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学校代码10459学号或申请号201322161951密级公开专业硕士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP3截短蛋白的原核表达及T细胞表位的初步筛选作者姓名：车志芬导师姓名：张改平院士专业学位名称：生物工程培养院系：生命科学学院完成时间：2016年4月 Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMaster（doctor）ProkaryoticExpressionandPreliminaryScreeningofT-cellEpitopesintruncatedProteinGP3ofTheBJ-4strainsofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusByZhifenCheSupervisor:Academician.GaipingZhangMajor:CellBiologySchoolofLifeSciencesApril,2016 学位论文原创性声明立进行研本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在巧师的指巧Ｔ，独究所取得的成果，本论义不包含任何其他个人。除文中已经注明引用的巧容外或集体己经发表或撰写过的科硏成果。对本文的研巧作出重耍贡献的个人和集。，均已在文中明确方式标明体。本声明的法律贵任山本人承化学位论义作者：Ｕ日別：年月日学位论文使用授权声明，知识产权归屈郑州大学本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品。根据郑州大学有关保留，使用学位论文的规定，同意学校保巧或向国家有关部口或化构送交论文的复印件和电子版，允许论文被酱阅和借阅；本人授权郑州大学可＾＾，可臥采用影印、＾将本学位论文的全部或部分编入巧关数据库进巧检崇缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文、使用学。本人离校后发衷一位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成巧时，第署名单位仍然为郑州大学。保密论义在解密后应避守此规定。学位论义作者：＾日期：年月口０Ｗ心－立Ｚｐ． 摘要猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespirationSyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病，其主要特征是引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎和仔猪呼吸困难等。由于其引起免疫抑制和继发性感染，再加上生产上所用的PRRSV疫苗免疫效果不佳或无免疫保护作用，所以PRRSV一直是严重危害养猪业的重要病原之一。而前人的研究结果表明，激发机体T细胞免疫反应有利于抑制PRRSV复制或者控制PRRS疫情，而由PRRSV结构蛋白GP3诱导的T细胞免疫反应具有良好的免疫保护效果。因此筛选GP3蛋白的T细胞表位，并在此基础上，研发预防或治疗PRRSV的分子药物，这对PRRSV的防控意义重大。本实验首先根据GenBank中PRRSVBJ-4ORF3的基因序列设计其上下游引物，上下游引物的酶切位点分别是EcoRⅠ和HindⅢ，然后使用RT-PCR的方法扩增ORF3基因全长，长度约765bp，再将其与克隆载体pMD19-T连接并送至生物公司进行测序，以测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF3为模板扩增缺失N末端疏水序列的基因片段tGP3（truncatedGP3），将其亚克隆到pET-32a载体中构建原核表达重组质粒pET-32a-tGP3，然后将其导入大肠杆菌BL21(DE3)内，使用IPTG诱导表达，并通过Western-Blot进行鉴定，结果成功的表达了tGP3重组蛋白，大小约43KDa。接着对重组菌的表达条件进行了优化，使其能更高效的表达，同时也对重组蛋白进行可溶性分析，发现它以包涵体的形式存在。于是对重组菌进行扩大培养，并使用尿素梯度法对获得的大量重组蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE电泳分析纯化的目的蛋白的纯度，结果显示蛋白条带单一，即目的蛋白纯度较高。使用ELISA方法，将纯化的重组蛋白与PRRSV阳性血清和阴性血清进行反应，发现重组蛋白能很好的与PRRSV阳性血清结合，即获得目的蛋白具有良好的免疫原性。按照9个氨基酸重叠合成总长度为18个氨基酸的方法，将截短的GP3蛋白分成24个肽段并交予生物公司合成，将合成的肽段按照3-5个为一组分成5个肽库。将纯化的tGP3重组蛋白对4-6周龄的Balb/c小鼠进行免疫，并设立0M尿素对照组。共免疫4次，第四次免疫之后1星期，对两组小鼠剪尾采血，通过ELISA方法，检测血清中抗tGP3蛋白多抗血清的效价，发现纯化的tGP3重I 组蛋白能够强烈的激起小鼠的体液免疫。接着分别取出多抗血清效价较高的和0M尿素组多抗血清效价较低的小鼠的脾脏并分离获得淋巴细胞，每组肽库中的肽段均以20μg/ml的终浓度进行体外刺激，24h后，收集细胞上清，按照IFN-γELISA试剂盒操作说明，检测阳性鼠、阴性鼠细胞因子IFN-γ的分泌情况，结果显示肽库3和肽库5对应的阳性鼠的OD450值分别是0.339和0.371，是阴性鼠OD450值得2.1倍以上，该实验结果初步表明，纯化的tGP3重组蛋白免疫小鼠之后刺激其产生了细胞免疫，也初步证实了合成的多肽分成肽库时，肽库3和肽库5即GP3蛋白氨基酸序列的120-209aa中含有GP3蛋白的T细胞表位。关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒GP3蛋白原核表达T细胞表位II AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isahighlycontactinginfectiousdisease,andhascausedabortion,stillbirth,mummifiedfetusinthepregnantsowsanddyspneainthepiglets.Italsocaninduceimmunosuppressionandsecondaryinfection.OnthemarkettheattenuatedvaccineandtheinactivatedvaccineisusedcommonlyinresistancetoPRRSV.Buttheirimmuneeffectisnotstableandsecure.SoPRRSVisoneoftheimportantpathogenicinseverelyimpairingthepigindustry.TheresearchshowsthattheTcellimmuneresponsecaninhibitthereplicationofPRRSV.SoscreeningtheTcellepitopeofGP3anddevelopingthemoleculedrugsonthebasisoftheepitopehavethegreatsignificanceforpreventingandtreatingPRRSV.AccordingtotheORF3genefromGenBankPRRSVBJ-4,wedesigneditsforwardandreverseprimerswithEcoRⅠandHindⅢ.The765bpoftheORF3genewasamplifiedbyRT-PCRandwasclonedintothevectorpMD19-T.ThenthetruncatedORF3thatdidnotincludetheNterminalhydrophobicsequenceoftheORF3wasamplifiedbyPCRandfinallyweresubclonedtopET-32a.TherecombinantplasmidpET-32a-tGP3wastransformedintotheE.coliBL21(DE3)andwasinducedbyIPTG.TheinducedexperimentshowedthattherecombinanttGP3wasidentificatedbyWestern-Blotandwasespressedsuccessfullyabout43KDa.TheconditionswereoptimizedtomaketherecombinanttGP3moreefficientexpression.ThenanalysisingthesulobeoftherecombinanttGP3,wefoundtherecombinanttGP3intheformofinclusionbody.Theinclusionbodywaspurifiedbyureagradientmethod,andtheresultofSDS-PAGEshowedthattherewasonlyonebondforthepurityoftargetprotein.FinallytheresultsofELISAshowedthattherecombinanttGP3proteincouldresponsewithPRRSVpositiveserumbutnotresponsewithPRRSVnegativeserum.ItalsoconfirmedthatthetGP3proteinhadgoodimmunogenicity.Accordingtothelengthofeighteenaminoacidsandnineoverlappingmethod,III wedividedthetORF3into24peptidesforthebiologicalsynthesis.Then,thesynthesispeptidesweredividedintofivepeptidelibrariesaccordingto3-5peptidesforeachpool.The4-6weeksBalb/cmicewereinjectedwithpurifiedtGP3protein.Thecontrolgroupinjected0Murea.Thetwogroupswereimmunedforfourtimes.Afteroneweekofthelasttime,werespectivelyobtainedthebloodofthetwogroupsthroughcuttingthemousetail.ByELISAmethod,wetestedthatwhetherserumcontaininganti-tGP3polyclonalantibody.TheresultsshowedthatpurifiedtGP3proteincouldinducestronghumoralimmunity.Thenwetookouttheproteingroupmice’sandthecontrolgroupmice’sspleenandobtainedtheseparatedlymphocytes.Then,thelymphocytesstimulatedwiththepeptidepools,and24hlater,thecellsupermentweretestedbyIFN-γELISAKitbythemanipulatement.TheresultsshowedthattheOD450valueofpeptidelibrary3andpeptidelibrary5was0.339and0.371respectively.AndtheratioofthepositivemiceOD450nmwiththenegativemiceOD450nmwasmorethan2.1.ThisconfirmedthatthepurifiedtGP3proteincouldprovokethecellularimmunityinmice.Italsoillustratedthatinthepeptidelibrary3andpeptidelibrary5oneorseveralpeptidescouldbeGP3proteinofT-cellepitopes.Theamonoacidpositionis120-209aa.Keywords:PRRSVGP3proteinProkaryoticexpressionT-cellepitopesIV 目录摘要.....................................................IAbstract...............................................III1文献综述..............................................11.1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的研究进展..................11.2PRRSV病原学的概述.........................................11.2.1PRRSV形态结构及理化性质......................................11.2.2PRRSV培养特性................................................21.2.3PRRSV发病机制................................................21.3PRRSV分子生物学特征.......................................31.3.1PRRSV基因组结构的特点........................................31.3.2PRRSV基因组所编码的主要结构蛋白..............................31.3.3PRRSV的次要结构蛋白..........................................51.4PRRSV流行病学特征.........................................61.4.1PRRSV的感染..................................................61.4.2PRRSV感染的特点..............................................71.5PRRSV感染后的先天性免疫应答...............................81.6PRRSV感染后的体液免疫应答.................................81.7PRRSV感染后细胞免疫的重要作用.............................91.8PRRSV疫苗的研究现状.......................................91.9GP3对研制新型疫苗的作用..................................111.10T细胞表位的研究方法.....................................111.10.1T细胞表位的研究方法........................................121.10.2T细胞功能试验..............................................13V 1.11研究目的及意义...........................................132PRRSVGP3截短蛋白的原核表达与纯化...................152.1实验材料..................................................152.1.1病毒、血清、载体和菌株.......................................152.1.2主要试剂的配制..............................................152.1.3其他试剂和工具酶.............................................172.1.4主要实验仪器................................................172.2实验方法..................................................182.2.1构建重组质粒pMD19-T-ORF3....................................182.2.2构建原核表达质粒pET-32a-tORF3...............................222.2.3重组蛋白pET-32a-tGP3大肠杆菌中的诱导表达及鉴定..............242.2.4重组蛋白的提取及纯化.........................................262.2.5ELISA鉴定重组蛋白免疫活性...................................262.3结果与分析................................................272.3.1PRRSVBJ-4ORF3基因的扩增以及pMD19-T-GP3双酶切鉴定.........272.3.2截短的ORF3的扩增以及原核表达质粒pET-32a-tGP3双酶切鉴定.....272.3.3重组蛋白的诱导表达与Western-Blot鉴定结果....................282.3.4重组蛋白的可溶性分析及表达条件的优化.........................292.3.5重组蛋白的纯化结果...........................................312.3.6ELISA鉴定结果...............................................312.4讨论......................................................323PRRSVGP3截短蛋白T细胞表位的初步筛选...............343.1实验材料..................................................343.1.1主要材料....................................................343.1.2主要试剂的配制..............................................343.1.3主要实验仪器设备.............................................353.2实验方法..................................................35VI ３：巧．２．１动物化疲方法３．２．２间接化ＩＳＡ检测小齡多抗血祸的效价３６－３７ＥＬＩＳＡＫｉｔｉｒ检测细胞因子３．２．３化用ＩＦＮ丫３９３．３实验结果３自化３：ｉ１．．间接ｉＳＡ法检测小鼠多抗血淸效价的结巧－ＥＬＩＳＡ结４日３．３．２她胞巧子ＩＦＮ丫巧－４０３．４ｉ＾ｉ＾４２４实验结论４３参考文献日日附录英文缩写词汇漱致谢５２日４个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果ＶＩＩ 1文献综述1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的研究进展猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的，它是一种高度接触性传染病，能够引起妊娠母猪后期发生流产、死胎、木乃伊胎以及仔猪咳嗽、呼吸困难、呼[1]吸急促等症状。最初，人们并不能确定该病的病因，因此又将其称为“猪神秘病”、“猪蓝耳病”等。1987年美国首先发生此病，并与1992年分离获得PRRSV[2]病毒，命名为ATCC-VR2332，随后该病迅速传播到世界各个养猪国家，包括[3、4]德国、加拿大、荷兰等，并于1991年由荷兰科学家分离获得病原命名为[5]Lelystad(LV)病毒株。而我国于1991发生此病，其中郭宝清等在1996年从猪[6]样本中检测到PRRSV，从而确定了PRRSV在我国的存在。根据先后在不同地区发现的PRRSV的基因序列和抗原性的差异，人们将PRRSV分成两大类，一类是以LV株为代表的欧洲型即基因Ⅰ型，另一类是以VR-2332株为代表的北美[7][8、9]洲型即基因Ⅱ型，而我国流行的多属于北美洲型。目前PRRSV仍严重威胁着全球养猪业的健康发展，给世界各个养猪国家造成了巨大的经济损失，其[10、11]中以美国为例，该病每年给美国的养猪业造成近5.6亿美元的经济损失，而在我国目前已有20多个省市报道过此病，每年至少有200多万头猪发病，40[12]多万头猪死亡。由于该病带来了严重的后果，因此国际兽疫组织（OfficeInternationalDesEpizooties,OIE）将其列为B类动物传染病。同时该病也引起了世界各国学者的高度重视和研究，如何高效的对PRRSV进行防控也成为了各国学者追求的终极目标。1.2PRRSV病原学的概述1.2.1PRRSV形态结构及理化性质PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA，属于套式病毒目，动脉炎病毒科，[13]动脉炎病毒属。它的外形呈球状，直径约为45-80nm，内由脂质双层膜包围，厚度约4.5nm，且膜表面光滑，核衣壳外呈立方体，直径约为25-35nm，核衣壳1 表面有5nm的突起。该病毒对有机溶剂敏感，如使用乙醚、氯仿处理后可破坏[14]病毒的囊膜和病毒粒子的感染性。PRRSV在氯化铯中的浮密度为1.18-1.20g/ml，在蔗糖中的梯度为1.14-1.15g/ml。在潮湿的环境下PRRSV能很好的生存，而在干燥的条件下会快速失去感染性。PRRSV对pH敏感，pH值大于7或小于5，感染性会大幅度降低，对碱的耐受性差，当PH值在6.5-7.5之间[15]时最适保存。PRRSV的热稳定性也极差，在56℃处理40min就可以将其灭活，在37℃放置24h左右或21℃放置数天，该病毒的滴度也会成倍下降，而在-70℃[16]时，病毒可在感染滴度不受影响的情况下保持4个月以上，而在-20℃病毒感[17]染力只可维持数月，4℃时病毒感染力只可维持一周左右。Jusa等于1996年报道，PRRSV可与小鼠的红细胞发生凝集作用，且肝素可影响PRRSV的血凝[18]活性。1.2.2PRRSV培养特性PRRSV的培养相对严格，具有宿主特异性。只能在巨噬细胞中复制，包括肺泡巨噬细胞PMA，外周单核细胞等，而在常用的原代和传代细胞中不能生长，且能使细胞显著的产生病变。其中在巨噬细胞中，PRRSV更容易在PMA细胞中增殖，并且病毒在不同的细胞中能够表现出不同的症状，其主要特征为细胞[19、20]圆缩与溶胞，最终细胞会逐渐脱落。不同的病毒适合在不同的细胞上生长，一般的毒株在PMA上都有很好的适应性，且毒量和滴度都较高，而研究表明CL2621和Marc-145细胞更有利于美洲型PRRSV的复制，欧洲型毒株更适合在PMA中生长。而扁桃体、脾、鼻甲等组织内的单核细胞和睾丸内的精子细胞也是PRRSV的敏感区，在敏感的细胞内PRRSV只能在细胞浆中生存，而我们通过免疫过氧化物酶单层细胞试验和免疫荧光等，可在细胞浆中检测到该病毒。1.2.3PRRSV发病机制PRRSV的侵染方式首先与猪肺泡巨噬细胞上的受体结合，然后通过内吞作用进入细胞，在肺泡巨噬细胞和肺内皮细胞中复制新的病毒，造成大量肺泡巨噬细胞裂解。随着细胞的崩溃进入血液循环和淋巴循环，可导致病毒血症及全身淋巴结感染，使血清中和抗体的效果降低而不能高效的清除血液中的病毒，[21]使病毒血症持续存在。另有研究表明PRRSV感染后2h左右，猪肺泡巨噬细胞的吞噬作用增强，但是感染后7d，它的吞噬作用就会明显减弱，也就是杀菌2 [22]能力将下降，这也就为继发病原微生物的感染创造了有利的条件。PRRSV通过呼吸道侵入肺泡的上皮细胞，在其内复制增生，然后再进入肺毛细血管的内皮细胞，刺激其肿大、坏死和脱落，于是造成大面积的肺泡毛细血管受到损害，血液中的还原红蛋白增多，因此临床上表现呼吸困难和皮肤发[23]蓝。病毒随血流到达全身的血管处，引起广泛性出血。同时病毒还可以进入脑各级血管内皮细胞引起广泛性血管炎，引起神经细胞变死，坏死等。病毒在巨噬细胞中复制并破坏其结构，造成脾广泛性死亡和淋巴结严重破坏，致使免疫系统严重受损，机体因心衰，免疫功能丧失而死亡。1.3PRRSV分子生物学特征1.3.1PRRSV基因组结构的特点PRRSV的基因组全长为15kb，含有10个开放阅读框，其中每个阅读框和相邻的有部分重叠，且每个阅读框都编码病毒的蛋白。ORF1由ORF1a和ORF1b组成，占据基因组全长的四分之三，分别编码pp1a和pp1ab两个多聚蛋白，病毒蛋白酶对其切割后可形成14个非结构蛋白（NSP），包括4个蛋白酶（NSP1α、NSP1β、NSP2、NSP4）、RNA依赖性的聚合酶（NSP9）、解旋酶（NSP10）和[24]核酸内切酶（NSP11）等。ORF2-5编码PRRSV的糖基化蛋白，依次命名为GP2-5。ORF6-7分别编码该病毒的基质蛋白M和核衣壳蛋白N。ORF2中又含[25]有一个ORF2b，它能形成非糖基化蛋白GP2b。ORF5中含有一个ORF5a，它编码蛋白GP5a。1.3.2PRRSV基因组所编码的主要结构蛋白PRRSV的主要结构蛋白为核衣壳蛋白N、基质蛋白M和GP5蛋白，它们构成了病毒的主要框架，在病毒的形成、免疫逃避以及抗体产生等方面具有重[26]要的作用。GP5蛋白又叫做E蛋白，分子量约24.5-26KDa，它是PRRSV囊膜的主要组成部分，具有4个糖基化位点，其中在北美洲型和欧洲型毒株之间高度保守的是N-末端的2个，另外N-末端还有一个高度疏水的区域，同时它也是该蛋白[27-29]的前导区。该蛋白3次跨膜且有一段约30个氨基酸的胞外区，它能通过二[30-32][33]硫键与M蛋白的胞外区相联。已有研究报道了GP5蛋白有病毒中和表位，3 [34-36]在北美洲型和欧洲型中都有，且均在GP5蛋白的胞外区，而有些也已经表明了它的位置所在。GP5蛋白在PMA细胞中培养时能诱发它的细胞毒作用，使细胞发生凋亡。且它的凋亡作用不被抗细胞凋亡蛋白Bcl-2抑制，说明它的作用可能存在于Bcl-2的下游或其它未知的凋亡途径。瞬时表达实验也证实了GP5蛋白诱导细胞凋亡的氨基酸位于其N末端的前188个，它的C端对凋亡不起作用。PRRSV不仅使肺部和淋巴细胞产生细胞凋亡，对睾丸内的巨噬细胞等产生[37]的大量生殖细胞也会发生损耗和死亡。M蛋白又称基质蛋白，分子量为18-19KDa，在PRRSV的蛋白中最为保守。同型病毒间氨基酸序列一致性>96%，不同型间也能达到78%-81%。它是非糖基[38]化蛋白，N端同样3次跨膜，且在病毒表面留下一段10-18个氨基酸序列。在[39]PRRSV感染细胞内，也发现了通过二硫键相联的M/M蛋白同源二聚体，但不存在于病毒里面。而LDV的M蛋白与GP5蛋白通过二硫键形成异源二聚体，[40]且二硫键的断裂会降低病毒的感染力。部分北美洲分离株已证实了在感染细胞内有M蛋白和GP5蛋白形成的异源二聚体，推测可能在病毒的组装和出芽过程中起着重要作用。同时M蛋白的免疫原性也很强，在感染后的10d就可以检测到抗M蛋白的抗体，因此人们认为可以将重组的M蛋白作为血清学诊断的靶[41]抗原。M蛋白也是CD4T细胞反应的靶向，可以增多分泌IFN-γ的细胞数目。N蛋白又称核衣壳蛋白，分子量约为14-15KDa，它是PRRSV所有结构蛋白中分子量最小的一个。同型间的N蛋白很保守，序列一致性能达到>96%，但在两型之间也就是北美洲型和欧洲型之间N蛋白的氨基酸序列高度变异，一致性仅为57-64%。在PRRSV感染中，N蛋白的表达量最高，约占病毒总蛋白成[42]分的20-40%，且免疫原性较强。之前也有报道，当使用纯化的PRRSV全病毒免疫老鼠时，产生的单克隆抗体大都为抗N蛋白，但这些抗体没有中和作用，因此将N蛋白与免疫逃避相关联，并参与了抗体依赖性增强（ADE）作用。N蛋白主要在核仁附近的核浆区域发挥作用，且至少有4个单独的功能区，分别是核定位、核仁定位、核输入和胞浆保留域。其中还有一个核定位信号，在病毒的复制中起着重要作用，例如N蛋白的核定位信号可以使N蛋白出现在细胞核内进而发挥它的作用，但N蛋白的核定位信号在细胞核内的定位过程反过来也要受N蛋白高级结构的影响，所以说改变N蛋白C端氨基酸可显著影响到N[43]蛋白的构象。N蛋白不仅给PRRSV的染色体提供了保护外壳，而且在病毒的装配中具有与自己相互作用的高聚合能力。4 1.3.3PRRSV的次要结构蛋白PRRSV的次要结构蛋白有GP2a、GP2b、GP3、GP4和GP5a，除GP2b外它们均为糖基化蛋白，在病毒中所占的比例较低，但在病毒的侵染过程中却十分重要，比如病毒的包装、受体识别等方面。其中次要蛋白GP2a、GP2b、GP3和GP4能以异源多聚体的形式组装到PRRSV病毒中，而它们在病毒的侵染过程中也是十分重要的。也有研究表明，GP2、GP3和GP4蛋白可以与GP5相互作用，它们和受体CD163相结合，在借导病毒侵入受体细胞中发挥着重要作用。[44-45]GP2蛋白由ORF2编码，分子量约为29-30KDa，可能与EAV中Gs相关。北美洲型和欧洲型的GP2蛋白差别较大，不仅疏水峰不同而且糖基化位点也不同。在组装成熟的病毒粒子内GP2蛋白与M、N蛋白比较要少的多，也不和其[46]他蛋白形成多聚体。近年来又在ORF2中发现了新的基因即ORF2b，它编码蛋白GP2b。GP2b分子量约为10KDa，属于非糖基化蛋白，在两型间高度保守，但在PRRSV感染中的作用尚不清楚，只是有研究报道了GP2蛋白的两个抗原表位及其所在的位置，也证实了该表位为非中和性抗原表位。GP3是由ORF3编码，分子量约为42-50KDa，属于高度糖基化蛋白，含有[47-49]7个糖基化位点。GP3蛋白的氨基酸序列是高度可变，在两型中的同源性仅为54-60%，且变异主要集中在N-末端，N-末端的35个氨基酸在两型中的一致性仅为29%，另外北美洲型的GP3蛋白的C-端要比欧洲型的少12个氨基酸，这就造成了两者C-端的性质有所差异，即欧洲型GP3蛋白的C-端是高度亲水，[50-51]而北美洲型表现为即亲水又疏水的两性。虽然有这么大的不同，但是两者GP3含有的7个糖基化位点还是高度保守的。GP3蛋白也具有较强的免疫原性，有研究表明抗GP3的单克隆抗体中具有中和活性。而使用杆状病毒表达载体表达的PRRSVOlot/91ORF产物可以给猪提供68.4%的保护率，这也说明了ORF3[52]的表达产物在抗病毒感染中起着一定的作用。GP4蛋白有ORF4编码，分子量约为31-35KDa，具有4个糖基化位点，N端和C端具有高度的疏水区，有研究表明LV株的GP4蛋白具有抗体中和作用，且鉴定出的中和表位位于其N末端亲水区域（40-79aa），在不同的基因型间是不[53]保守的，美国的加拿大猪场经过实验分析发现有65%的猪能与原核表达的GP4发生反应，Delima(2006)使用肽库扫描技术出了GP4B细胞表位（51-65aa），Oleksiewicz也与欧洲型中筛出了一个线性表位(59-71aa)，周艳君（2005）也在5 GP4蛋白的119-178aa发现了抗原表位等，这些都说明GP4蛋白能够利用宿主细胞组成成分将病毒转运到细胞表面，在病毒的复制起着重要作用。YO(2005)等[54]认为GP4在信号转导和介导脂质双漂移中也发挥作用。1.4PRRSV流行病学特征1.4.1PRRSV的感染[55]PRRSV最易感染的动物是猪，特别是怀孕的母猪和仔猪，且更容易在猪-5-6的肺泡巨噬细胞（PMA）中复制，病毒滴度达到10-10，PRRSV是一种有囊膜的病毒，它是凭借受体介导的内吞作用进入细胞的，并且能够引起细胞产生病变。而将PRRSV的基因转到非允许细胞中发现，病毒基因虽然可以复制，但是不能产生子代病毒，这与其感染的细胞表面的受体相关，因为PRRSV感染时是首先与细胞表面的一个或多个受体结合，然后在细胞表面突起形成小的囊泡，再以内吞作用侵入细胞。大量研究表明PMA细胞表面有以下几种受体，第一种是硫酸乙酰肝素，它在病毒吸附细胞的过程中起着重要作用，通过肝素亲和层析和SDS-PAGE可以证实，实验表明了PRRSV的M-GP5异源二聚体可以和PMA[56]细胞表面的硫酸乙酰肝素受体结合并发挥相关作用。第二种是唾液酸粘附素，它也位于PMA细胞表面，分子量约为21KDa，所以也被称为p210，它可以特异性的识别糖脂的寡糖末端唾液酸序列，而PRRSV的GP2、GP3、GP4和GP5蛋白都是糖基化蛋白，所以都有可能含有唾液酸序列。另一种是存在于Marc-145细胞中的一种波形蛋白，它可以和PRRSV的N蛋白结合，也有实验证明波形蛋白可以阻断PRRSV的感染，因此认为它是PRRSV感染的受体之一，也有研究表明猴波形蛋白还可以使PRRSV感染BHK-21和CRFK细胞，这也进一步证明了它是PRRSV感染细胞的受体的一部分，在病毒的复制和转运过程起着重要作[57]用。最新的研究表明，PMA细胞表面的CD163受体也可能是PRRSV感染细胞的受体，认为它可能与猪的唾液酸粘附素受体共同参与病毒的感染过程，而[58]CD163的首要目的就是帮助病毒脱壳和释放病毒的基因组，有研究指出，PRRSV的GP2a蛋白和GP4蛋白与CD163分子相互作用可以促使病毒对细胞的感染。另有些人工实验表明，除了猪容易受PRRSV感染外，某些禽类也可感染，[59]比如绿头鸭，该病的发生没有规律性，且当管理错乱、饲养不善、消毒不彻底、防疫措施不健全时都可诱发该病。由于PRRSV病毒属于单链RNA，极易6 发生突变，在猪体内感染时会有持续性现象，并且会诱发亚群或亚种的产生。1.4.2PRRSV感染的特点1.4.2.1持续性感染持续性感染是PRRSV感染的特点之一，它指的是PRRSV在感染易感细胞之后能在细胞内进行持续性复制，造成易感细胞聚集组织的急性长期持续感染，从而引起感染动物长期携带此病毒，甚至可达数月。PRRSV易感6周龄左右仔猪的PMA，尤其是未成熟的PMA。研究发现，机体感染PRRSV12h后即可检[60]测到病毒血症，且可持续4-5周，6-7周时可在肺脏中检测到该病毒粒子，而以后的3-4个月在淋巴组织中也可检测到，且该病毒能引起肺脏和淋巴结周围其他组织产生病变、甚至凋亡。有报道指出，PRRSV感染后的157天在猪的扁桃体中也能检测到该病毒，当怀孕母猪感染PRRSV后，85-90天PRRSV可经胎盘传染给胎儿，而仔猪在出生后210天，血清中即可分离到该病毒，公猪在感染PRRSV后的92天在其精液中也可以检测到该病毒。持续性感染是PRRSV在猪群中传播和持续存在的重要原因，病毒感染机体后，可迅速蔓延到身体的其他部位，而市场上肥育的猪，PRRSV感染后病毒可终身存在，这种持续性感染可使PRRSV在猪群中循环存在，这给PRRSV的防控带来了巨大的挑战。1.4.2.2抗体依赖性增强作用抗体依赖性增强作用（antibodydependentenhancement,ADE）是指PRRSV感染机体后产生相应的抗体，但是抗体却对PRRSV复制和感染具有增强作用。而当机体产生的中和抗体滴度很高时，病毒被阻止进入细胞，中和抗体滴度较低时，则可增强病毒的复制，从而传染周围的易感猪，这种作用产生的原因是抗体-病毒复合物可以和易感细胞表面的Fc受体和补体受体相互作用介导内吞行，从而增强病毒的感染，其中抗体依赖性增强作用也是PRRSV感染的一个重要特征。1.4.2.3免疫抑制猪感染PRRSV后，体内的外周血单核细胞和PMAs数量会大大减少，同时机体内也会产生超负氧，它可以减弱PMA和巨噬细胞的吞噬功能。且PMAs产生低量的IFM-γ和TNF-γ，这也促使了PRRSV在体内的复制，从而削弱机体固7 有的免疫应答。同时PRRSV还能使感染猪的单核细胞、PMAs、淋巴结和其他组织的巨噬细胞以及参与免疫的细胞受到损害，使得宿主的免疫系统处于麻痹或免疫耐受状态，同时PRRSV还能破坏猪的肺脏，是肺脏的抵抗能力也减弱，使得宿主能够共感染或继发型感染其他病原体，而这种共感染PRRSV的猪比单独感染其他病原体的猪更加严重。1.5PRRSV感染后的先天性免疫应答PRRSV感染后机体的先天性免疫是抵抗病原侵入的第一道防线，但是它并不正常，这是因为PRRSV病毒对机体的免疫系统进行了调节。在天然免疫中起重要的细胞因子应该是Ⅰ型干扰素IFN-α/β。但有大量的研究表明，PRRSV的感染可抑制IFN-α的分泌。AlbinaE等发现当PRRSV侵入PMAs并复制时，巨噬[61]细胞和PBMC都不产生IFN-α，而当向PMA中加入外源性的IFN-α时，PRRSV在细胞内的生长受抑制。这说明IFN-α对PRRSV的复制具有抑制作用，而IFN-α表达量减少时，就会减少固有的免疫应答，继而影响获得性免疫应答，最终使[62-64]机体产生病毒血症和持续性感染。IFN-β在抑制PRRSV感染过程也起着重要作用。Overend等将含有IFN-β的细胞培养物与Marc-145细胞在相应的条件下孵育后再使用PRRSV进行感染，发现细胞没有发生病变，而当使用没有IFN-β[65]的细胞培养物与Marc-145细胞孵育后再感染PRRSV后，细胞出现病变。这些都证实了Ⅰ型干扰素在阻止PRRSV感染过程中发挥着重要作用。1.6PRRSV感染后的体液免疫应答大量研究发现，当健康猪感染PRRSV后的2-4周可检测到血清抗体，证明PRRSV感染后激起了机体的体液免疫。与其他宿主感染病原相比，如伪狂犬病[66]毒和猪流感病毒，PRRSV的体液应答时间出现的相对较晚。在感染后的35天左右，分泌到血清中的抗体达到最高值，且抗体主要为抗非中和表位病毒的[67-68]核衣壳蛋白，并可维持一周左右。也有一些研究表明，对感染北美洲型病毒猪样品的血清中最早检测到的抗体为15KDaN蛋白抗体，接着为19KDaM蛋白，最后是26KDaGP5蛋白抗体。还有报道说，NSP2包含一组非中和B细[69]胞表位，可能是PRRSV的免疫主导蛋白。其中这些也表明了抗PRRSV的中和抗体出现的时间比非中和抗体的晚，在感染后的4-5周才检测到。且中和抗体8 35[70-71]的滴度比非中和抗体的低（2-2），这可能不能够抵抗病毒的感染，而且还可能通过抗体依赖性增强作用促进PRRSV对巨噬细胞的感染。目前认为PRRSV的GP4、GP5、M蛋白含有中和性抗原表位，可以促使机体产生中和抗体，但GP5是唯一报道的，且中和性抗原表位的位置分别在GP5蛋白的37-45aa和27-35aa。其中位于GP5蛋白37-45aa的抗原表位具有诱骗作用，促使机体产生对应的非中和抗体，而导致针对GP5蛋白27-35aa中和表位的中和抗体延迟出现。中和抗体在抵抗PRRSV感染过程中的具体作用，目前还不是很了解，只知道机体感染PRRSV后产生的针对它的中和抗体较少、水平较低，不足以将病毒在体内消灭。1.7PRRSV感染后细胞免疫的重要作用机体感染PRRSV后产生的细胞免疫应答主要是T细胞亚群的改变、抗原特[72]异性淋巴细胞增殖和细胞因子基因的表达，其中T细胞在病毒感染中的作用即通过T细胞将抗原呈递细胞（APCs）表面的MHC分子与抗原肽进行结合，进而引发T细胞增殖等。它在抗PRRSV感染中起着十分重要的作用。实验研究发现，当猪感染PRRSV3-4周后才明显出现淋巴细胞增殖反应，此现象至少可维持3个月，这与其他病毒相比此现象出现的较晚，且在刚开始阶段，机体还+--+[73-74]会出现CD4CD8和CD4CD8T细胞减少的现象，分析原因可能是PRRSV通过感染粒细胞，产生了APC机制，从而使淋巴细胞造成了凋亡，而到3-4周-+-+后CD4CD8T细胞数目恢复正常，这也说明了T细胞亚群CD4CD8数目的增多在抗PRRSV感染中起着十分重要的作用。而当PRRSV病毒再次感染机体时，作为记忆性T细胞的CD4+CD8+会诱导机体产生淋巴细胞增殖反应，该反应可能出现病毒攻击后的2周左右。此时在猪的PBMC、血清中可检测到细胞因子IL-6、IL-10和IFN-γ等，其中IFN-γ在抑制病毒复制和积极抵抗病毒感染方面[72]++起着重要的作用。IFN-γ是Th1型细胞因子，其分泌细胞主要为CD4CD8，IFN-γ的分泌也会延迟，认为这可能与细胞因子IL-10有关，IFN-γ的分泌是细胞免疫的一个重要特征。1.8PRRSV疫苗的研究现状自从人们发现PRRSV病毒之后，它不仅危害着全球养猪业的健康发展，也9 紧密的影响着人类的日常生活。因此人们一直在开发抗PRRSV的疫苗，包括传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗指弱毒或灭活毒株，新型疫苗即DNA疫苗、多表位疫苗、基因缺失疫苗、亚单位疫苗活载体疫苗等等，但一些疫苗也存在缺点。目前市场上生产化的主要是弱毒苗和灭活苗，弱毒苗主要是在高于通常培养温度的情况下，使用传代细胞多次传代或在诱变剂作用下获得的，有报道指出弱毒苗在机体内仅能有限的增殖，能够激起较强的免疫刺激，且免疫效果非常持久，因此具有优越性，但也有报道指出，当弱毒苗接种怀孕母猪时，毒株能够通过胎盘感染胎儿，从而传染其他未感染的母猪。因此认为弱毒苗本身存在缺陷，即虽然在机体内能引起强而久的免疫，但是存在着毒力返强的可能，甚至可能引起免疫抑制和其他疾病，且能引起环境污染，从而使该病持续感染和发生病毒血症，因此有些国家规定禁止使用弱毒苗。灭活苗是使用灭活剂处理细胞培养的野毒株并加入适当的佐剂而制成，灭活苗相比弱毒苗来说安全性虽然高，但是不能诱生细胞毒性T淋巴细胞反应，所以免疫效果不如弱毒苗，且灭火苗中含有的抗原成分不高，主要的抗原结合部位丢失，常常需要反复接种，所以代价昂贵，且佐剂能引起副作用。由于传统疫苗存在着缺陷，因此研究新型疫苗迫在眉睫。随着时间的推移，目前对PRRSV新型疫苗的研究也取得了一些成果。例如PRRSV次要结构蛋白GP5、GP4能够诱导机体产生中和抗体，而结构蛋白GP3、N能够诱导机体产生细胞免疫，利用此功能就可以制备亚单位疫苗。其中GP3、GP5和M蛋白是主要的靶基因，Bastos等使用牛结核杆菌表达PRRSV缺失N端GP5基因和M基因全长，再对猪进行免疫，发现它确实能使机体产生中和抗体，再次接种病毒时出现病毒血症的时间缩短且有部分病理保护的现象，使用杆状病毒表达ORF2-7时，发现只能表达GP3、GP5和M蛋白，将表达产物对怀孕母猪进行免疫，并分析一些指标发现GP3和GP5蛋白能提供保护作用。但是使用大肠杆菌表达GP5蛋白时，却不能激起保护作用，甚至能引起严重的间[75]质性肺炎。这也说明了真核表达系统更能体现GP5蛋白的抗原性。这些亚单位疫苗虽然能起到一定的作用但是对不同年龄的猪的免疫效果也不确定，因此不被普遍使用。而活病毒载体疫苗是以异源病毒保护性抗原作为载体的疫苗，它不仅能很好的激起机体的体液免疫和细胞免疫，也能使机体产生针对异源病毒的免疫反应，同时避免了弱毒苗和灭活苗的缺点，因此应用前景非常可观，也成为了PRRSV疫苗研究的一个重要方向。其中经典的以活病毒为载体的10 PRRSV疫苗是以胃肠炎病毒表达GP5蛋白，并对仔猪进行免疫，发现血液中可检测到抗GP5蛋白的多克隆抗体。而另一个较好的重组疫苗载体是伪狂犬病毒，因为它具有完整感染性、基因容量大等优点，因此也被研究PRRSV新型疫苗的科学家十分看好。DNA疫苗是将外源性保护基因插入到真核表达质粒中，然后将重组质粒注射到猪体内，从而诱导机体产生相应的免疫保护，它具有成分单一、生产简单、成本低、稳定性好等优点，虽然也有人对DNA疫苗的安全性持怀疑态度，认为DNA可能会插入到宿主的染色体上从而造成突变，但是直到目前，相关研究还没有发现此现象，且质粒DNA在体内会慢慢被分解，即它不会引起机体产生自身免疫，且对环境的影响也很小，因此成为了PRRS新型疫苗的研究重点。1.9GP3对研制新型疫苗的作用至今为止，PRRSV疫苗中仍缺乏新型、通用的疫苗，因此开发更高效的、通用型的疫苗迫在眉睫。将PRRSVGP3、GP4、和GP5串联或分别重组到腺病毒载体中，重组病毒具有良好的免疫原性，且产生的GP3单克隆抗体不会使机[76]体产生抗体依赖性增强作用，但是单独使用纯化的GP3蛋白刺激机体时产生的中和抗体滴度就很低。从整体结果来看，重组腺病毒的免疫效果要比常用的弱毒苗和灭活苗好的多。另有报道指出，使用表达的GP3蛋白再次感染怀孕母猪时能提供68.4%的保护，且它的高保护力是在其抗体水平低的情况下产生的，[77]因此推测GP3可能不引导体液免疫，但可以激发机体的细胞免疫。大量文献也指出，GP3在诱导细胞免疫方面要高于GP5蛋白。这些都说明研究PRRSVGP3蛋白对开发研制新疫苗有着重要的意义。而在研究疫苗时首先要搞清楚的是它激起机体的体液免疫还是细胞免疫，即是B细胞表位还是T细胞表位。前面已经介绍了GP3蛋白可能在抗PRRSV感染的细胞免疫中的发挥着重要作用，因此筛选PRRSVGP3蛋白中的T细胞表位，再将其制成疫苗注射到动物体内，使机体免受PRRSV侵染的可能性比较大，而这也为研发新一代的高效疫苗提供了新的思路。1.10T细胞表位的研究方法由抗原提呈细胞（antigenprocessingcell,APC）处理、MHC分子提呈的多11 肽能与T淋巴细胞受体结合，但与其结合有时可能并非是整个抗原大分子，而是抗原大分子上的一部分，即T细胞表位。它又分为两类，MHCⅠ类分子抗原++表位和MHCⅡ类分子抗原表位，又叫CD8T细胞抗原表位和CD4T细胞抗原表位。筛选T细胞表位，不仅对理解细胞免疫的的机理、过程有重要的意义，对研发新型的亚单多肽疫苗和基因疫苗有着重要的依据。目前有关人类的T细胞表位的研究相对较多，比如人的免疫缺陷病毒（HIV）、西尼尔病毒（WNV）和分支杆菌等，并且有研究指出将同源或异源的T细胞表位串联后对机体进行反映，也可以很好的诱导机体产生细胞免疫，而将T细胞表位和B细胞表位组合时，同样在动物体内能诱发体液免疫应答、细胞免疫应答和T辅助细胞的免[78-79]疫应答。1.10.1T细胞表位的研究方法（1）重叠多肽法。将抗原大分子随机或连续的合成多肽，再通过T细胞功能试验确定可能被T细胞识别的多肽，这种方法合成的重叠多肽长度一般为10-18个氨基酸、9个重叠，目前有人使用该方法已成功鉴定了几个T细胞表位。但是它也存在缺点，例如工作量大、成本高等。（2）T细胞表位预测法。先利用生物学软件预测抗原大分子可能的T细胞表位，然后合成多肽，再通过T细胞功能试验确定可能被T细胞识别的多肽。而预测T细胞表位的生物学软多种多样，主要分为3种类型：①根据motif模型预[80]测，且已成功的预测了一些病原体的抗原表位，根据motif模型预测的生物学软件有SYFPEITHI、BIMAS、EpiMatrix等。②根据多肽结构预测，如PREDEP方法，它从分析X线晶体衍射图结构入手找到对应的口袋，锚插入口袋是结合[81]的前提。③根据蛋白酶体的裂解预测，如FragPredict、PAProC等。有些蛋白酶体裂解产物可以与MHCⅠ类分子结合，因此推测它可能是T细胞表位，而这[82]也可能与蛋白酶体的裂解特性有关。这些都是理想的检测T细胞表位的方法，与实际鉴定出的T细胞表位会有一定的出入，毕竟抗原提呈给T细胞受体的过程是相当复杂的，比如如果预测的T细胞表位，它在被蛋白酶消化时，不被抗原提呈细胞处理，就不能与MHC分子结合，那么当然也就不能与T细胞受体结合。因此要想准确找出抗原大分子的T细胞表位仅通过预测的方法是不可靠的，还要进行一些T细胞功能试验来验证。12 1.10.2T细胞功能试验使用合成的多肽进行T细胞功能试验以检测它的活性，这些试验方法多种多样，主要有以下几种：（1）T淋巴细胞增值试验。它的原理是抗原诱导机体产生T细胞活化增殖，具体方法是，将表位多肽对小鼠进行免疫，然后取其脾细胞，获得淋巴细胞悬3液之后，再使用多肽对其刺激，添加[H]-胸腺嘧啶，以液闪计数cpm。使用这种方法已研究出了登革热病毒E蛋白辅助性T细胞和牛呼吸道合胞体病毒的F、+[83]G蛋白的CD4T细胞表位。（2）ELISPOT试验。酶联免疫斑点试验（ELISPOT）的原理是检测抗原对细胞进行刺激后细胞因子IFN-γ分泌的情况，以及检测体外抗原特异性T淋巴细胞反应。具体方法为，使用IFN-γ包被ELISPOT板并封闭，然后取多肽刺激免疫过的小鼠的脾细胞的上清，加入到上述ELISPOT板的孔中，再加入生物素化的抗小鼠IFN-γ单抗，加入底物显色，通过显微镜计数斑点。该方法不仅可检测抗原特异性T细胞表位，且可定量，因此得到广泛使用。（3）流式细胞仪分析方法。该方法的原理是使用荧光标记的抗细胞表面抗原的抗体和荧光标记的抗细胞因子的单抗来检测单个细胞内的细胞因子的分泌情况以及区分分泌特定细胞因子的细胞亚群。具体方法如下所述：取免疫过小鼠的脾细胞，使用抗原多肽对其刺激并加入BFA阻断，然后将获得的细胞团，结合固定破膜处理技术，进行细胞表面抗原CD3、CD8和细胞内因子IFN-γ、IL-10染色，最后使用流式细胞仪分析T淋巴细胞细胞亚群的改变和细胞因子的分泌情况。该方法目前已经十分成熟，且被广泛用于基础研究和临床实践的各个领域，在各个学科中发挥着重要作用。1.11研究目的及意义PRRSV从首次发现到现在对世界各个养猪国家的危害已长达20年之久，各国学者也在不断地研究防控此病的方法，但都没有取得理想的效果，我国于1996年爆发了PRRSV，随后迅速传播到各个省份，给我国的畜牧业造成了巨大的经济损失，同时也严重危机了畜牧产品和食品的安全。中和抗体产生延迟和抗体依赖性增强作用是PRRSV感染的重要特征，给PRRSV感染的防控带来了巨大的挑战。13 GP3作为PRRSV的次要结构蛋白具有高度变异性和较强的抗原性，大量研究也表明了GP3蛋白在抗PRRSV感染的细胞免疫中发挥着重大作用，因此本研究通过原核表达PRRSVGP3蛋白，并将其应用在动物实验上来筛选它的T细胞表位，从而为研制新型的亚单位疫苗提供依据，同时也可以深入了解PRRSV感染后细胞免疫应答，为PRRSV免疫机理的研究奠定基础。14 2PRRSVGP3截短蛋白的原核表达与纯化2.1实验材料2.1.1病毒、血清、载体和菌株PRRSVBJ-4株以及PRRSV阳性血清、阴性血清由河南省农科院重点免疫实验室保存；克隆载体pMD19-T、原核表达载体pET-32a、大肠杆菌DH5α、BL21均由本实验室保存。2.1.2主要试剂的配制（1）LB液体培养基：取胰蛋白胨（Tryptone）2g，酵母提取粉（YeastExtraction）1g，氯化钠（Nacl）2g，去离子水溶解之后定容至200ml，在液体培养基中按质量分数1.5%加入琼脂粉（Agar）,即为固体培养基，高压灭菌之后4℃保存备用。（2）Amp+（50mg/ml）：取Amp+500mg，用去离子水溶解之后，定容至10ml，0.22μm滤膜过滤，并分装保存于-20℃。（3）50×TAE(8.5)：取三羟甲基氨基甲烷（Tris）121g，Na2EDTA▪H2O18.6g，溶于400ml去离子水中，并使用醋酸调pH，最后定容500ml。（4）IPTG：取IPTG2.4g溶于10ml去离子水中，0.22μm滤膜过滤，分装保存，贮存浓度为1M。（5）PBS：取氯化钾（Kcl）0.1g，氯化钠（NaCl）4g，Na2HPO4▪12H2O1.81g，KH2PO40.135g，使用去离子水溶解后，调节pH7.4，并定容至500ml。（6）30%（w/v）Acr：取Acr145g，BIS5g，去离子水溶解定容至500ml后，0.45μm滤膜过滤，保存于4℃棕色瓶子中。（7）1.5MTris-Hcl(pH8.8)：取Tris36.34g，溶于去离子水中，并使用浓盐酸调节pH，并定容至200ml，0.45μm滤膜过滤，室温保存。（8）1MTris-Hcl(pH6.8)：称取Tris12.11g，去离子水溶解，浓盐酸调PH，最后定容至100ml，0.45μm滤膜过滤，室温保存。（9）10%AP：取过硫酸铵1g，去离子水溶解并定容至10ml，0.45μm滤膜过滤后100μl/管分装，-20℃保存。（10）10%SDS：取SDS10g溶于去离子水中并于68℃加热促进其溶解，最后15 定容至100ml，最后使用0.45μm滤膜过滤，室温保存。（11）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：称取Tris7.55g，Glycine47g，SDS2.5g，加去离子水溶解并定容至500ml，室温保存。（12）5×SDS-PAGE上样缓冲液：取SDS0.5g，BPB25mg，1MTris-Hcl(pH6.8)1.25ml，甘油2.5ml，最后去离子水溶解并定容至5ml，分装保存于4℃，使用前加入25μlβ-巯基乙醇。（13）2%分离胶5ml10ml去离子水1.6ml3.3ml30%Acrylamide2.0ml4.0ml1.5MTris-Hcl(pH8.8)1.3ml2.5ml10%SDS0.05ml0.1ml10%AP0.05ml0.1mlTEMED0.002ml0.004ml（14）5%浓缩胶2ml5ml去离子水1.4ml3.4ml30%Acr0.33ml0.83ml1.5MTris-Hcl(pH8.8)0.25ml0.63ml10%SDS0.02ml0.05ml10%AP0.02ml0,05mlTEMED0.002ml0.0005ml（15）考马斯亮蓝染色液：取考马斯亮蓝R-2500.5g，异丙醇125ml，冰醋酸50ml，溶解之后加去离子水325ml定容至500ml，并用滤纸出去颗粒物质，室温保存。（16）考马斯亮蓝脱色液：取醋酸50ml，乙醇25ml，去离子水定容至500ml。（17）转膜缓冲液：取Glycine1.45g，Tris2.9g，SDS0.185g，加入300ml去离子水溶解定容至400ml后，加入100ml甲醇。（18）裂解缓冲液：称取氯化钠（NaCl）1.76g，Tris0.242g，EDTA0.584g，去离子水溶解定容至200ml，其中还含有终浓度为10%的甘油和终浓度为1mM的PMSF，调节pH8.0，4℃保存。（19）洗涤缓冲液：取氯化钠(NaCl)0.58g，乙二胺四乙酸二钠0.372g，Tris0.6g，去离子水溶解定容至100ml，调节pH8.0，4℃保存。（20）2M尿素变性液：取氯化钠（NaCl）5.8g，Tris0.6g，乙二胺四乙酸二钠16 0.372g，尿素24g，去离子水溶解定容至200ml，调节pH8.0，4℃保存备用。（21）8M尿素变性液：取氯化钠（NaCl）5.8g，Tris0.6g，乙二胺四乙酸二钠0.372g，尿素96g，去离子水溶解定容至200ml，调节pH8.0，4℃保存备用。（22）CBS：取碳酸钠（Na2CO3）0.795g，碳酸氢钠（NaHCO3）1.47g，加入去离子水溶解并定容至500ml，调节pH9.6，常温保存。2.1.3其他试剂和工具酶TRIZOL试剂盒购自Invitrogen公司，RT试剂盒：M-MLVreversetranscriptaseTMwasusedforPrimeScriptRTReagentKitwithgDNAEraser、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、质粒小提试剂盒、核酸胶回收试剂盒、DNA聚合酶购自TaKaRa公司，预染Marker购自Thermo，小鼠抗His单克隆抗体购自郑州益康生物工程有限公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abbkine公司。2.1.4主要实验仪器仪器名称购买厂家超净工作台苏州精华集团安泰公司普通离心机上海湘仪有限公司PowerPac3000电泳仪美国Bio-RadGelDocXR凝胶成像系统美国Bio-Rad恒温水浴锅金坛晶玻仪器厂超声破碎仪美国SONIC公司半干转膜仪美国Bio-RadImark酶标仪美国Bio-RadCMAGHS4加热磁力搅拌器德国IKA公司低温冷冻离心机德国EPPENDORF公司可调式微量移液器美国EPPENDORF公司NanoDrop2000c分光光度计美国Thermo公司TP-214分析天平美国Denver公司隔水式培养箱上海一恒科学仪器有限公司-80℃冰箱美国Thermo公司17 2.2实验方法2.2.1构建重组质粒pMD19-T-ORF32.2.1.1引物设计根据（GenBank）中已发表的PRRSVBJ-4ORF3的因的序列，使用Primer5设计一对关于ORF3的引物，它能扩增出ORF3的全长序列765bp，其中上游引物为P31:5’-GAATTCATGGTTAATAGCTGTACATTCCTCC-3’（下划线为EcoRⅠ酶切位点），下游引物为P32:5’-AAGCTTTTATCGCCGTACGGCACT-3’（下划线为HindⅢ酶切位点），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2.2.1.2PRRSVBJ-4株病毒RNA的提取按照TRIZOL试剂盒操作说明书依次进行如下步骤，提取PRRSVBJ-4株病毒RNA。（1）取500μlBJ-4病毒感染的细胞培养液，加入500μLTrizol，室温静5-10min。（2）1:5加入200μl氯仿，震荡混匀之后，室温静置5min，4℃、12000rpm离心15min，取上清。（3）加入等体积的异丙醇，震荡混匀之后，-20℃静置30min，4℃、12000rpm离心20min，弃上清。（4）加入1ml75%乙醇，4℃、12000rpm离心6min，弃上清。（5）沉淀用无水乙醇再次洗涤，弃上清之后剩余液体用滤纸吸干，加入200μL无酶水溶解，-20℃保存。2.2.1.3RT-PCR扩增ORF3根据RT试剂盒操作说明将BJ-4病毒株的总RNA进行反转录，RT-PCR反应分两步，体系如下：第一步GenomicDNA样品体积5×gDNABuffer4.0μlgDNA2.0μltotalRNA4.0μl去离子水10μl18 第二步反转录样品体积5×Buffer8.0μlPrimeRT2.0μlMix2.0μl去离子水8.0μl将获得混合物在37℃水浴锅中静置15min，85℃、5s，即获得PRRSVBJ-4株cDNA，进行常规PCR扩增ORF3，反应体系如下：样品体积cDNA2.0μl上游引物1.5μl下游引物1.5μlE×Taq酶25μl灭菌的去离子水20μl然后设置PCR反应参数：95℃预变性3min，进入PCR循环，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环以后，72℃再延伸7min，然后4℃保存备用。2.2.1.4胶回收PCR产物向常规PCR产物50μl中加入4.6μl10×LoadingBuffer，混匀后，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，90V电压、工作30min，停止电泳。在凝胶成像系统上使用紫外灯观察电泳结果，找到目的基因条带，使用刀片快速切下含有所需DNA片段的凝胶，获得凝胶质量后，按照TaKaRa公司核酸胶回收试剂盒操作说明对PCR产物进行纯化，步骤如下：（1）将回收的胶块溶于3个凝胶体积量的BufferGM中，计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计算，胶块溶解过程中可以不间断的漩涡震荡。（2）将SpinColumn放置在CollectionTube上，并将步骤（1）的混合液体转移到SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃上清。（3）向SpinColumn中加入700μlBufferWB，12000rpm离心1min，弃上清。（4）重复上述操作。（5）将SpinColumn放置在干净的1.5ml的离心管上，室温吹风晾干。（6）向SpinColumn膜中央加入30μl60℃高压灭菌的去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1min，收集的洗脱液即为所需基因。19 2.2.1.5胶回收的ORF3与pMD19-T连接胶回收的ORF3与pMD19-T的连接反应按照TaKaRapMD19-TVectorCloningKit说明书进行，反应体系如下：样品体积ORF3基因片段1.5μlpMD19-T载体1μlSolutionⅠ2.5μl将上述混合物16℃连接30min，直接进行转化。2.2.1.6制备感受态（1）取冻存的DH5α菌液3μl，在含有氨苄青霉素的3mlLB液体培养基上，37℃、220rpm过夜培养。（2）取上述过夜培养的菌液2ml接种到200ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基上，37℃、220rpm培养1.5h左右，即OD600值达到0.4-0.6。（3）将上述菌液冰浴10min，4℃、4000rpm离心5min，弃上清。（4）加入20ml提前预冷的高压灭菌的去离子水重悬沉淀，4℃、4000rpm离心5min，弃上清。（5）加入2ml0.05MCaCl-15%甘油重悬沉淀，4℃、5000rpm离心10min，弃上清。（6）加入1ml0.05MCaCl-15%甘油重悬沉淀，然后分装100μl/管，-80℃保存备用。2.2.1.7连接产物的转化（1）将连接产物转移至100μlDH5α感受态中，冰上放置30min。（2）将含有上述混合物的离心管放在42℃水浴锅中，静置90s，然后迅速插入冰上，放置5min。（3）向离心管中加入900μlLB液体培养基，37℃180rpm培养1h。（4）然后将上述离心管4000rpm离心5min，弃去部分培养基，留下100-200μl菌液。（5）将上述菌液使用无菌玻璃棒均匀涂布与含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中过夜培养。20 2.2.1.8筛选阳性克隆2.2.1.8.1提取重组质粒将培养过夜的平板进行蓝白斑筛选，挑取平板上的白斑，然后将其在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，取3-4ml菌液依照TaKaRa质粒小提试剂盒的操作步骤，提取pMD19-T-ORF3重组质粒，具体操作过程如下：（1）取3ml左右的菌液加入到离心管中12000rpm离心2min，弃上清。（2）向离心管中加入250μlSolutionⅠ溶液重悬上述离心后的沉淀。（3）再向离心管中加入250μlSolutionⅡ溶液，然后轻轻上下翻滚5-6次使其混匀至透明状态。（4）再加入350μl提前4℃预冷的SolutionⅢ溶液轻轻上下翻滚5-6次直至形成紧实的凝集块，然后静置2min，12000rpm离心10min，收集上清。（5）将SpinColumn放置在CollectionTube，将收集的上清液体转移到SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。（6）再向SpinColumn中加入500μlBuferWA溶液，12000rpm离心1min，弃滤液。（7）再向SpinColumn中加入700μlBuferWB溶液，12000rpm离心1min，弃滤液。（8）重复步骤（7）。（9）将SpinColumn放置在干净的离心管上，室温吹风晾干。（10）向SpinColumn膜中央加入50μl60℃高压灭菌的去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1min，收集的洗脱液即为重组质粒。2.2.1.8.2重组质粒双酶切鉴定将提取的质粒使用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：21 样品体积重组质粒PMD19-T-ORF310μlEcoRⅠ0.5μlHindⅢ0.5μl10×MBuffer2μl高压灭菌的去离子水7μl在37℃水浴锅中酶切4h，取5μl酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。然后将重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。2.2.2构建原核表达质粒pET-32a-tORF32.2.2.1目的基因的引物设计通过阅读相关文献，对ORF3编码的氨基酸进行了分析，使用Primer5设计一对引物P3S和P3A来扩增ORF3缺失N端疏水序列的基因片段tORF3，片段长度为678bp，为了实验简便，这对引物使用的酶切位点仍是EcoRⅠ和HindⅢ，引物序列如下：上游引物为P3S：5’-GAATTCACTACGTACTGTTTTTGGTTTCCGC-3’下游引物为P3A：5’-AAGCTTTTATCGCCGTACGGCACTGAG-3’（下划线为酶切位点），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2.2.2.2PCR扩增tORF3以测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF3为模板，以P3S和P3A为引物，扩增tORF3，PCR反应体系如下：样品体积pMD19-T-ORF32μl上游引物1.5μl下游引物1.5μlE×Taq酶25μl灭菌的去离子水20μl设置PCR反应参数：95℃预变性3min，进入PCR循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环以后，72℃再延伸7min，4℃保存备用。2.2.2.3PCR产物的胶回收与双酶切按照2.2.1.4步骤对PCR扩增的tORF3进行胶回收，使用EcoRⅠ和HindⅢ22 对其双酶切，酶切反应体系如下：样品体积胶回收的tORF330μlEcoRⅠ1μlHindⅢ1μl10×MBuffer3μl高压灭菌的去离子水15μl将上述液体混匀之后，在37℃水浴锅中酶切2h后，按照2.2.1.4步骤进行胶回收。2.2.2.4原核表达载体pET-32a的双酶切将本实验室冻存的pET-32a（DH5α)菌液取4μl接种于4ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养，按照2.2.1.8.1提取质粒的方法，提取原核表达载体pET-32a，然后同样使用EcoRⅠ和HindⅢ对载体质粒进行双酶切，酶切体系如下：样品体积pET-32a30μlEcoRⅠ1μlHindⅢ1μl10×MBuffer3μl高压灭菌的去离子水15μl同样将上述液体混匀之后，在37℃水浴锅中酶切2h后，按照2.2.1.4步骤进行胶回收。2.2.2.5tORF3与pET-32a连接（1）将双酶切后胶回收的tORF3与pET-32a使用T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系如下：23 样品体积双酶切后胶回收的tORF34.4μl双酶切后胶回收的pET-32a2.7μlT4DNA连接酶0.5μl10×LigaseBuffer1μl高压灭菌的去离子水1.4μl液体混匀后，16℃连接过夜。（2）连接产物进行的转化按照2.2.1.7方法进行。（3）筛选阳性克隆按照2.2.1.8方法进行，并对其鉴定。2.2.3重组蛋白pET-32a-tGP3大肠杆菌中的诱导表达及鉴定2.2.3.1重组蛋白的表达首先按照2.2.1.6的方法制备BL21（DE3）感受态，然后将构建正确的重组质粒pET-32a-tGP3转进BL21（DE3）感受态细胞中，涂于平板上并过夜培养，然后挑取单克隆，将其在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、220rpm过夜培养。再将过夜培养的菌液1:100接种于5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养2h，待OD600约等于0.6-0.8时，1:1000加入IPTG，37℃、220rpm震荡培养8h，收集菌液，取300μl，用于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，具体步骤如下：（1）将300μl菌液12000rpm离心5min，弃上清。（2）向沉淀中加入20μlPBS进行重悬，然后加入5μl预热的5×LoadingBuffer，沸水浴10min。（3）将离心管12000rpm离心5min，取上清做为样品进行SDS-PAGE电泳，电泳电压为先90V、30min，后120V约1.5h。（4）然后将聚丙烯酰胺凝胶取出，放入含有考马斯亮蓝染色液的盒子中进行染色约2h，再使用脱色液脱色，每4h换一次直至聚丙烯酰胺凝胶在凝胶成像系统上能清楚的看到目的条带为止。2.2.3.2重组蛋白的Western-Blot鉴定将所需样品进行SDS-PAGE电泳之后，取出凝胶使用刀片迅速切下尽可能只含有样品的一部分，进行Western-Blot鉴定，具体步骤如下：24 （1）首先将切下的凝胶小心的放入含有转膜缓冲液的平皿中，并对正面进行标记。（2）取出NC膜，比照所切下来凝胶的大小裁剪稍微大点，并标记正面，然后浸泡在装有水的平皿中，计时5min，最后同凝胶一起放在含有转膜缓冲液的平皿中，再计时5min。（3）裁剪两层滤纸，同样比照凝胶的大小比NC膜稍微小点，先浸泡在装有水的平皿中，浸湿之后，转移到含有转膜缓冲液的平皿中，等待步骤（2）计时结束。（4）先将两层滤纸拿出来，使用玻璃棒赶走中间气泡，然后按照滤纸-NC膜-凝胶-滤纸的顺序铺在半干的转膜仪上，打开电源开关，调整电压为15V，约2h转膜结束。（5）取出NC膜，放进含有5%脱脂奶的平皿中，4℃封闭过夜。（6）次日弃去脱脂奶，PBST洗三次，将NC膜放入1:1000稀释的鼠源抗His单抗中，37℃、50rpm结合1h。（7）回收鼠源抗His单抗，PBST洗三次，将NC膜放入1:2000稀释的羊抗鼠IgG中，37℃、50rpm结合1h。（8）PBST洗5次，最后一次使用去离子水冲洗，然后按照ECL化学发光液的使用说明，进行显色，并记录显色结果。2.2.3.3重组蛋白的可溶性分析取重组菌pET-32a-tGP3（BL21）2μl加入2ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养，然后1:100接种于100ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养约2h，待OD600约等于0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃、220rpm进行诱导表达。诱导表达后4℃保存备用或直接12000rpm离心10min，然后加入10mlPBS进行重悬，并超声破碎20min（工作时间3s，间隔时间3s），12000rpm离心5min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。2.2.3.4重组蛋白表达条件的优化将冻存的pET-32a-tGP3（BL21）取2μl加入2ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养，然后再将过夜培养的菌液1:100接种于5ml25 含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养约2h，待OD600约等于0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，分别在诱导前和诱导后的0h、2h、4h、6h、8h各取300μl液，进行12%SDS-PAGE电泳分析。取冻存的pET-32a-tGP3（BL21）2μl加入2ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养，然后1:100接种于5个含有5mlLB液体培养基的小瓶子中37℃、220rpm培养约2h，待OD600约等于0.6-0.8时，分别加入IPTG至终浓度为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8Mm、1mM，然后继续37℃、220rpm培养，同样使用12%SDS-PAGE进行电泳分析。2.2.4重组蛋白的提取及纯化2.2.4.1包涵体的提取将诱导表达的基因工程重组菌扩大培养200m1，4℃保存备用或直接12000rpm离心20min，弃上清；加入20ml裂解缓冲液重悬沉淀并混匀，超声破碎30min（工作时间3s，间隔时间3s），12000rpm离心20min，弃上清；加入20ml洗涤缓冲液重悬沉淀，超声破碎2min（工作时间3s，间隔时间3s），12000rpm离心15min，弃上清；再加入20ml2M尿素洗涤液重悬沉淀，12000rpm离心15min，弃上清；再加入10ml8M尿素变性液，冰上放置30min，轻轻吹打后，12000r/min离心15min，收集上清即为变性包涵体，使用12%SDS-PAGE进行电泳分析。2.2.4.2包涵体的复性对新的透析袋处理之后，将上述变性的包涵体10ml放入透析袋内，将透析袋放入尿素浓度依次降低为7，6，5，4，3，2，1，0mol/L的复性缓冲液中，在4℃进行透析，每4-6h换一次。最后将透析袋中的复性液，12000rpm离心15min，上清用0.45μm滤膜过滤后，收集液体使用紫外分光光度计测量蛋白浓度，并使用12%SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。2.2.5ELISA鉴定重组蛋白免疫活性使用CBS将复性后的重组蛋白tGP3稀释到2ng/μl，每孔100μl包被酶标板，4℃放置过夜，PBST洗涤3次之后，每孔加入300μL5%脱脂奶，37℃放置1h，再用PBST洗涤6次之后，每孔加入100μL倍比稀释的PRRSV阳性血清和阴性26 血清，血清稀释梯度为1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400，设置3个重复孔以及空白孔对照，37℃放置30min。PBST洗涤6次后，每孔再加入100μL用5%脱脂奶按1:2000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃放置30min，PBST洗涤6次之后，每孔加入100μl显色液，5min之后每孔加入100μL终止液，并迅速酶标仪读数，记录结果。2.3结果与分析2.3.1PRRSVBJ-4ORF3基因的扩增以及pMD19-T-GP3双酶切鉴定以反转录的PRRSVBJ-4的cDNA为模板扩增出的ORF3基因长度为765bp，与预期大小相符，与pMD19-T连接之后，通过筛选获得阳性重组质粒，并用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，获得2个片段，其中一个与目的基因相附，结果见图2.1。阳性重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，序列表明PRRSVBJ-4ORF3阅读框正确插入到pMD19-T载体中。图2.1PRRSVBJ-4ORF3基因的扩增以及pMD19-T-GP3双酶切鉴定1.DL2000Marker2.RT-PCR扩增的ORF33.pMD19-T-GP3双酶切产物4.DL15000Marker2.3.2截短的ORF3的扩增以及原核表达质粒pET-32a-tGP3双酶切鉴定以测序正确的pMD19-T-GP3重组质粒为模板，使用引物P3S、P3A进行PCR，扩增出截短的ORF3基因片段，长度678bp。与pET-32a连接、转化之后，对原核表达质粒pET-32a-tGP3进行双酶切鉴定，获得的酶切片段与预期大小一致，结果见图2.2。27 图2.2重组质粒pET-32a-tGP3双酶切鉴定1.DL2000Marker2.重组质粒pET-32a-tGP3双酶切产物4.DL15000Marker2.3.3重组蛋白的诱导表达与Western-Blot鉴定结果将pET-32a-tGP3转入BL21（DE3）之后，取IPTG诱导后8h的菌液裂解，并使用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析，同时设立阴性对照和空白对照。结果发现重组菌在43KDa处出现蛋白条带，大小与预期的蛋白分子量基本一致，而阴性对照在20KDa处出现蛋白条带为6×His非融合蛋白，空白对照无明显蛋白条带结果见图2.3。再进一步使用Western-blot对重组蛋白的表达进行鉴定，结果显示在43KDa处同样出现目的条带，这说明重组蛋白确实成功的表达且能很好的与小鼠抗His-tag结合，结果见图2.4。图2.3重组蛋白的诱导表达1.蛋白Marker2.pET-32a-tGP3诱导6h3.pET-32a诱导6h4.BL21诱导6h28 图2.4重组蛋白的Western-Blot鉴定结果1.蛋白Marker2.pET-32a-tGP33.pET-32a4.BL212.3.4重组蛋白的可溶性分析及表达条件的优化通过SDS-PAGE电泳分析上述超声破碎的上清和沉淀，发现重组蛋白基本都在沉淀中，即以包涵体的形式存在，结果见图2.5。为了尽可能多的获得重组蛋白，将重组菌在37℃、220rpm、IPTG终浓度为1mM的条件下进行诱导，并在指定的时间收集菌液，然后通过SDS-PAGE电泳分析每个时间段蛋白的表达情况，从电泳结果中我们发现在诱导4h蛋白的表达量最大，结果见图2.6。同时也将重组菌在不同的IPTG浓度下进行诱导，在培养4h收集各个浓度梯度的样品，并进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示在不同IPTG浓度诱导下蛋白的表量相差不大，根据实验简便的原则，我们选择了IPTG浓度为1mM，结果见图2.7。图2.5重组蛋白的可溶性分析1.蛋白Marker2.pET-32a-tGP3诱导6h超声破碎上清3.pET-32a-tGP3诱导6h超声破碎沉淀29 图2.6重组蛋白诱导时间的优化结果M.蛋白Marker1.pET-32a-BL212.pET-32a3.pET-32a-tGP3诱导0h4.pET-32a-tGP3诱导2h5.pET-32a-tGP3诱导4h6.pET-32a-tGP3诱导6h7.pET-32a-tGP3诱导8h图2.7重组蛋白IPTG的优化结果M.蛋白Marker1.0.2mM2.0.4mM3.0.6mM4.0.8mM5.1Mm30 2.3.5重组蛋白的纯化结果在37℃、220rpm、IPTG终浓度为1mM的条件下对重组蛋白进行扩大培养，培养时间为4h，收集样品，使用尿素梯度法对重组蛋白进行提取和纯化，SDS-PAGE电泳结果显示获得重组蛋白纯度较高，结果见图2.8。图2.8重组蛋白pET-32a-tGP3的变性结果M.蛋白Marker1.裂解缓冲液重悬离心后上清2.洗涤缓冲液重悬离心后上清3.2M尿素重悬离心后上清4.8M尿素变性包涵体2.3.6ELISA鉴定结果复性后的重组蛋白pET-32a-tGP3与PRRSV阳性血清和阴性血清进行间接ELISA反应之后，酶标仪读数显示当血清稀释到1:6400时，重组蛋白pET-32a-tGP3与PRRSV阳性血清反应的OD450值比其与PRRSV阴性血清反应的OD450值高于2.1，这也表明重组蛋白pET-32a-tGP3能很好的与PRRSV阳性血清进行结合，具有良好的免疫活性。具体结果见图2.10。31 OD450血清稀释度图2.10重组蛋白免疫活性的分析Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ依次为血清稀释度1:50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：64002.4讨论GP3蛋白是由PRRSV基因序列中的ORF3编码的，它是一种被高度糖基化的[84-85]蛋白，在病毒的复制、装配、病毒变异和保护性方面起着重要作用。Plana等报道使用杆状病毒表达的GP3蛋白对母猪进行免疫，发现对怀孕母猪可提供68.4%的保护。但GP3蛋白是高度变异，在不同毒株之间氨基酸序列差异较大，将HP-PRRSV与经典毒株相比，GP3氨基酸突变位点最多，共有8个突变位点，[86]其中4个为非保守性突变，而第83位保守性突变可能与PRRSV毒力相关。所以[53,77,86]虽然已有大量文献报道PRRSV其他分离株GP3蛋白的表达，但本试验研究的BJ-4株GP3蛋白与其的氨基酸序列之间存在明显差异的，这也说明了表达PRRSVBJ-4株GP3蛋白是具有十分重要意义的。目前对PRRSV主要结构蛋白GP5、M、N的研究已有大量的报道，而对次要结构蛋白GP3的研究却相对较少，有研究指出在欧洲型LV株GP3蛋白是该病毒的结构蛋白，而在加拿大Quebec[87]IAF-Klop株GP3就不是该病毒粒子的组成成分，而是弱的与膜相关的蛋白，其中美洲株FLl2株的GP3蛋白同欧洲株的是一样的，都是该病毒的结构蛋白。因此深入透彻的研究GP3蛋白的结构和功能是十分有必要的。原核表达系统和真核表达系统是目前获得重组蛋白的常用方法，但真核表32 达系统可对重组蛋白进行磷酸化等翻译后修饰，且存在产量比较低，不易操控等缺点。而原核表达系统特别是大肠杆菌表达系统，它的表达调控过程比较清楚，且有完善的基因工程试验体系和基因背景，同时具有表达产量高、易于工业生产等优点。在本研究中，我们使用的是原核表达系统，且曾试图使用原核表达载体pET-28a、pET-32a、pGEX-6p-1与PRRSVBJ-4ORF3构建重组质粒并在大肠杆菌中进行表达，并尝试了各种诱导条件包括诱导时间、IPTG浓度以及诱导温度等等，但重组蛋白仅能有限的表达或不表达。阅读大量的文献，发现去除蛋白[88]的信号肽和跨膜区可明显提高其表达量，通过生物数据库和已报道的大量文献对PRRSVORF3编码的氨基酸胞内区、跨膜区和胞外区分布情况的分析，本实验去除了PRRSVBJ-4ORF3N-末端的1-87aa，重新设计引物扩增截短的ORF3基因片段，并与原核表达载体pET-32a进行连接、转化。对基因工程重组菌进行诱导发现tGP3蛋白有较高的表达量，这又再次说明疏水区和信号肽对蛋白的表达有较大影响。经Western-Blot验证发现重组蛋白具有良好的反应活性，这也说明了去除蛋白的疏水区并不影响该蛋白的活性。然后又对诱导表达的重组蛋白进行了可溶性分析，发现它以包涵体的形式存在。而初步计划是采用镍柱对重组蛋白进行纯化，但发现重组蛋白与其结合的效率很低。有文献指出，对包涵体进行裂解、尿素梯度洗涤以及复性能达到较好的纯化效果，同时能使其满足[89-90]后续实验的要求。本试验就使用尿素来制备包涵体，并通过梯度法使用尿素对包涵体透析复性，获得了纯度较高的目的蛋白，获得的重组蛋白通过ELISA方法检测其免疫活性，发现它能很好的与PRRSV阳性血清结合，这也说明了对蛋白进行变性、复性处理以及去除其疏水序列并不影响蛋白的反应活性，这为以后制备抗GP3的单克隆抗体或筛选其T细胞表位做了重要铺垫。由于目前关于GP3是否为PRRSV的结构蛋白还存在一定的争议，因此对该蛋白进行深入研究十分必要，本实验通过原核表达方法在体外成功的表达了PRRSVBJ-4GP3蛋白，不仅对了解其结构功能奠定了基础，而且对研究其在PRRSV感染中的作用也具有重要意义。33 3PRRSVGP3截短蛋白T细胞表位的初步筛选3.1实验材料3.1.1主要材料4-6周龄Balb/c小鼠由河南省农科院提供；弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma公司；羊抗鼠酶标二抗购自郑州益康生物工程有限公司；多肽的合成由上海吉尔生化公司完成；DMSO购自Sigma公司；RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清购自Sigma公司；MouseIFN-γELISAKitⅡ购自BD公司；阳性刺激剂PMA、ConA购自BD公司，离子霉素购自eBioscience公司。3.1.2主要试剂的配制（1）1640基础培养液：取一袋1640干粉，加入到950ml灭菌的去离子水中溶解，再加入NaHCO32g继续溶解，调pH为7.2并定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。（2）1640完全培养液：在1640基础培养液中加入胎牛血清至终浓度为10%，4℃保存备用。（3）Tris-NH4Cl：取氯化铵3.735g，Tris1.3g，溶于去离子水中并定容至500ml，0.22μm过滤，4℃保存备用。（4）PBST：将0.5ml吐温加入到1000mlPBS中，充分搅拌混匀，室温保存备用。（5）显色液：分别由3号液和4号液组成，4℃储存，使用前等体积混匀，底物为TMD。3号液：称取3.15g含有一分子水的柠檬酸(相对分子质量为210.14)，溶于去离子水中并定容至150ml，再称取含3个结晶水的醋酸钠11.56g（相对分子质量为136），溶于去离子水中并定容至85ml，将上述两种溶液混匀，加入0.08g非那西汀，溶解后再加入过氧化脲，完全溶解后4℃保存备用。4号液：称取四甲基联苯胺2.54g溶于1000ml甲醇中，完全溶解后，再将其与1L的丙三醇充分混匀，4℃保存备用。（6）终止液：将98%的浓H2SO4慢慢加入到一定体积的去离子水中，待液体冷却，对其搅拌混匀，常温保存。34 （7）0.4%台盼蓝：取台盼蓝0.2g溶于去离子水中并定容至5ml，分装并于4℃保存。3.1.3主要实验仪器设备仪器名称购买厂家ImmunoWash1575洗板机美国Bio-Rad公司倒置显微镜日本Olympus公司超纯水仪美国Thermo公司NanoDrop2000c分光光度计美国Thermo公司可调式微量移液器一套德国Eppendorf公司CO2培养箱美国Thermo公司电动移液枪德国Eppendorf公司HYC-260药品柜青海海尔特种电器有限公司细胞培养板美国Corning-Coster公司电热恒温水浴锅金坛市晶波实验仪器厂液氮冻存罐美国Thermo公司pH调节器美国MettlerToledo公司3.2实验方法3.2.1动物免疫方法取4-6周龄的Balb/c小鼠16只，分成2组，每组8只，两组分别用纯化的tGP3重组蛋白和复性液对其免疫，免疫的方法采用背部多点注射，蛋白免疫组免疫剂量为20-50μg，共免疫4次，每两周免疫一次，具体方法如下表3.1：35 表3.1小鼠免疫的具体方法免疫时间免疫原免疫剂量免疫方式一免蛋白组tGP3重组蛋白+FCA20-50μg/只背部皮下多点注射200μl/只一免对照组复性液+FCA200μl/只背部皮下多点注射相隔2周二免蛋白组tGP3重组蛋白+FICA20-50μg/只背部皮下多点注射200μl/只相隔2周二免对照组复性液+FICA200μl/只背部皮下多点注射相隔2周三免蛋白组tGP3重组蛋白+FICA20-50μg/只背部皮下多点注射200μl/只背部皮下多点注射相隔2周三免对照组复性液+FICA200μl/只相隔2周四免蛋白组tGP3重组蛋白+FICA20-50μg/只背部皮下多点注射200μl/只相隔2周四免对照组复性液+FICA200μl/只背部皮下多点注射3.2.2间接ELISA检测小鼠多抗血清的效价对四免之后的蛋白组、对照组各取3只老鼠分别剪尾取血，其中蛋白组小鼠编号为P1、P2、P3，对照组小鼠编号为N1、N2、N3，采血时将血清1:100的稀释，即990μlPBS＋10μl血清。使用间接ELISA检测上述6只小鼠多抗血清效价的具体方法如下：首先使用CBS将纯化的tGP3蛋白稀释到2ng/μl，然后100μl/孔对酶标反应板4℃包被过夜，PBST洗板6次、甩干，每孔加入250μl5%脱脂奶37℃2h进行封闭，PBST洗板6次、甩干，然后将6只小鼠的血清各取200μL加入对应的第一孔中，其余的孔先加入100μlPBS，下面按照倍比稀释的方法将血清进行稀释，稀释度依次为第二孔1:200、第三孔1：400、第四孔1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400，最后一孔做空白对照，然后将酶标反应板于37℃孵育1h，PBST洗板6次、甩干，每孔加入100μl1:5000稀释的羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1h，PBST洗板6次、甩干，每孔加入100μl显色液，室温显色5min，每孔加入100μl终止液，立即于酶标仪测其OD450值。36 3.2.3使用IFN-γELISAKitⅡ检测细胞因子3.2.3.1分离淋巴细胞对上述蛋白免疫组效价相对较高的和对照组效价相对较低的小鼠分别取其脾细胞，方法为首先使用颈椎脱臼法处死小鼠，75%的酒精浸泡2-3分钟，减少毛发所造成的污染。然后将小鼠固定在解剖盘上并移入超净工作台内，在无菌条件下，首先使用1640基础培养液将小烧杯上带的120目尼龙网浸湿透，在用剪刀、镊子将腹股沟中线处皮肤剪成一个横口，用手将横口横向撕开，暴露腹腔膜后，再用剪刀镊子切开腹腔膜，露出脾脏，再换一套剪刀镊子，取脾脏并用剪子剪去与其相连的周围组织。将获得脾脏放在刚才已浸湿的带尼龙网的小烧杯上进行研磨，研磨碎后，使用1640基础培养液冲洗尼龙网上的脾细胞，然后将脾细胞转移到玻璃离心瓶中，1000rpm离心10min弃上清，慢慢加入10ml红细胞裂解液，静置5min，加入5ml1640完全培养液终止反应，1000rpm离心10min弃上清，为去除吞噬细胞，向离心瓶中加入5-7ml1640完全培养液后，再将细胞液转移到细胞培养瓶中37℃5%CO2静止1h，收集非贴壁细胞，并进行细胞计数。3.2.3.2肽库的分组以及对脾细胞的刺激首先将编码缺失N端的GP3蛋白的氨基酸序列按照长度为18个氨基酸9个重复的方法分成24个肽段，肽段的氨基酸序列以及对应的序号如下表3.2。表3.2截短的GP3蛋白分成的多肽序列肽段序列号肽段氨基酸序列1TTYCFWFPLVRGNFSFEL2VRGNFSFELTVNYTVCPP3TVNYTVCPPCLTRQAATE4CLTRQAATEIYEPGRSLW5IYEPGRSLWCRIGYDRCE6CRIGYDRCEEDDHDELGF7EDDHDELGFMVPPGLSSE8MVPPGLSSEGHLTSVYAW9GHLTSVYAWLAFLSFSYT10LAFLSFSYTAQFHPEIFG11AQFHPEIFGIGNVSRVYV37 12IGNVSRVYVDIKHQLICA13DIKHQLICAEHDGQNTTL14EHDGQNTTLPRHDNISAV15PRHDNISAVFQTYYQHQV16FQTYYQHQVDGGNWFHLE17DGGNWFHLEWLRPFFSSW18WLRPFFSSWLVLNVSWFL19LVLNVSWFLRRSPANHVS20RRSPANHVSVRVLQILRP21VRVLQILRPTPPQRQALL22TPPQRQALLSSKTSVALG23SSKTSVALGIATRPLRRF24IATRPLRRFAKSLSAVRR阴性肽段QHLAAIEAETCKYLASRL然后将肽段每3-5个为一组分成5个肽库，肽库的组成以及序列号见下表3.3。表3.3各个肽库的组成肽库序列号肽库的组成123452679103111416181942021222351213156阳性刺激剂（PMA）+离子霉素7阴性不相关肽段8DMSO56肽库配制完成后，将两组老鼠的脾细胞按每孔5x10-1x10cell/100μL分别铺于96孔细胞培养板中，然后每个肽库各取2μl加入到各自对应的细胞孔中，每个肽库做三个重复，具体实验计划如下表3.4表3.4刺激源的具体使用方法小鼠编号肽库量每个孔中加入肽库的体积为2μl，浓度为20μg/ml，即每个肽段终浓度均为20μg/ml，蛋白组小鼠的脾细胞阳性肽段体积也为2μl，其中PMA终浓度为对照组小鼠的脾细胞10ng/ml，离子霉素为500ng/ml，阴性肽段体积为2μl，终浓度为20μg/ml，DMSO、高压灭菌的去离子水均为2μl，每个肽库对应的孔做三个重复，37℃5%CO2孵育24h。38 3.2.3.3使用IFN-γELISAKitⅡ检测细胞因子分泌情况孵育过夜后收集样品，135g离心12min，取上清-80℃冻存备用或者直接将每个肽库对应的孔进行IFN-γELISA，具体步骤如下：（1）使用之前先将试剂盒从4℃冰箱拿出放于室温静置15min左右。（2）剪去足够的封板胶纸以及所需的孔数，剩余的重放回4℃冰箱。（3）向每个孔中加入50μlELISAdiluent。（4）向每孔中加入50μl上述每个刺激孔的上清，轻轻摇晃使其混匀，使用封板胶纸密封，室温孵育2h。（5）倒出孵育2h的液体，再向每个孔中加入300μl1×washbuffer，洗板机洗4次，洗过之后用吸水纸甩干。（6）提前15min制备稀释的生物素化的抗小鼠IFN-γ抗体，当96孔全加满时，将48μl的酶结合物稀释液加入到12ml生物素化的抗小鼠IFN-γ抗体中。此时应根据自己的需要，计算需要多少酶结合物稀释液和生物素化的抗小鼠IFN-γ抗体。配制完成后，每孔加入100μl，封板胶纸封住，室温孵育1h。（7）倒出液体再加入300μl1×washbuffer，洗板机洗7次，最后一次洗完之后，在倒出washbuffer之前静置30s-1min，然后甩干。（8）每孔加入100μl显色液，室温避光孵育30min，此时不用封板胶纸封住。（9）每孔加入50μl终止液，迅速使用酶标仪测其OD450nm读数。3.3实验结果3.3.1间接ELISA法检测小鼠多抗血清效价的结果分别对测得的3只阳、阴性小鼠的效价求平均值，其中阳性小鼠结果用鼠号1代表，阴性小鼠结果用鼠号2代表，发现当血清稀释到1：102400时阳性小鼠血清的效价仍是对应阴性小鼠的2.1倍以上，结果见表3.5。这说明纯化的截短的GP3蛋白免疫小鼠之后，机体产生了极强的体液免疫应答。39 表3.5间接ELISA测定的结果鼠血清稀释倍数号1:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:102400空白13.2383.3113.1703.1193.0352.7772.2961.7421.2280.7980.4730.0620.6900.3760.3800.1620.1540.1070.1020.0630.0670.0670.0660.05P/N>2.1>2.1>2.1>2.1>2.1>2.1>2.1>2.1>2.1>2.1>2.13.3.2细胞因子IFN-γELISA结果将上述肽库刺激后的细胞上清进行IFN-γELISA，结果发现只有肽库3、肽库5对应的阳性鼠和阴性鼠OD450比值大于2.1，这说明肽库3和肽库5激起了机体的细胞免疫应答即GP3蛋白氨基酸序列的120-209位，而在这段氨基酸序列中某一个或某几个肽段可能起着主要作用，即可能是GP3蛋白的T细胞表位，具体结果见图3.1。OD450肽库图3.1IFN-γELISA检测结果a、b、c、d、e、f、g、h依次代表表3.3对应的肽库3.4讨论PRRSV在世界各个养猪国家内普遍流行，从最初的爆发到现在已有20年之久，严重威胁着世界养猪国家的经济利益，但是直到目前对该病的了解还不是40 很彻底。机体感染PRRSV病毒后产生的免疫应答有许多特征，比如免疫保护延迟、抗体依赖性增强作用等等，这些都是PRRSV防控的巨大难题。虽然PRRSV感染后体液免疫应答中的中和抗体在抗病毒中发挥着重要作用，但是中和抗体具有延迟产生的特性，并且有报道也指出在含有中和抗体的仔猪体内仍检测到[91-92]病毒血症的存在，因此许多学者将这种现象认为是体液免疫保护无效。而细胞免疫在很多病毒性疾病中起着重要作用，PRRSV也不例外，细胞毒性T细胞在抗病毒感染中扮演着重要角色。Diaz等在疫苗株筛选实验中发现，具有保[93]护作用的疫苗株能够引起强的细胞免疫，即分泌高水平的IFN-γ，所以他认为PRRSV诱导的免疫保护力完全取决于该病毒株诱导的细胞免疫能力。因此筛选T细胞表位并用它来高效的激发机体产生细胞免疫成为了当下的研究热点，而已有报道指出流感病毒和HIV鉴定出的T细胞表位在抗各自病毒感染的过程中起着重要作用，所以为更好的防控PRRSV，筛选其T细胞表位迫在眉睫。GP3蛋白作为PRRSV的次要结构蛋白，大量报道已指出，它可以诱导机体产生细胞免疫，而目前对GP3B细胞表位的研究已有一些，而对其T细胞表位的报道却少之又少，因此在本实验中将GP3蛋白作为对象来筛选它的T细胞表位。在本实验中，我们首先使用纯化的tGP3重组蛋白免疫Balb/c小鼠，然后通过ELISA方法检测小鼠血清效价，发现血清效价可达到1:102400，即血清效价较高，因此认为免疫的tGP3重组蛋白激起小鼠产生了免疫应答，这也为后续初步筛选GP3蛋白T细胞表位的实验做了铺垫。确定免疫过的小鼠产生了免疫应答之后，初步计划是将截短的GP3蛋白对应的氨基酸序列按照长度18个氨基酸、9个重叠的方法合成24个肽段，但是在移交给生物公司合成多肽序列时，其中有4段、编码序号分别是1、8、17、24由于合成多肽的纯度太低，造成无法使用，于是便在剩余的20个肽段中继续筛选T细胞表位。在使用肽库对免疫过小鼠脾细胞进行体外刺激时，考虑到DMSO对细胞的毒作用，也查阅了大量的资料，发现细胞培养液中DMSO含量应至少少于1%，因此我们选用了4-5个肽段为一个肽库。在对照实验中选择阳性刺激剂时，最初选择了PMA+Ionomycin和ConA这两种，然后做了大量的预实验来检测它们各自的刺激效果，结果发现在同样的条件下，PMA+Ionomycin在OD450的读数要比ConA的高，因此最后将PMA+Ionomycin作为后续实验的阳性刺激剂。而在选择刺激时间时，也根据阅读的大量文献做了24h、72h两个梯度进行分析，发现24h和72hIFN-γELISA结果相差不大，考虑到工作效率，选择了24h。综上所述，通过IFN-γELISA41 实验，最终发现有两个肽库它们的阳性鼠的OD450值是其对应阴性鼠的2.1倍以上，即认为在这两个肽库中可能含有激发机体产生细胞免疫应答的T细胞表位。以上的实验过程及结果不仅为后人继续筛选GP3蛋白的T细胞表位做了铺垫，而且对研制新型的亚单位疫苗以及研究PRRSV免疫机理奠定了基础，同时对PRRSV感染后的免疫应答的理解提供了研究依据。42 4实验结论（1）本研究将PRRSV的ORF3去除其N末端的疏水区，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，通过对诱导表达时间和诱导剂IPTG浓度的优化，使得以包涵体的形式存在的tGP3蛋白的表达量达到最大，经过尿素梯度法纯化得到了高纯度的tGP3蛋白，且该蛋白可以和PRRSV阳性血清和好的结合，即具有良好的反应原性。（2）纯化的tGP3蛋白作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，使用ELISA方法检测血清中抗tGP3的多克隆抗体的效价至少能达到1:102400，使用肽库对免疫过小鼠淋巴细胞进行体外刺激，发现有两个肽库对应的阳性鼠OD450值是其阴性鼠OD450值的2.1倍以上，这两个肽库位置在GP3蛋白氨基酸序列的120-209位，这对GP3蛋白T细胞表位的位置进行了初步定位。43 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附录英文缩写词汇表英文缩写英文全称中文全称PRRSVPorcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征病毒syndromevirusPMAPulmonarymacrophage肺泡巨噬细胞ADEAntibodydependentenhancement抗体依赖性增强OIEOfficeInternationalEpizooties世界卫生组织CD8+Clusterofdifferentiation8免疫细胞IFN-αInterferon-αα干扰素IFN-βInterferon-ββ-干扰素IFN-γInterferon-γγ干扰素IL-10Interleukin-10白细胞介素-10MHCMajorhistocompatibilitycomplex主要组织相容性复合体APCAntigenprocessingcell抗原提呈细胞ELISPOTEnzyme-linkedimmunospotassay酶联免疫斑点法BFABrefeldinA蛋白转运抑制剂LBLysogenyBroth溶菌肉汤Amp+Ampicillin氨苄青霉素IPTGIsoprophlthio-beta-galactoside异丙基硫代-β-半乳糖AcrAcrylamide丙烯酰胺SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SDS-PAGESodiumdodecylsulfatepolyacrylamide聚丙烯酰胺凝胶电泳gelBPBBromphenolblue溴酚蓝EDTAEthylenediaminetetraaceticacid四乙酸二氨基乙烯PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液PBSTPhosphatebufferedsalineaddtween-20磷酸盐洗涤缓冲液CBSCarbonatebufferedsaline碳酸盐缓冲液NDADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸bpBasepair碱基对aaAminoacid氨基酸molmole摩尔VVoltage电压TMB3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine3,3’,5,5’-四甲基联苯胺FCAFreundscompleteadjuvant弗氏完全佐剂FICAFreundsincompleteadjuvant弗氏不完全佐剂51 英文缩写英文全称中文全称ELISAEnzyme-linkedimumunosorbentassay酶联免疫吸附实验PPositive阳性对照NNegative阴性对照RPMIRoswellParkMemoriallnstit洛斯维hHour小时minMinute分钟ssecond秒gGram克mLMillitre毫升μLMicrolitre微升g/mlGrampermilliliter克每毫升mg/mlMilligrampermilliliter毫克每毫升μg/mlMicrogrampermilliliter微克每毫升ng/mlNanogrampermilliliter纳克每毫升μmMicron微米nmNanometre纳米rpmRoundperminute转每分钟CO2Carbondioxide二氧化碳DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜FCSFetalcalfserum胎牛血清52 致谢:岁月如歌，光阴似箭，三年的研究生生活即将结束。回首三年的求学历程，最值得庆幸的是我能来到一个这么好的学习环境，让我学到了许多受益无穷的东西，也遇到特别多的良师益友，他们给了我很多的指引和帮助，在此我心中充满了感激。首先要对导师张改平院士和王爱萍教授以衷心的感谢和崇高的敬意。导师以他们敏锐的洞察力、渊博的知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风和对科学的献身精神给我留下了刻骨铭心的印象，使我受益匪浅。还记得刚进入实验室时，由于对新环境不适应、对实验室设备也不是很了解以及实验技能也有所欠缺，因此在进行实验研究时经常毛手毛脚的，甚至还损坏了实验室的设备，给其他同学们的工作带来了许多麻烦，但是导师并没有对此作出批评，而是耐心的开导我们，并且还细心的指导我们的实验操作，同时还在百忙之中根据我们自己的知识水平耐心的给我们设计课题，教我们怎样顺利的完成工作计划等等。这三年来导师为我们创造了优越的科研和学习环境，使得我能圆满地完成整个实验过程，而且也让我在生物科学领域中自由的翱翔。导师不仅在学习上给予我重要的指导，在生活中也给予我很多帮助，每当生活中遇到困难时，导师都会伸出援助之手，比如在学业结束之后我们都要面临着找工作的困难，而导师每当有合适的机会都会给我们介绍，对此我十分感激，认为遇此良师，此生无憾。同时在思想上、人生态度和意志品质方面导师也给予了谆谆教诲，经常鼓励我们做事要坚持、要学会追根究底等等，而这些教益也必将激励着我在今后的人生道路上奋勇向前。所以在此再次真诚的感谢我的导师，因为有他们，我三年的研究生生活才有意义。衷心的感谢河南省农业科学院动物免疫学重点实验室史西保老师，他以多年的实验研究经验，细心的指导着实验过程，使我在实验中减少了许多不必要的失误，省去了很多麻烦，同时他分析问题严谨细致，总是能抓住问题的本质原因，节省了许多时间，在我学习困惑时，他总是能快速开阔我的视野，使我在紧张的学习中学会放松，而当生活困惑时，他也能以朋友的身份给予我许多关怀，让我备受温暖。衷心感谢周景明老师、祁艳华老师，在我顺利完成实验过程中给我提供了许多帮助。周老师不仅在实验过程中给了我许多建议，在最后论文写作过程中也给予的许多指导，在此十分感谢周老师。祁老师也在实验过程中给我提供了许多的便利，她将实验室的各项工作安排的井序有然，给我们提供了优越的实验条件，这与我顺利完成实验任务也是分不开的，在此也十分感谢祁老师。感谢我的师兄师姐栗宁、裴艳艳、李鹏飞、陈菲、赵金梦等在实验过程给予我的帮助；感谢我的同学扣莉云、刘芳冰、李春革、蒋敏等对我工作和生活的关心和帮助；感谢我的师弟师妹孟凤丽、聂守一、牛艳、冉云伟、张秋丽、宋53 瑞雪等给予我实验的帮助。感谢我亲爱的父母，是你们无私的爱与默默的奉献，才让我享有今天这样的成就。你们伟大的爱与支持，时时刻刻激励着我前进，千言万语也表示不了我对您们的感谢，爸爸、妈妈你们辛苦了！最后，感谢郑州大学给我提供一个这样的机会，让我能走进这个美丽的校园，不仅有幸能拜尊敬的张改平院士、王爱萍教授、周景明副教授为师，而且让我认识了这么多可爱的同学。三年时光匆匆流逝，其中的美好回忆将永存我心，值得一生回味。车志芬2016年4月于郑州54 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果作者简介车志芬，女，党员，1990年5月，河南荥阳人。教育背景2009年9月——2013年6月：就读于信阳师范学院华锐学院，生物技术专业，获得理学学士学位。2013年9月——2016年7月：就读于郑州大学生命科学学院，生物工程专业，攻读理学硕士学位。参与科研项目参与了国家自然科学基金项目“猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）结构蛋白T细胞表位图谱的绘制”。获奖情况2013年9月—2014年6月获郑州大学A2类助研奖学金；2014年9月—2015年6月获郑州大学A1类助研奖学金；2015年9月—2016年6月获郑州大学A1类助研奖学金；2014年，在郑州大学第四届“推进法治中国建设、同心共筑中国梦”征文中荣获优秀奖。论文发表情况车志芬，史西保，张改平，扣莉云，周景明，祁艳华，王爱萍*.《猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP4蛋白的原核表达与纯化》已投于《西北农林科技大学学报》55
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