCCATTRTACACARGARBCNATGTTYAGNoVGoG2F＋RTGGATGAGCapsid387bp（GII）G2SKR－CCRCCNGCATRHCCRTTRTACATATACCACTATGATGCAGRdRpNoVJV12＋ATTA+1111bp（GII）G2SKR－CCRCCNGCATRHCCRTTCapsidRTACAT10 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.3.5.1NoVGI基因组和GII基因组Capsid区域基因片段RT-PCR反应体系，见下表（表1.2，表1.3）：表1.2：NoVGI基因组Capsid区域基因片段RT-PCR反应液Table1.2：TheRT-PCRreactionliquidforNoV（GGI）basedonafragmentoftheCapsidregion试剂体积（μL）ddH2O14.53Buffer2.50dNTP2.00MgCl22.00G1SKF（浓度10μmol/L）0.66G1SKR（浓度10μmol/L）0.66TaqDNA聚合酶0.15cDNA2.50表1.3：NoVGII基因组Capsid区域基因片段RT-PCR反应液Table1.3：TheRT-PCRreactionliquidforNoV（GGII）basedonafragmentoftheCapsidregion试剂体积（μL）ddH2O14.53Buffer2.50dNTP2.00MgCl22.00GoG2F（浓度10μmol/L）0.66G2SKR（浓度10μmol/L）0.66TaqDNA聚合酶0.15cDNA2.50以上为单份样品扩增反应所需各试剂用量，若同时对多份样品进行序列扩增，11 重庆医科大学硕士研究生学位论文可将除cDNA外的其他试剂按样品份数配制，混匀后吸取22.5μL加入八连管，再对应加入2.5μLcDNA，最终配制成25μLPCR反应液。1.3.5.2NoVGI基因组和GII基因组Capsid区域基因片段RT-PCR反应条件，见下表（表1.4）：表1.4：NoV（GGI、GGII）Capsid区域基因片段RT-PCR反应条件Table1.4：TheRT-PCRreactionconditionforNoV（GGI、GGII）basedonafragmentoftheCapsidregion温度时间94℃5min94℃循30s环555℃330s次72℃1min72℃7min4℃终止反应1.3.6NoVRT-PCR产物鉴定1）配胶：取1.05g琼脂糖+80ml0.25TAE，置于微波炉，中火加热3分钟后再室温放置3分钟，倒入凝胶板（含配套的梳子），冷却30分钟，将凝胶放入电泳槽。2）短暂离心PCR产物后，加入4μL6×LoadingBuffer，盖紧盖子后离心震荡，使其充分混匀。3）点样：取4ul上述混合液于凝胶槽孔内，并取1.5ul100bpDNALaddermarker进行对比。4）将电泳槽设定为170mV，90mA，35分钟。5）取出凝胶，置于凝胶成像系统，根据Markert条带判断PCR产物是否NoV阳性，并拍照保存。1.3.7NoV基因测序与分析1.3.7.1NoVPCR阳性产物的序列测定12 重庆医科大学硕士研究生学位论文将未纯化的NoV阳性PCR产物及对应引物送至上海英俊公司进行纯化、测序。1.3.7.2基因型的分析1）用LaserGenev7.1（DNAstar）软件编辑比对基因片段序列，并用NoV基因分型软件（http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/）明确NoV基因型。2）用MEGA5.05邻接法（Neighbor-joining）构建NoV进化树（用ClustalW比对全部序列，Kimura’s2-parameter法进行遗传距离的计算，置信度使用boot-strap，重复检验一千次。所需标准病毒株均选自NCBIGeneBank。1.3.8NoV重组分析1.3.8.1对NoVRdRp区和Capsid区同时进行RT-PCR1）对NoV阳性的cDNA的RdRp区和Capsid区部分基因片段同时进行RT-PCR，具体反应体系，见下表（表1.5）：表1.5：NoVGII基因组RdRp区域及Capsid区域基因片段RT-PCR反应液Table1.5：TheRT-PCRreactionliquidforNoV（GGII）basedonafragmentsoftheRdRpandCapsidregion试剂体积（μL）ddH2O14.53Buffer2.50dNTP2.00MgCl22.00JV12（浓度10μmol/L）0.66G2SKR（浓度10μmol/L）0.66TaqDNA聚合酶0.15cDNA2.50以上为单份样品扩增反应所需各试剂用量，若同时对多份样品进行序列扩增，可将除cDNA外的其他试剂按样品份数配制，混匀后吸取22.5μL加入八连管，再对应加入2.5μLcDNA，最终配制成25μLPCR反应液。2）NoVGII基因组RdRp区域及Capsid区域基因片段RT-PCR反应条件，见下表（表1.6）：13 重庆医科大学硕士研究生学位论文表1.6：NoVGII基因组Capsid区域基因片段RT-PCR反应条件Table1.6：TheRT-PCRreactionconditionforNoV（GGII）basedonfragmentsoftheRdRpandCapsidregion温度时间94℃3min94℃循1min环042℃445s次72℃2min72℃15min4℃终止反应1.3.8.2NoVRT-PCR产物鉴定1）配胶：取1.05g琼脂糖+80ml0.25TAE，置于微波炉，中火加热3分钟后再室温放置3分钟，倒入凝胶板（含配套的梳子），冷却30分钟，将凝胶放入电泳槽。2）短暂离心PCR产物，加入4μL6×LoadingBuffer，盖紧盖子后离心震荡，使其充分混匀。3）点样：取4ul上述混合液于凝胶槽孔内，并取1.5ul100bpDNALaddermarker进行对比。4）将电泳槽设定为170mV，90mA，35分钟。5）取出凝胶，置于凝胶成像系统，根据Marker判断PCR产物是否NoV阳性，并拍照保存。1.3.8.3NoV基因测序与分析1.3.8.3.1NoVPCR阳性产物的序列测定将未纯化的NoV阳性PCR产物及对应引物送至上海英俊公司进行纯化、测序。1.3.8.3.2基因型的分析1）用LaserGenev7.1（DNAstar）软件编辑比对基因片段序列，明确NoV基因型。14 重庆医科大学硕士研究生学位论文2）用MEGA5.05邻接法（Neighbor-joining）构建NoV进化树（用ClustalW比对全部序列，Kimura’s2-parameter法进行遗传距离的计算，置信度使用boot-strap，重复检验一千次。所需标准病毒株均选自NCBIGeneBank。3）利用SimPlot3.5.1软件对随机选取的不同型重组序列进行鉴定。1.4统计学分析应用SPSS22.0和Excel进行统计学分析，采用卡方检验或Fisher’s精确检验进行率的对比，P＜0.05提示差异有统计学意义。2结果2.1NoV检出情况在2015年1月份至12月份期间总共收集并检测粪便标本485份，NoV总检出率为10.7%(52/485)，其中NoVGII型52例，无NoVGI型检出。其中3、4、6月无NoV阳性检出，8、9、10月为NoV检出高峰，在25.0%-34.4%之间，在5月份有一个小的检出高峰（13.3%），不同月份之间的检出率差异具有统计学意义（χ2=41.514，P＜0.05），详见图2.1。所有被检患儿中男性占279例，女性206例，男女比例1.4:1，其中NoV阳性男性患儿36例，占12.9％（36/279），女性16例，占7.8％（16/206），男女之间的检出率差异不具统计学意义（χ2=3.266，P＞0.05）。NoV检测阳性的患儿年龄分布从1月龄至85月龄不等，对其按年龄不同分为7组，发现7～12月龄患儿所占比例最大（46.1%），其余依次为12～18月龄（21.2%）、0～6月龄（13.5%）、19～24月龄（7.7%）、25～36月龄（5.8%）、37～60月龄（3.8%）、大于60月龄（1.9%）。其中7至12月龄组NoV检出率最高，为14.5%（24/116），低于6月龄患儿NoV检出率最低，仅为6.9%（7/101），详见图2.2、表2.1。NoV阳性患儿大便性状多为水样便，腹泻持续1-12天不等，其中腹泻3天以内就诊的占55.8%（29/52），7天以内占88.5%（46/52)。其中23.1%（12/52）患儿仅有腹泻表现，65.4%（34/52）的患儿伴随程度不一的呕吐，多持续1到3天。26.9%（14/52）患儿有发热，其中有2例为高热（39.5℃、40.5℃），其余均为中低热。15 重庆医科大学硕士研究生学位论文此外，还有38.5%（20/52）的患儿伴随咳嗽、流涕等呼吸道症状。表2.1：2015年重庆地区儿童NoV性胃肠炎年龄分布Table2.1：ThedetectionrateofNoVbyagegroupinChongQing,2015年龄组（月）总例数NoV阳性例数NoV检出率（%）NoV阳性累计构成比（%）0～610176.913.57～121662414.559.613～18113119.780.819～244349.388.525～363438.894.337～6020210.098.1＞608112.5100合计4855210.7--16 重庆医科大学硕士研究生学位论文图2.1：2015年重庆地区儿童NoV性胃肠炎月份分布Fig2.1：ThedistributionofNoVgastroenteritisbymonthinChongQing,2015图2.2：2015年重庆地区儿童NoV性胃肠炎年龄组构成比Fig2.2：ThedistributionsofNoVgastroenteritisbyagegroupinChongQing,201517 重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2NoV基因型分析485份急性胃肠炎患儿标本基于Capsid区域部分基因PCR扩增后有52份在387bp左右有特异性条带出现，且均基因测序成功。通过NoV基因分型软件对测得序列分型，共分为4种基因型，分别为GII.4Sydney2012型27例（51.9%），GII.3型16例（30.8%），GII.6型5例（9.6%），GII.7型2例（3.8%），GII.17型2例（3.8%）。对比发现GII.4Sydney仍在多数月份中占明显优势，但在1月、5月、12月GII.3基因型成为优势流行株，GII.6基因型主要在秋冬季检出，GII.7仅在9月、11月检出，GII.17分别在9月、12月各检出1例（图2.3）。将测得序列与Genebank下载的NoV标准序列进行比对构建进化树并分析其同源性，发现52株基因序列同源性在42%-100%之间，为方便观察，进化树仅列取出各基因型代表株（图2.4）。统计发现，GII.3基因型NoV感染患儿中62.5%有呼吸道症状，仅29.6%的GII.4基因型NoV感染患儿有呼吸道症状（χ2=4.460，P＜0.05），50%GII.3以及14.8%GII.4基因型NoV感染的患儿有发热（χ2=6.182，P＜0.05），不同基因型之间症状的差异具有统计学意义。图2.3：NoV基因型的月份分布Fig2.3：thedistributionofNoVgenetypesbymonthin2015,Chongqing18 重庆医科大学硕士研究生学位论文图2.4：2015年重庆地区NoV按Capsid区分型构建系统进化树Fig2.4:ThephylogenetictreeofCapsidregionofNoVin2015,Chongqing19 重庆医科大学硕士研究生学位论文2.3NoV重组分析同时对52份NoV阳性标本RdRp区域和Capsid区域部分基因进行PCR扩增，1111bp左右均有特异性条带出现，全部送基因测序，其中有18例因产物浓度过低而测序失败，另外34例测序成功。通过NoV基因型分析软件发现有5种不同基因型，包括GII.e/GII.421例（21/34），GII.12/GII.39例（9/34），GII.7/GII.62例（3/43），GII.7/GII.71例（1/34），GII.17/GII.171例（1/34），将测得序列与Genebank下载的NoV标准序列进行比对构建进化树（见图2.5）。在RdRp区域和Capsid区域基因型不一致的共32例，考虑重组可能。为进一步明确不同区域基因分型不一致，是因NoV重组引起还是由不同病毒混合感染造成，随机选取3种重组类型各1例作为代表株通过SimPlot3.5.1软件对基因序列进行分析鉴定，结果如下：选取CQNV0906|2015|CHN作为GII.e/GII.4的重组代表株，KJ143754.1和HM802553.1作为重组参考序列选择，将基因序列输入SimPlot3.5.1进行比较，发现在RdRp区CQNV0906|2015|CHN与KJ143754.1一致性很高，但在capsid区与KJ143754.1的一致性急剧降低，相反的是，CQNV0906|2015|CHN与HM802553.1在RdRp区一致性相对较低，而到capsid区时一致性则急剧升高，报告提示重组位点位于681bp左右，由此表明CQNV0906|2015|CHN的基因序列是由两种不同型别的基因片段交换重组而来，同时CQNV0906|2015|CHN的基因序列与已知的GII.e/GII.4重组株KJ196293.1一致性达98.5%，由此可见，CQNV0906|2015|CHN为GII.e-GII.4的重组株，而不是由病毒混合感染造成（见图2.6-a）。选取CQNV1105|2015|CHN作为GII.12/GII.3的重组代表株，KJ196294.1和JX439787.1作为重组参考序列选择，将基因序列输入SimPlot3.5.1进行比较，发现在RdRp区CQNV1105|2015|与KJ196294.1一致性很高，但在capsid区与KJ196294.1的一致性急剧降低，相反的是，CQNV1105|2015|与JX439787.1在RdRp区一致性相对较低，而到capsid区时一致性则急剧升高，报告提示重组位点位于721bp左右，由此表明CQNV1105|2015|的基因序列是由两种不同型别的基因片段交换重组而来，同时CQNV1105|2015|的基因序列与已知的GII.12/GII.3重组株KR007958.1一致性达98.0%，由此可见，CQNV1105|2015|为GII.12-GII.3的重组株，而不是由病毒混合感染造成（见图2.6-b）。20 重庆医科大学硕士研究生学位论文选取CQNV11104|2015|CHN作为GII.7/GII.6的重组代表株，KJ196295.1和AB818402.1作为重组参考序列选择，将基因序列输入SimPlot3.5.1进行比较，发现在RdRp区CQNV11104|2015|CHN与KJ196295.1一致性很高，但在capsid区与KJ196295.1的一致性急剧降低，相反的是，CQNV11104|2015|CHN与AB818402.1在RdRp区一致性相对较低，而到capsid区时一致性则急剧升高，报告提示重组位点位于681bp左右，由此表明CQNV11104|2015|CHN的基因序列是由两种不同型别的基因片段交换重组而来，同时CQNV11104|2015|CHN的基因序列与已知的GII.7/GII.6重组株KM267742.1一致性达97.5%，由此可见，CQNV11104|2015|CHN为GII.7-GII.6的重组株，而不是由病毒混合感染造成（见图2.6-c）。图2.5.2015年重庆地区对NoVRdRp区域和Capsid区域构建系统进化树Fig2.5:ThephylogenetictreeofRdRpregionandCapsidregionofNoVin2015,Chongqing21 重庆医科大学硕士研究生学位论文图2.6-a：CQNV0906|2015|CHN（GII.e/GII.4）的重组分析Fig2.6-a:TherecombinationresultsofCQNV0906|2015|CHN(GII.e/GII.4)bysimplot图2.6-b：CQNV1105|2015|CHN（GII.12/GII.3）的重组分析Fig2.6-b:TherecombinationresultsofCQNV1105|2015|CHN(GII.12/GII.3)bysimplot图2.6-c:CQNV11104|2015|CHN（GII.7/GII.6）的重组分析Fig2.6-c:TherecombinationresultsofCQNV11104|2015|CHN(GII.7/GII.6)bysimplot22 重庆医科大学硕士研究生学位论文3讨论急性胃肠炎是仅次于呼吸道感染的影响全球儿童健康第二大病因，而病毒是其主要发病因素，随着轮状病毒疫苗的普及，诺如病毒在其中的地位愈发重要。本研究主要通过对2015年1月至12月期间重庆地区疑似急性病毒性胃肠炎儿童的粪便标本进行检测，了解当地儿童诺如病毒感染情况及临床表现，基因分型及基因重组情况。研究发现2015年重庆地区NoV检出率为10.7%，相比于2012年的21.9%，2013年的15.6%，以及2014年13.1%均低[4-6]，但与河南地区2012-2014年的11.4%相仿[7]。本研究发现NoV流行高峰在夏秋季（8-10月），与往年重庆地区NoV的检出高峰一致[4-6]，在一定程度上能说明NV病毒在重庆地区的流行高峰为温度较高的8-10月。且与刘成[8]等人报道的江苏省苏州市流行高峰一致，但较杨翼龙、潘丽峰[9,10]等人报道的广东和上海的流行高峰在秋冬季（尤其10月份）有所提前，而据郭建欣等人[11]报道北京地区NoV流行高峰在夏季（3-6月），吴微[12]等人报道深圳地区NoV流行高峰在3月份至8月份，9、10月份检出率反而最低，刘靓[13]等报道南京部分地区流行高峰为12月至次年2月。在国外，NoV流行季节也有区别，如越南流行高峰主要在8-10月[14]，与本市一致，而加拿大魁北克省NoV主要流行季节在冬季，尤其是2月份[15]。这提示NoV感染有一定的季节流行性，但在不同地域，可能由于环境、气候、饮食生活习惯等的差异，其流行季节不尽相同，了解各地NoV流行趋势有利于对NoV感染的防控。NoV在不同年龄组的检出率不同，本次研究发现低于6月龄的患儿NoV检出率最低，而7-12月龄急性胃肠炎患儿中NoV检出率最高，与国内外多数研究结果大致相符[16]。可能与婴幼儿时期自身免疫系统发育不完善，而从母亲体内及乳汁中得到的抗体也逐渐消耗有关。对所有NoV阳性患儿按年龄组划分，发现其中88.5%患儿年龄在2岁以内，尤其7-12月龄患儿，占检出例数的46.1%，同样符合KayokoShioda[17]等关于全球儿童感染NoV年龄分布的一项MATA分析结果，这一定程度上提示在儿童1岁时进行NoV疫苗接种能预防大约50%儿童感染NoV，而在6月龄时接种则能有效预防80%的儿童感染。儿童感染NoV后主要引起腹泻、呕吐、发热及咳嗽、流涕等呼吸道症状，其23 重庆医科大学硕士研究生学位论文腹泻性质与其他病毒性腹泻无明显差别，多为水样便，本研究统计发现NoV阳性患儿中65.4%有呕吐表现，26.9%患儿有发热，38.5%的患儿伴随呼吸道症状。本次研究还发现GII.3基因型NoV较GII.4基因型感染的患儿更易引起发热和呼吸道症状，但这并未在以往的研究中报道，临床表现的不同与基因型之间的是否存在一定的关系尚需更大量的数据证实。不同报道中NoV感染后腹泻持续时间、伴随症状以及严重程度不尽相同，甚至有部分人群感染NoV后并无临床表现[18-20]，这可能与宿主自身的免疫功能以及感染途径有关，或许我们可以通过提高宿主自身的免疫功能减轻NoV感染症状甚至一定程度上预防感染。目前NoV分型主要根据Capsid区域基因序列，本次研究共检出5种NoV基因型，包括GII.3、GII.4Sydney2012、GII.6、GII.7、GII.17，其中其中GII.4占NoV阳性的51.9%，为2015年重庆地区NoV优势流行株，与国内外报道一致[21-23]。自1996年以来，GII.4成为全球的主要流行株，并不断有新的变异株出现，每2-3年引发大规模流行。NoVGII.4Sydney变异株于2012年3月首次在澳大利亚被检出命名，其后在国内外多处相继被报道并广泛流行[24-26]。同年8月在重庆首次被检出，并在之后逐渐取代GII.42006b、GII.4NewOrleans成为优势流行株[4]。2013年和2014年重庆地区无GII.4Sydney以外的其它GII.4变异株报道，与本研究检测结果一致[5，6]。GII.3基因型在冬季成为优势流行株，与2014年全年散发不同，但与赵进[5]报道的GII.6基因型主要在秋冬季流行相符，2008-2012年、2014年在重庆地区均有GII.6基因型检出。GII.7基因型仅在9月、11月检出，往年重庆地区也有该基因型检出[4,27,28]，说明GII.6和GII.7这两种基因型持续在重庆地区流行。既往GII.17基因型NoV并无广泛流行的趋势，但在2014年11月至2015年2月期间于广东、江苏、浙江等地陆续暴发数起GII.17基因型感染[29-31]，且在台湾、日本[32,33]亦有相关报道，GII.17亦在欧洲及澳洲部分国家散发流行[34,35]。GII.17基因型菌株在重庆地区首次于2014年9月被检出，并成为去年11月份的优势流行株。尽管本研究仅在9月、12月各检出1例GII.17基因型菌株，而1-3月份并未有GII.17检出，并无GII.17暴发的直接证据，可能是由于地域的区别，但亦不除外是由于样本数量限制而导致疫情监测的不准确，故仍需长期对NoV基因型进行监测。目前研发的疫苗主要针对GII.4基因型，了解NoV基因型的流行情况对NoV疫苗的临床应用具有重要的指导意义。24 重庆医科大学硕士研究生学位论文NoV主要通过基因重组、抗原漂移以及人群免疫选择形成新的病毒株，可能造成广泛流行。NoV基因重组主要发生在ORF1和ORF2的重叠区，以致RdRp区和Capsid区产生不同的基因型。自1999年JiangX等人发现第一例NoV重组株以来，不断有新的重组基因型被报道，目前全球流行的重组株主要包括GII.e/GII.4Sydney、GII.12/GII.3、GII.PNA/GII.3、GII.4/GII.3[36-40]。本次研究检测出GII.e/GII.4Sydney、GII.12/GII.3和GII.7/GII.63种重组株，其中GII.e/GII.4Sydney（65.6%）、GII.12/GII.3（28.1%）为2015年重庆地区流行的主要重组株，在北京、上海、江苏等地均有报道。统计既往数据发现以往GII.4基因型少见重组株，但自2012年冬季以来GII.e/GII.4Sydney逐渐成为优势重组株。GII.12/GII.3主要在中国、日本、韩国以及澳大利亚地区流行[26,41-45]，在重庆地区2011年至2014年均有检出[4-6,41]，提示近5年GII.12/GII.3重组株持续在重庆地区流行。GII.7/GII.6在2012年和2014年均有散发报道[4,6]。2015年重庆地区NoV流行以重组株为主，基因的重组给病毒分类造成一定困难，并且可能使NoV抗原性发生改变，从而逃避人群免疫，也加大了有效疫苗研发的难度。结论诺如病毒是重庆地区儿童病毒性胃肠炎的常见病原。其流行高峰主要集中在8-10月，发病年龄以低于2岁的婴幼儿为主(88.5％)，其中7-12月龄为NoV检出率最高的年龄组。NoV基因型别多样，且重组现象明显，GII.e/GII.4Sydney2012、GII.P12/GII.3、GII.P7/GII.6、GII.P7/GII.7、GII.P17/GII.17为2015年重庆地区的主要流行株。参考文献[1]O'BrienSJ,DonaldsonAL,Iturriza-GomaraM,etal.Age-SpecificIncidenceRatesforNorovirusintheCommunityandPresentingtoPrimaryHealthcareFacilitiesintheUnitedKingdom[J].JInfectDis,2016,213Suppl1:S15-8.[2]McFaddenN,BaileyD,CarraraG,etal.Norovirusregulationoftheinnateimmuneresponseandapoptosisoccursviatheproductofthealternativeopenreadingframe4[J].PLoSPathog,2011,7(12):e1002413.25 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重庆医科大学硕士研究生学位论文文献综述诺如病毒致病机制的相关研究进展诺如病毒（Noroviurs,NoV）是引起儿童腹泻的重要病原（仅次于轮状病毒），全世界每年大约有64000例NoV感染患者需住院治疗，在发展中国家，每年平均有超过200000儿童死于NoV感染[1]，造成了巨大的社会医疗负担。近年，随着诺如病毒检测技术的不断提高[2]，国内外学者对其流行病学特点及亚基因分型有了更深入的研究，但因其难以体外培养且缺乏合适的动物感染模型，NoV与宿主之间相互作用的研究仍进展缓慢。本文综述诺如病毒受体及人体对其免疫应答的相关研究进展，为临床诊疗提供参考。1诺如病毒感染临床表现在健康成人，NoV感染病程较短、临床表现相对较轻，1-2天潜伏期后即出现1-2天呕吐、腹泻，部分伴恶心、腹痛、低热，多数经治疗预后良好。婴幼儿病程较长、临床表现相对较重，老年人感染NoV严重者甚至威胁生命。除了急性胃肠炎，人NoV还可导致严重的肠道疾病,包括坏死性小肠结肠炎，感染后肠易激综合症，甚至有研究显示NoV感染可引起病毒性脑病[3]，且与婴幼儿良性惊厥有关[4]。值得一提的是，据报道，将近20%造血干细胞或肾移植术后患者有长达1-2年的诺如病毒感染病史[5，6]。而在免疫功能不全或者移植后患者中，NoV感染临床表现重、持续时间长，若不及时治疗可有生命危险[7]，故需引起临床医生足够重视。2病毒样颗粒和P颗粒NoV为单股正链小RNA病毒，基因全长约7.5kb，包含3个ORFs，其中ORF2编码的衣壳蛋白VP1，由内部的S区和向外突起的P区组成，P区被认为是与人类组织血型抗原（HBGAs）的结合部位。在杆状病毒表达系统中，VP1可自动形成病毒样颗粒（VLPs），其形态结构、抗原性及免疫原性与天然病毒接近，但其表达VLPs成本高，耗时长并且产量低，极大的限制了其应用范围和前景。在大肠杆菌表达系统中，P区24聚体P颗粒，其免疫原性、与HBGAs结合方式及亲和性30 重庆医科大学硕士研究生学位论文与VLPs类似，且其操作相对简单，表达周期短，越发受到研究人员重视。由于人类诺如病毒无法体外培养，VLPs和P颗粒对研究Hu-NoV与宿主相互作用及疫苗的研发起着至关重要的作用。3诺如病毒受体2002年Hutson等首次提出HBGAs可作为NoV的病毒受体，并在此后的研究中得到证实。HBGAs是一类复杂的碳水化合物，可存在于红细胞、呼吸道、生殖泌尿系和消化道粘膜上皮细胞的表面或游离于体液中。由于HBGAs受多对等位基因调控，且其抗原基因沉默及基因复制，故HBGAs具有高度多态性。在消化道黏膜上皮表现为ABH和Lewis抗原，分别与红细胞表面的分泌型（A、B、O血型）与非分泌型对应。岩藻糖转移酶FUT1（H基因）和FUT2（Se基因）均可作用于H前体物质，但FUT1表达于造血干细胞，FUT2主要表达于黏膜上皮细胞，其产物可分泌到周围的分泌物中，如唾液和乳汁。Lewis（Le）抗原主要在FUT3、FUT2共同作用下表达。将近5%白种人FUT3等位基因为纯合子隐性，不表达Lea和Leb，被称为Lewis阴性（Le-）。有效的FUT2表达者唾液或其它分泌物中存在H、Leb、A或B抗原，即分泌型（Se+），将近20%欧洲人Se基因G428A发生突变，不能编码有活性的FUT2，黏膜表面及分泌物中缺乏HBGAs，被称为非分泌型（Se-）。有趣的是，MurakamiK等人提出GII.6VLPs黏附人类Caco-2细胞不依赖于HBGAs，而是与细胞成熟度有关[8]，Huang[9]等在研究HBGAs与受体结合模式过程中亦发现菌株（如VA115、DSV）不与人HBGAs结合，提示除了NBGAs以外是否存在其他未知物质可作为NoV受体或共受体，仍需进一步研究。4NoV与HBGAs的结合模式在体外实验中，NoVVLPs可结合H抗原，可使A型、AB型和O型红细胞凝集，也可绑定于分泌型个体的肠粘膜上皮细胞，而对于B型红细胞的凝集作用相对较弱。基于NoV的多基因型及HBGAs的多态性，目前发现了至少8种NoV与HBGAs相互结合模式，可归纳为分泌型结合型（A/B结合型）和非分泌型结合型（Lewis结合型）2大类：。有研究发现GI.1VLPs只与A、AB或O型分泌型唾液结合[9]，而GII.4VLPs可与所有ABO(H)血型分泌型唾液结合[10]，这可能是GII.4基因型NoV广泛流行的原因之一。31 重庆医科大学硕士研究生学位论文过去认为非分泌型可抵抗NoV感染，但近年相继有非分泌型检测出NoV感染。两起GI.3爆发事件得出22名非分泌型志愿者和90名分泌型志愿者中分别有有11名（50%）和46名（51%）感染[11]。另有一项调查研究发现，94名小于3岁幼儿中，GII4型NoV仅感染分泌型患儿，GII4以外的其他基因型NoV则主要感染非分泌型患儿，也有散发的非分泌型GII.4型和GII.2型NoV感染，这都说明这种抵抗是不完全的[12]。5NoV感染宿主的免疫应答在感染过程中肠上皮结构始终保持完整，但有组织病理学变化，如小肠绒毛变粗变钝。而一过性脂肪、乳糖吸收不良可能与微绒毛缩短及刷状缘活性酶的减少有关。有研究显示NoV感染志愿者有明显的胃排空延迟，可能与胃运动机能异常有关[13]。目前，HuNoV感染的病理基础尚不明确，但可以推断，NoV导致腹泻主要是通过改变胃肠道的吸收和分泌功能，而不是通过破坏肠壁结构。固有免疫在抵抗NoV原发感染方面起着重要作用。体外试验中，鼠诺如病毒（MNV）在M细胞辅助下通过转吞胞作用穿透肠上皮细胞，在黏膜固有层抗原递呈树突状细胞和巨噬细胞中进行复制[14]，WardJM等也在MNV感染小鼠体内树突状细胞和巨噬细胞中检测到MuNoV抗原。虽然未在巨噬细胞和树突细胞中发现Hu-Nov复制，但HuNoV感染者肠组织活检时发现黏膜固有层细胞中有病毒抗原检测出，且灭活病毒可黏附在小肠组织切片的固有层细胞，此外，HuNoV感染黑猩猩和免疫缺陷小鼠实验时分别能从肠道树突状细胞和巨噬细胞中检测出病毒抗原，仍支持肠道免疫细胞是HuNoV的靶细胞[15-18]。IRF-3、IRF-7作为抗病毒免疫反应主要发起者，可诱导I型干扰素（IFN-α/β）在原始巨噬细胞和树突细胞的免疫反应，但并不影响其抗病毒疗效[19]。ChangotraH等用经I型IFN（IFN-α/β）和II型IFN（IFN-γ）预处理的树突细胞和巨噬细胞感染MNV，发现IFN-α/β和IFN-γ可通过不同途径抑制病毒非结构蛋白的合成及稳定性抑制病毒复制[20]。除了干扰素以外，仍有其他细胞因子参与炎症反应，如IL-10可预防肠道炎症和黏膜屏障的破坏，而这种炎症反应又与肠道菌群相关[21]。ChachuKA[22]等将B细胞缺陷的小鼠和野生型小鼠用以MNV感染实验，发现口服接种MNV后3-5天，B细胞缺陷小鼠回肠末端MNV滴度明显高于野生型小32 重庆医科大学硕士研究生学位论文鼠，而7天后，两者无明显差异，这可能与肠粘膜分泌的sIgA有关。但在肠系膜淋巴结中，B细胞缺陷小鼠MNV滴度始终高于野生型小鼠，甚至3周后仍保持较高水平。而植入多克隆抗体或单克隆抗体后，B细胞缺陷小鼠能部分清除体内MNV，由此可推断B细胞及其合成分泌的特异性抗病毒抗体在抗NoV感染中发挥了重要作用。通过收集检测接种NoV志愿者不同时间点的唾液、粪便和外周血单核细胞中的相应抗体，RamaniS[23]等发现唾液中NoV特异性IgA在2周左右达到高峰，主要影响早期的病毒复制，而胃肠炎发生率及其严重程度与接种前唾液中sIgA含量有关，粪便中IgA含量则影响病毒载量以及排毒持续时间。血清特异性IgG含量对NoV胃肠炎亦有保护作用，且在首次感染后可维持超过6个月的高水平，能对机体产生保护性免疫，但对不同基因型无长期交叉免疫力。CD4+T细胞主要通过分泌细胞因子并激活B细胞产生抗体抑制的病毒复制，而CD8+T细胞则通过结合MNV衣壳蛋白的抗原表位P1区清除病毒[24]。有研究证明，CD4+T细胞对NoV再发感染有一定保护作用，但KocherJ等人在接种GII.4P颗粒的无菌猪体内发现调节性T细胞反应，而这种反应可能下调效应T细胞反应，并且抑制记忆细胞的产生，使机体无法维持长期的保护性免疫[25]。而病毒本身也可通过次要结构蛋白（VP2）调控抗原呈递细胞（APC）的成熟和细胞因子产生逃避适应性免疫，这种免疫逃避可能与初次感染的病毒毒力有关[26]。6治疗现状目前临床上仍没有针对NoV的特异性抗病毒药物，大量动物实验发现通过破坏或降低NoV蛋白酶、RNA依赖RNA酶（RdRp）的活性可抑制病毒复制，如优化3CL蛋白酶抑制剂能降低小鼠肠道内MNV滴度[27]，核苷酸类似物，能抑制RdRp减少病毒RNA的复制。有趣的是KoromyslovaAD等发现柠檬酸可改变VLPs的形态结构，增强抗体结合P区域的能力，此外还能与NoV竞争性结合NBGAs[28]。尽管抗病毒药物在动物NoV感染中取得可喜的成绩，但其毒性的检测及在人体的应用尚待进一步研究。基于VLPs和P颗粒研发的NoV疫苗部分已进入临床实验阶段，但由于其主要针对同源性的病毒株，应用较局限。7总结与展望NoV作为引起儿童腹泻仅次于轮状病毒的重要病原，近年关于其发病机制及33 重庆医科大学硕士研究生学位论文预防、治疗措施的研究愈发激烈。人类感染诺如病毒的临床表现视年龄、免疫功能等不同差异颇大，对婴幼儿、老年人等免疫力低下人群、免疫功能不全及移植后患者应格外重视。宿主自身免疫对抵抗诺如病毒起关键性作用。显然疫苗对于诺如病毒感染的预防相当重要，目前部分疫苗的研发也已进入了临床实验阶段。但由于物种差异，NoV基因型复杂，且不断进化，极大的限制了疫苗的实用性。基于VLPs及P颗粒可与HBGAs结合，通过研究NoV与受体结合方式及其亲和性可为疫苗的进一步研发提供方向，而通过了解机体对NoV的免疫应答也可猜想和验证疫苗诱发免疫抵抗NoV感染的途径，以期不断改良。总而言之，虽然NoV难以体外培养且缺乏合适的动物感染模型，相关研究仍取得可喜成果，相信在不久的将来，NoV的发病机制及防治措施将取得长足进展。参考文献[1]RobilottiE,DeresinskiS,PinskyBA.Norovirus[J].ClinMicrobiolRev,2015,28(1):134-64.[2]FarkasT,SinghA,LeGFS,etal.Multiplexreal-timeRT-PCRforthesimultaneousdetectionandquantificationofGI,GIIandGIVnoroviruses[J].JVirolMethods,2015,223:109-14.[3]ObinataK,OkumuraA,NakazawaT,etal.Norovirusencephalopathyinapreviouslyhealthychild[J].PediatrInfectDis,2010,29:1057-59.[4]ChenS-Y,TsaiC-N,LaiM-W,etal.Norovirusinfectionasacauseofdiarrhea-associatedbenigninfantileseizures[J].ClinInfectDis,2009,48:849–55.[5]RoddieC,PaulJP,BenjaminR,etal.Allogeneichematopoieticstemcelltransplantationandnorovirusgastroenteritis:apreviouslyunrecognizedcauseofmorbidity[J].ClinInfectDis,2009,49(7):1061-8.[6]SchornR,HöhneM,MeerbachA,etal.Chronicnorovirusinfectionafterkidneytransplantation:molecularevidenceforimmune-drivenviralevolution[J].ClinInfectDis,2010,51(3):307-14.[7]GreenKY.Norovirusinfectioninimmunocompromisedhosts[J].ClinMicrobiolInfect,2014,20(8):717-23.34 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重庆医科大学硕士研究生学位论文致谢时光荏苒，如白驹过隙，论文的完结，意味着大学七年即将过去，几多挫折几多彷徨，幸得众多老师、亲人、朋友的帮助和支持，在此谨向所有关心、爱护和帮助我的人们表示最诚挚的感谢。首先，感谢我敬爱的的导师许红梅教授，您严谨的治学态度、渊博的专业知识、精湛的医术、高尚的医德和朴实无华、平易近人的人格魅力是我终身学习的楷模。本论文从选题、实验设计到论文完成，每一步都倾注了您大量的心血，在此向您表示诚挚的谢意。感谢重庆医科大学儿科学院各轮转科室以及实验室的老师在我临床实践及实验中的指导和帮助。由衷感谢我的室友、朋友们在生活、学习上对我的关心和支持，感谢这一路上有你们的陪伴。最后衷心的感谢含辛茹苦养育我长大的爸爸妈妈，你们的爱和理解一直是我坚强的后盾，我爱你们。陈岑谨致2016年4月5日重庆医科大学37 重庆医科大学硕士研究生学位论文攻读硕士学位期间论文发表情况[1]陈岑,许红梅.诺如病毒致病机制的相关研究进展.儿科药学杂志.（待发表）38