《猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学研究及Nsp7β保守氨基酸对病毒增殖的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
河南农业大学学术硕士学位论文题目猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学研究及Nsp7β保守氨基酸对病毒增殖的影响学位申请人姓名王林建导师姓名张改平学科专业动物学研究方向分子病毒学中国郑州2017年05月 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目：猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学研究及Nsp7β保守氨基酸对病毒增殖的影响英文题目：MolecularEpidemiologyofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusandEffectofConservedAminoAcidsinNsp7βonPRRSVInfectivity学位申请人：王林建导师：张改平专业：动物学研究方向：分子病毒学论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书￣￣￣学匕论猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学研究及理学硕士＆ＩＩＩ文题目Ｎｓｐ７Ｊ３保守氨基酸对病毒增殖的影响类别Ｚｔ王林建Ｉ动物学张改平姓名专业，，姓名学仿论文＇ＺｚＺＺ否如需保密，解密时间年月曰是否保密＾独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研宄成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中做了。与我。明确的说明，并表示了谢意特此声明。々／ｙｋ？＿导师签名研究生签名＿孑專庫６月＜曰期年Ｉ曰曰期月Ｉ曰／学位论文使用授权及知识产权归属承诺、本人完全了解河南农业大学关于保存使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电、子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学。位论文的全部或部分内容本人《完了解河南农业大学知识产权保护办法》的，全有关规定在毕业离开河一，就在间表南农业大后校期从事的科研工作的所有论文，第署单位为河南学发名农业大，试、原报的知识产权均南学验材料始数据、申专利等归河农业大学所有否，。，承担应的法律责任则相：。注保密用学位论文在解密后适于本授权书：：院领导签：研究生签名导师签名学名６？，ｗ７年＞曰期？沖年曰曰期：曰曰期：２７月命＞０年曰／６月 致谢本实验是在河南省农业科学院动物免疫学重点实验室开展的，感谢张改平院士在实验方面的严格要求及在面临实验问题时给予的指导，张院士渊博的学识、科学的思维方式、广阔的思想、精益求精的治学态度和开拓创新的进取精神，不仅培养了出了一大批优秀的研究人员，还使我对科学研究产生了浓厚的兴趣。本实验是在乔松林研究员和陈鑫鑫老师的悉心指导下完成的，他们严谨的科研态度和科研作风、严于律己宽以待人的崇高品德对我产生了深远的影响，在此衷心感谢两位老师在实验研究和论文撰写中给予的悉心指导和帮助。感谢我的指导老师陈鑫鑫和乔松林老师在学习和生活过程中给我各方面的关心和鼓励，陈老师是我人生道路上的榜样，引导着我一直前行在此对两位老师表示深深的敬意和衷心的感谢。感谢动物免疫学重点实验室的邓瑞广研究员、李秀杰书记在实验研究和生活中的关心和帮助。感谢郭军庆、李睿、罗俊、赵东、郅玉宝、李青梅、杨艳艳、卢清侠、邢广旭、刘运超、郝慧芳、程娜、杨继飞、柴书军、李学伍、郭成留、谢伟涛、胡骁飞、滕蔓、王丽、王方雨、史西宝、杨苏珍、孙亚宁、何萍、王建中、刘艳梅等老师在实验中给予的热情帮助和大力支持。感谢河南农业大学生命科学学院长吴建宇、河南省特聘教授杨国庆、郑文明教授、张会勇教授、陈新建教授、张晓霞教授、张海荣教授、夏宗良教授、郭红祥教授、苏丽娟副教授、李文清副教授、张国只老师等在学习期间给予的支持和帮助。感谢动物免疫学重点实验室的师兄赵孟孟、李任峰、王超、孙彦刚、刘迎琦、罗雪刚、魏欣、丁培阳、张宇航、郑关民、李栋梁、蒋大伟、王国强、王彦伟、冯华；师姐姬鹏超、陈玉梅、李华玮、陈静、殷萌琪、于秋颖、刘畅、马红芳、侯婕、宋亚鹏、党露、谢莎、王晶、胡梅、石建州、史巧巧、苏云芳、王妍、王平利、张二芹、黄慧敏；感谢实验室同学赵宝磊、王聚才、李会珍、田书苗、许倩茹、孟凤丽、李雪云、冉云伟、邢云瑞、马圣明、高月、张娜娜、王攀、、张腾及师弟师妹黄晓静、夏爽飞、薛正飞、王晨良、宋丽娜、任婷婷、崔颖磊、王东雨、张雅、李亚菲、南靓靓、李耀正、汪磊、刘豪丽等在生活和实验中给予的帮助及美好回忆。感谢参加我论文评阅和答辩的各位专家教授的指导。深深感谢我的父母含辛茹苦的养育之恩及家人、亲戚、朋友多年来对我学业和生活上无私的支持、鼓励和关怀。王林建2017年05月III 目录目录...........................................................................................................................................IV中文摘要....................................................................................................................................1第一章文献综述......................................................................................................................61.猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征...............................................................................61.1PRRSV形态结构.........................................................................................................61.2PRRSV基因组特征.....................................................................................................61.3PRRSV主要结构蛋白.................................................................................................91.4PRRSV次要结构蛋白.................................................................................................91.5PRRSV非结构蛋白...................................................................................................102.PRRSV基因组复制与亚基因组合成.............................................................................102.1PRRSV基因组复制...................................................................................................102.2PRRSV亚基因组RNA的合成................................................................................123.PRRSV流行变异情况.....................................................................................................134.PRRSV重组.....................................................................................................................145.PRRSV感染性克隆的构建和应用.................................................................................155.1PRRSV感染性克隆的构建.......................................................................................155.2PRRSV感染性克隆的改造和应用...........................................................................156.本研究的目的和意义.....................................................................................................16第二章我国中部地区PRRSV毒株流行病学调查..............................................................171.前言.................................................................................................................................172.材料和方法.....................................................................................................................172.1材料...........................................................................................................................172.1.1细胞、菌种和载体.........................................................................................172.1.2主要试剂.........................................................................................................172.1.3培养基和常用溶液配制................................................................................172.1.4主要仪器........................................................................................................182.2实验方法...................................................................................................................182.2.1总RNA提取..................................................................................................182.2.2RT-PCR扩增...................................................................................................182.2.3目的片段克隆测序........................................................................................19IV 2.2.4序列比对与进化分析....................................................................................202.2.5病毒的分离与增殖.........................................................................................222.2.6免疫荧光试验（IFA）鉴定..........................................................................222.2.7半数组织感染量（TCID50）测定与生长动力曲线绘制.............................223.结果与分析.....................................................................................................................233.1PRRSV流行变异分析...............................................................................................233.1.1Nsp2和ORF5目的基因克隆........................................................................233.1.2Nsp2和GP5基因遗传进化分析...................................................................233.2PRRSV流行毒株分离、鉴定与分析.......................................................................283.2.1HNhx毒株分离...............................................................................................283.2.2HNhx毒株生长动力曲线..............................................................................293.2.3HNhx全基因组序列扩增..............................................................................303.2.4HNhx毒株全基因组遗传进化分析..............................................................313.2.5HNhx全基因序列重组分析..........................................................................324.讨论.................................................................................................................................33第三章PRRSVNsp7β保守位点功能验证............................................................................361.前言.................................................................................................................................362.材料和方法.....................................................................................................................362.1材料...........................................................................................................................362.1.1细胞、菌种和载体.........................................................................................362.1.2主要试剂.........................................................................................................362.1.3培养基和常用溶液配制................................................................................362.1.4主要仪器........................................................................................................372.2实验方法...................................................................................................................372.2.1总RNA提取..................................................................................................372.2.2RT-PCR扩增目的片段...................................................................................382.2.3目的片段克隆测序........................................................................................382.2.4质粒构建........................................................................................................382.2.5质粒转染与病毒拯救....................................................................................382.2.6免疫荧光试验（IFA）鉴定..........................................................................38V 2.2.7WesternBlot.....................................................................................................383.结果与分析.....................................................................................................................403.1PRRSV非结构蛋白Nsp7β保守位点分析...............................................................403.2PRRSV反向遗传操作平台构建...............................................................................403.2.1HN07-1全基因组克隆测序...........................................................................403.2.2反向遗传操作平台构建................................................................................423.2.3rHN07-1和rHN07-1-EGFP毒株拯救与验证..............................................433.3PRRSV非结构蛋白Nsp7β保守位点功能鉴定.......................................................444.讨论...................................................................................................................................44全文总结..................................................................................................................................46参考文献..................................................................................................................................47VI 中文摘要猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSVirus,PRRSV）引起的病毒性传染病。PRRS给世界生猪养殖业带来了巨大的经济损失。PRRSV不断地突变和重组，致使多种变异毒株在各地流行传播。此外，PRRSV具有十分独特而复杂的免疫学特性，其致病机理也未完全揭示。因此对PRRS的控制并未取得实质性成效。本文将从PRRSV的流行变异情况和Nsp7β保守位点对病毒增殖的影响两部分进行探究，为PRRS的预防和治疗奠定基础。（1）PRRSV流行病学研究为了研究我国中部地区PRRSV的流行变异情况，我们扩增并分析了31份ORF5基因和18份Nsp2基因的高度变异区。基于全长ORF5核酸序列进行遗传系统进化分析，其中18株分离株属于NADC30-like毒株，11株分离株属于高致病性毒株（HP-PRRSVs）。同源性分析结果显示，NADC30-likePRRSVs分离株彼此间核酸序列同源性为91.71%-99.34%，HP-PRRSVs分离株彼此的同源性为98.84%-99.67%。氨基酸（aa）序列比对结果显示，HP-PRRSVs分离株几乎没有新氨基酸突变，但NADC30-like毒株则含有大量新氨基酸突变，尤其是在GP5蛋白的诱骗表位、糖基化位点等重要基序区域。值得注意的是，NADC30-like分离株HNhx含有S32H、N33D、D34N和S36G氨基酸变异，导致其丢失了在氨基酸30-35区段所有糖基化位点。为了进一步的了解当前流行的NADC30-like毒株的特性，我们分离了特殊变异株HNhx。全基因组测序与重组分析结果显示，HNhx毒株由NADC30毒株与高致病性毒株的疫苗毒株JXA1-P80重组而来，重组区域为Nsp4(nt5,261)-Nsp9(nt7,911)。以上结果表明，HP-PRRSVs依然在中部地区广泛传播，而NADC30-like毒株则逐渐开始流行；HP-PRRSV毒株相对趋于保守，NADC30-like毒株则经历了快速变异和演化过程。（2）Nsp7β保守位点的作用对46株GenotypeII型PRRSV毒株全基因组氨基酸序列进行比对，我们发现虽然Nsp7β具有一定的变异性，但在所有PRRSV毒株中都存在一段21aa(aa30-50)的保守序列。进一步与动脉炎病毒属中的其它成员比较发现，aa38位点在整个动脉炎病毒科中都相对保守。为了研究Nsp7β保守区域和位点对Nsp7β功能的影响，我们以HP-PRRSV毒株HN07-1为亲本毒株建立了PRRSV反向遗传操作平台。首先对HN07-1毒株进行了全基因组测序和分析，将全长基因组分4段构建到改造后的pCDNA3.1（+）载体中。同时也构建了在ORF1b和ORF2间插入EGFP的重组质粒。将构建完成的质粒转染PRRSV易感细胞Marc145，并进行盲传，盲传一代后，细胞出现了PRRSV感染典型的细胞病变效应，Westernblot和IFA试验结果表明病毒拯救成功。将重组毒株分别命名为rHN07-1和rHN07-1-EGFP，生长动力曲线绘制结果显示，rHN07-1与亲本毒株HN07-1具有相似的生长动力特性，表明rHN07-1可以用于反向遗传操作。利用构建好的cDNA克隆为骨架，对Nsp7β保守区段和位点进行缺失或突变，构建重组质粒进行转染和拯救，结果显示保守区缺失以及aa37/38突变均不能拯救1 出病毒，因此推测aa37/38位点是Nsp7β发挥功能的关键位点。关键词：PRRSV；GP5；Nsp2；进化分析；重组；Nsp7β；感染性克隆2 MolecularEpidemiologyofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusandEffectofConservedAminoAcidsinNsp7βonPRRSVInfectivitySupervisor:Prof.GaipingZhangMaster’sCandidate:Lin-jianWangPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)hascausedenormouslyeconomiclossessinceitsemergenceintheUnitedStatesinthelate1980s.Thecausativeagent,PRRSVischaracteristicofgeneticallyextensivevariationandrecombination,leadingtothewidelyspreadofnumerousmutantstrainsintheworld.PRRSVhasveryuniqueandcompleximmunologicalcharacteristics.Untilnow,thepathogenesishasnotbeenfullyrevealedyetandPRRShasnotbeeneffectivelycontrolledbythetraditionalstrategies.Here,weexploretheprevalenceofPRRSVandtheeffectsofconservedsitesinNsp7ontheinfectivityandproliferationofPRRSV,whichwilllaythefoundationforthepreventionandtreatmentofPRRS.(1)EpidemiologicalinvestigationofPRRSVInthisstudy,31ORF5and18partialNsp2geneswereamplifiedandanalyzedtoinvestigatetheepidemiccharacteristicsofPRRSVsinCentralChinasince2014.PhylogenetictreebasedonORF5revealedthat,amongthem,18isolateswereclusteredintosubgroup1,representedbytheNADC30;11isolateswereclusteredintotheHP-PRRSVssubgroup(subgroup3).HomologyanalysisshowedNADC30-likePRRSVisolatesinsubgroup1shared91.71%-99.34%nucleotidesidentitieswitheachother.AndfortheHP-PRRSVisolatesinsubgroup3,thenucleotidesidentitieswitheachotherwas98.84%-99.67%.Inaddition,NADC30-likePRRSVisolatescontainedextensiveaminoacid(aa)substitutionsincrucialmotifs,suchaspotentialneutralizationepitopesandtheN-glycosylationsites.Interestingly,S32H,N33D,D34N,S36GsubstitutionsinGP5wouldcauseHNhx(NADC30-like)losingallthepotentialN-Glycosylationsitesataa30-35.TobetterunderstandthecharacteristicsofnovelNADC30-likePRRSVcirculatinginChina,weisolateaNADC30-likestrainnamedHNhxandanalyzeitscharacteristic.HNhxcontainsspecificmutationsataa30-35.Full-lengthHNhxgenomesequencewasobtainedby3 amplifying6overlappingfragmentscoveringthefull-lengthgenomeusingreversetranscription-PCR(RT-PCR).RecombinationanalysisrevealedthatHNhxwastheresultofrecombinationbetweentheNADC30virusandHP-PRRSVvaccinestrainJXA1-P80.TherecombinedregionlocatedinNsp4(nt5,261)toNsp9(nt7,911).OurdatasuggestedthattheNADC30-likePRRSVstrainsspreadquicklyandarenowcirculatingandprevalentinCentralChinaaswellastheclassicalHP-PRRSVstrains.HP-PRRSVswererelativelyconservedinCentralChina.Reciprocally,theNADC30-likePRRSVstrainsunderwentextensivemutationandrecombination,leadingtorapidevolution.(2)EffectsofconservedsitesinNsp7onPRRSVinfectivityComparingthecompleteaminoacidsequencesofallavailableGenotypeIIPRRSVstrains,wefoundaconservativeregion(aa30-50)atNsp7βofallthePRRSVs.Inaddition,oneconservedaminoacidsite(aa38)wasfoundintheregionofaa30-50bycomparingthededucedaminoacidsequencesofNsp7βofallthememberswithinarterivirus.ResearchontheconservedregionandaminoacidsitemightbehelpfultodiscoveringthefunctionofNsp7βinthePRRSVreplicationprocess.SoweconstructedthereversegeneticssystemofPRRSVbasedonthegenomeoftheHP-PRRSVstrainHN07-1.ToconstructtheinfectiouscompletecDNAclone,4fragmentscoveringfull-lengthHN07-1genomewereclonedintopCDNA3.1(+)vector(rHN07-1),respectively.Meanwhile,aninfectiouscDNAcloneexpressingforeigngeneGFP(rHN07-1-EGFP)asamarkerwasconstruceted.TheEGFPgenewasinsertedbetweentheORF1bandORF2inanotherinfectiousclone.TheplasmidsweretransfectedintothesusceptibleMarc145cells.Afteronepassage,obviouscytopathiceffect(CPE)ofMarc145cellswasobserved.TheresultsofWesternblotandimmunofluorescentassay(IFA)revealedthatrescuedvirusesweregeneratedsuccessfully.Inaddition,thegrowthkineticofrHN07-1wassimilartoHN07-1,whichindicatedtheconstructedinfectiousclonecouldbeusedforreversegeneticmanipulation.DeletetionormutationoftheconservedregionandaasitesinNsp7βdidnotproduceinfectiousvirus,indicatingthattheaa37/38mightbethekeysitesofNsp7βinfluencingtheproliferationofPRRSV.4 Keyword:PRRSV;GP5;Nsp2;evolutionaryanalysis;recombination;Nsp7β;infectiousclone5 第一章文献综述猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSVirus,PRRSV）引起的以妊娠母猪的晚期流产和各个生长阶段猪的呼吸功能障碍为主要特征的病毒性传染病。此病在上世纪90年代首先在美国和加拿大被报道，后来逐渐在全球范围内流行和传播，成为全球猪病控制上的一大难题[1，2]。猪繁殖与呼吸综合征病毒具有高度的传染性，除了新西兰、瑞典、瑞士和澳大利亚等少数国家没有爆发疫情外，目前在全球其它地区均有发病报道[3]。自从1995年我国首次报道猪繁殖与呼吸综合症以来，该病一直长期流行，给我国生猪养殖业带来巨大经济损失[4]。尤其是2006年以来，以高热、高发病率和高死亡率为特征的由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HighlypathogenicPRRSV,HP-PRRSV）引发的PRRS疫情在我国大面积爆发和流行，造成大批猪死亡，对我国的生猪养殖行业造成了前所未有的巨大打击[5]。猪繁殖与呼吸综合征病毒一直是国内外病毒学领域中的重点研究对象，中外科学家在其病原相关特性、病毒感染对靶细胞功能的影响、宿主的免疫机制等方面做了大量的研究工作。但对猪繁殖与呼吸综合征的控制方面并未取得实质性的成效。PRRSV难以防控存在以下几种原因，一方面是其具有高度变异的特性，另一方面是其十分独特而且复杂的免疫学特性。PRRSV具有复杂多样的免疫逃逸策略，导致保护性免疫应答迟缓，病毒在机体内长期、持续存在[3]。因此深入开展PRRSV流行病学调查，分离最新流行毒株，鉴定影响病毒增殖复制的相关因子，将加速PRRSV防控技术的研究进程，实现我国PRRS防控目标，为我国生猪产业可持续发展提供新的科技支撑。1.猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征1.1PRRSV形态结构电子显微镜下PRRSV病毒粒子直径约为50～65nm，表面相对平滑，只有少数突起。病毒粒子呈现为多种形态，但以球形为主。核衣壳为二十面对称体，核衣壳中心为包被的核酸。电子显微镜下病毒粒子显现为双层，内层为直径约30nm的核心，外层为双层膜结构，内外层之间约有2-3nm的间隔。1.2PRRSV基因组特征PRRSV为套式病毒目动脉炎病毒科中的一员，而在套式病毒目中还包含冠状病毒科和套肝病毒科。它们都是单股正链RNA病毒，具有相同的复制和转录策略、相似的基因组结构、典型的遗传元件，但是它们的形态特征、细胞嗜性、基因组大小、编码的成分、感染的宿主种类和范围、引起疾病类型却不相同。动脉炎病毒科还包含有猴出血热病毒（simianhemorrhagicfevervirus,SHFV）、乳酸脱氢酶增高症病毒（lactatedehydrogenaseelevatingvirus,LDV）、马动脉炎病毒（equinearteritisvirus,EAV）和负鼠颤抖病病毒（wobblypossumdiseasevirus,WPDV）[6，7]。这五种病毒有相似的基因和生物特性，如基因组结构和组成、形态特征和对巨噬细胞系的细胞嗜性。由于有类似的基因组织、典型的遗传元素和同源蛋白的相似功6 能，我们通常通过研究动脉炎病毒属的常用模型EAV和冠状病毒来推测PRRSV相关蛋白的功能。与其它套式病毒如冠状病毒可以在物种之间传播不同，动脉炎病毒属中的每种病毒只能感染一种物种[8]。图1-1.PRRSV基因组结构、转录和翻译[9]。Fig.1-1.PRRSVgenome,transcriptionandtranslation[9].根据猪繁殖与呼吸综合征并病毒的基因组和抗原特性的不同，可将其分为欧洲型（GenotypeI）和美洲型（GenotypeII）。PRRSV基因组长度为14.9kb到15.5kb，通过两种明显不同的转录机制来表达其非结构蛋白和结构蛋白。基因组结构和相关的表达谱如图1-1所示。其5’端为非编码序列（Untranslatedregions,UTR），GenotypeI毒株的5’UTR长度为217–222nt，GenotypeII毒株的5’UTR长度为188–191nt[10]。紧随5’UTR下游的为巨大重叠复制酶开放阅读框（OpenReadingFrame,ORF）。ORF1a/b共享单个翻译起始位点，但是有两个核糖体框架位移（RibosomalFrameShift,RFS）位点，分别在基因组的3889nt处（RFS1；非结构蛋白（Nsp）2）和7695nt处（RFS2;Nsp8/9）[VR-2332（U87392）为参考序列][11-14]。在RFS1位点可生成两个产物；大约有7%的几率发生-1RFS，并导致翻译立即终止产生Nsp2N[15]，大约有20%的几率发生-2RFS产生Nsp2TF[11]。复制酶多聚蛋白pp1a，pp1a-Nsp2N，pp1a-Nsp2TF和pp1ab从全长基因组RNA产生。使用GenotypeII型毒株VR-2332(U87392)作为参考，ORF1a/b由5’近端的约12kb的片段编码[7512ntORF1a，4374ntORF1b]，产生四种不同的多聚蛋白，包括pp1a-Nsp2N（1234氨基酸(aa);RFS1处产生的-1RFS），pp1a-Nsp2TF（1,403aa;RFS1处产生的-2RFS），pp1a（2,503aa）和pp1ab（3,960aa;RFS2处产生的-1RFS）。四种复制酶多聚蛋白共翻译后通过蛋白酶进行的翻译后切割加工产生至少16种不同的非结构蛋白，其中病毒编码的蛋白酶包括木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶1α(PLP1α;Nsp1α)，PLP1β（Nsp1β）和PLP2（Nsp2）和主要丝氨酸蛋白酶（SP;Nsp4）[16]。PLP1α和PLP1β的7 功能为分别切割Nsp1α/Nsp1β和Nsp1β/Nsp2的连接;PLP2负责Nsp2/Nsp3连接处的切割，SP处理产生所有剩余的Nsps产物（Nsp3-12）[16，17]。ORF1a编码的pp1a包含了Nsps1-8，而ORF1ab编码了由所有已知的Nsps（Nsp1α/β，Nsp2-6，Nsp7α/β，Nsp8-12）组成的pp1ab，其中Nsp9是Nsp8的翻译延伸，通过在VR-23327695n（tRFS2）处发生的-1RFS而产生（如图1-1所示）[10，11]。相比之下，结构蛋白通过由负链中间体产生的一组亚基因组RNA（segmentRNA,sgRNA）单独编码表达而来[18]。从遗传学角度来说，除了sgRNA7之外，所有的sgRNA都具有多顺反子性，但是却是功能性的单顺反子或者双顺反子，只有靠近5’末端的ORF被表达（图1-1）。sgRNA2编码的ORF2a/ORF2b分别翻译为GP2和较小的非糖基化囊膜蛋白E；sgRNA3和sgRNA4编码的ORF3和ORF4分别翻译为病毒的次要结构蛋白GP3和GP4；GP2、GP3和GP4一起形成三聚体复合物，并且N-糖基化修饰程度较高，在病毒的入侵中起重要作用[19，20]。sgRNA5编码了ORF5a和ORF5，ORF5a编码GP5a蛋白，是病毒存活所必需的非糖基化蛋白；ORF5编码GP5，GP5是主要糖基化蛋白，在细胞附着结构域的周围存在一定数目的N-聚糖残基[21-24]；ORF6由sgRNA6表达，产生膜蛋白（M）。GP5和M形成二硫键连接的异源二聚体，并一起构成病毒体上的主要糖蛋白复合物[22]。核衣壳蛋白（N）由ORF7编码。N是PRRSV病毒颗粒的主要结构元件，由二硫键连接形成同源二聚体，用于包装病毒基因组RNA（genomeRNA,gRNA），N蛋白是PRRSV病毒颗粒中唯一已知的不编码跨膜结构域结构蛋白[20，25-30]。由于插入和缺失，Nsp2蛋白的编码区是基因组中变异最大的区域，最近有研究表明，Nsp2蛋白可能通过其C段的4到5次跨膜结构域作为一组不同大小的蛋白质异构体插入到病毒粒子中或表面[31-33]。原始的研究显示，在它们中仅有3种（GP5，M和N）蛋白构成了PRRSV蛋白质组成的大部分[34，35]。而最新的研究结果表明在PRRSV进入猪肺泡巨噬细胞（porcinealveolarmacrophages,PAM）时，可能有10个或者更多的病毒蛋白暴露于宿主免疫系统，包括全长的Nsp2及其异构体、Nsp2TF、GP2-5、E、M、N和GP5a[11，36]。然而，所有这些构成PRRSV粒子的蛋白中，从最不保守的Nsp2区域[5，37]到最保守的M蛋白[36，38]，巨大的差异性显示了PRRSV基因组和病毒结构的复杂性和可塑性。5’和3’UTR位于PRRSV基因组的核心蛋白编码区的侧翼（图1-1）。5’和3’UTR都被认为是病毒复制和翻译的基本组分，然而5’和3’UTR的精确功能以及相关的相互作用机制很少被阐明。两者编码的保守的RNA二级结构对复制功能至关重要。5’UTR存在遗传变异，1型和GenotypeII型毒株间有大约50%的遗传同源性，并且在每个基因型内，成对同一性为约96%[39-41]。通过对动脉炎病毒以及亲缘性较远的冠状病毒进行的详细研究，发现5’UTR可调节基因组复制、转录和mRNA翻译等过程，通常认为5’UTR是完成这些功能所必需的多种病毒和宿主因子的停靠位点[42，43]。3’UTR位于ORF7的下游，除去多聚腺苷酸化位点之外长度约114nt（类型1）或148nt（类型2）。3'UTR也存在遗传多样性的，在类型1和类型2之间核苷酸的相似性约为70%，在每个基因型内成对核苷酸同一性约为96%[44]。8 1.3PRRSV主要结构蛋白ORF5编码的糖基化囊膜蛋白GP5，是PRRSV的主要结构蛋白，分子量约为25kd。GP5蛋白N端为31aa的信号肽，在运输过程中被切掉[45]。GP5蛋白经过多次跨膜，含有一段胞内区、一段胞外区和3次跨膜中心区。GP5蛋白可以通过二硫键与M蛋白形成异二聚体，二聚体能够与硫酸乙酰肝素相互作用从而使病毒吸附到细胞表面。GP5蛋白是PRRSV最主要的保护性抗原，含有主要中和表位（aa37-45），能够诱导产生主要中和抗体[46]。同时GP5还具有一个诱骗表位（aa27-30）[47]，能降低中和抗体对GP5的中和作用。研究证明GP5可与唾液酸粘附素结合，有助于病毒里脱衣壳释放到细胞质中。ORF6编码病毒的非糖基化的M蛋白，其N端含有3段疏水结构域，主要定位于滑面内质网中。M蛋白在美洲型和欧洲型两种基因型毒株中都是非常保守的蛋白，并且具有很强的免疫原性。M蛋白与细胞类肝素受体结合，可帮助PRRSV的入侵和感染并在病毒的装配和释放过程中发挥重要作用。ORF7编码PRRSV的核衣壳蛋白（N），是PPRSV中免疫原性最强的结构蛋白，但刺激产生的抗体没有中和保护作用[48，49]。同时，N蛋白是病毒粒子中含量最多的蛋白，约占病毒蛋白总量的40%。N蛋白含有两个核定位信号，在PRRSV感染宿主细胞时，N蛋白入核可能参与对宿主细胞的转录调控作用。N蛋白能够和28S和18SRNA结合[50]，因此推测N蛋白可能与核糖体的生物发生有关。1.4PRRSV次要结构蛋白GP2a蛋白为ORF2a编码的N-糖基化囊膜蛋白，分子量大小为29~30kd。GP2a可通过二硫键和其他结构蛋白形成异源多聚体，在病毒感染过程中发挥重要作用[51]。GP2b（E）蛋白为ORF2b编码的无糖基化的次要结构蛋白，分子量大小约10kd。GP2b的保守性非常高，甚至在北美型和欧洲型两种不同基因型毒株间的同源性都超过了80%。GP2b为离子通道蛋白，之前已经通过核磁共振等结构生物学方法已经证明了GP2b的结构和作用机制，而通过反向遗传操作突变GP2b点后，病毒不能脱衣壳，病毒核酸不能进入宿主细胞[52]。因此，PRRSV非结构蛋白GP2b与病毒的感染入侵过程密切相关。ORF3编码的GP3蛋白，分子量大小为42~50kd。GP3是高度糖基化的结构蛋白，含有7个糖基化位点，这些位点在美洲型和欧洲型毒株中高度保守。但是GP3却是PRRSV中变异最高的结构蛋白之一，美洲型和欧洲型毒株之间的相似度不超过60%[26]。GP3蛋白能诱导产生中和抗体，此外GP3蛋白能够刺激产生强烈的细胞免疫，因此能够为宿主提供一定的保护作用。GP4蛋白为糖基化的囊膜蛋白，分子量大小约为31-35kDa。GP4蛋白的保守性较高，在两种基因型毒株之间的同源性约为70%。病毒的结构蛋白能够通过和受体相互作用介导入侵过程，其中GP4与GP2a形成异源多聚体通过与宿主细胞上的受体CD163相互作用，参与介导PRRSV侵入宿主细胞过程[19]。GP4在病毒的脱衣壳和病毒基因组的释放等方面也9 发挥重要作用。1.5PRRSV非结构蛋白Nsp1是位于pp1a氨基末端的多功能蛋白，包含383个氨基酸。虽然Nsp1α相对保守，但Nsp1β却是高度变异的[53]。Nsp1有自催化的切割活性，通常发生在Met180或His180[54]。Nsp1α的木瓜蛋白酶样蛋白酶活性中心主要位于Cys76和His146（或His147），而Nsp1β的木瓜蛋白酶样蛋白酶活性位于Cys276和His345[55]。PCPα参与PRRSV亚基因组的合成，而Nsp1β的木瓜蛋白酶样蛋白酶活性的丧失导致病毒RNA无法合成[55-57]。Nsp2是PRRSVNsps中变异性最大的，特别是Nsp2的中心区域。在基因型1[53，58，59]和基因型2毒株[5，60-62]中已经报道了多种缺失，表明Nsp2对复制功能来说不是必需的，但对于Nsp2在宿主免疫中发挥功能是重要的或者必需的。该蛋白质具有四个功能区域：NH2-末端的木瓜蛋白酶样蛋白酶结构域（PLP2）[16]；非特异性的中心功能区，不同PRRSV毒株间的大小和氨基酸组成不同；C末端的高度疏水区域和保守的C末端尾部[63，64]。目前对PRRSVNsp3、Nsp5-8和Nsp12的研究较少，还不确证它们具体的功能。Nsp4含有3C样丝氨酸蛋白酶活性，通过其水解作用产生了剩余的非结构蛋白。Nsp9羧基端为RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）功能区，因此Nsp9在基因组的转录和复制中发挥重要作用。已有研究证明EAVNsp9氨基端的区域为尼罗病毒目RdRp相关的核苷酸转移酶（NiRAN）[65]，具有核苷酸转移酶的功能。Nsp10为PRRSV的RNA解旋酶，参与调节亚基因组和基因组的复制。Nsp11含有套式病毒特有的NendoU核酸内切酶[66]，反向遗传学研究发现Nsp11能够参与sgRNA的合成和病毒复制过程。2.PRRSV基因组复制与亚基因组合成2.1PRRSV基因组复制套式病毒的RNA合成机制是正链RNA病毒中最为复杂的，其病毒转录和复制具有独特的属性，如异常大的多顺反子基因组和转录产生的一套含相同5’和3’末端的sgRNA[67，68]。PRRSV的复制与以下几方面过程密切相关：宿主细胞膜重新排列以组装病毒复制复合体（RC）；gRNA的合成和表达；在sgRNA合成和表达为大量结构蛋白的同时可以产生其它一些不规则的亚基因组RNA[69，70]。通过共同的负链合成机制gRNA复制与sgRNA合成密切相关。对负链转录的非随机调控完成gRNA复制或sgRNA的合成，6条亚基因组RNA（sgRNA2-7）是通过不连续转录机制产生的[13，18，71]。目前，对于PRRSV入侵宿主到RC的发展，以及典型的核周双膜囊泡（DMV）的形成等PRRSV感染的建立过程知之甚少。普遍认为DMV来源于内质网（ER），其是病毒复制的主要位点[72]。已经有研究表明EAV复制酶蛋白（ORF1a/b）足以实现病毒的复制[73]，但是感染却必须依赖于动脉炎病毒基因组3’末端编码的结构基因的存在[74]。病毒在进入宿主时，gRNA作为mRNA立即起始复制酶多聚蛋白的翻译。在ORF1a内，三种非结构蛋白Nsp2、Nsp3和Nsp5为跨膜蛋白。研究表明EAV的非结构蛋白Nsp2和Nsp3显示可以调节10 宿主细胞膜产生类似于病毒感染期间观察到的DMV结构[75]。膜整合以及可能的跨膜蛋白间的相互作用有助于扭转现有膜结构形成DMV。当前，DMV形成的机制仍然是未知的，但可能涉及对自噬和/或凋亡途径的调节作用[76-79]。ORF1b编码了PRRSV复制所需的核心元件，包括RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp;Nsp9），锌结合结构域（ZBD;Nsp10），RNA解旋酶（Nsp10）和保守的病毒尿苷酸特异性内切核糖核酸酶（NendoU;Nsp11）[80]。核糖体在RFS1（6-7%-1RFS;16-20%-2RFS）[11]和RFS2（〜20%）处的移位效率表明ORF1b（Nsp9-12）在每六次翻译事件中大约发生一次（15%），因此与5’端编码的复制酶蛋白相比，核心复制体所需的计量要求较低。RdRps形成一个典型的右手结构（包括拇指，手掌，手指），拇指和手指接触形成了接受基质的口袋[81]。虽然序列的同源性较低，但是单链和双链RNA病毒的RdRps结构有明显的相似性[81]。所有聚合酶共享一组核心的保守基序，这暗示它们可能拥有共同的祖先[82]。系统进化分析发现套式病毒的RdRp与小核糖核酸病毒总科在同一分支[68]，但有一个SDD（Ser-Asp-Asp）标签，位于RdRp掌侧上的活性位点内。SDD基序是套式病毒家族的标志，可与包含GDD（Gly-Asp-Asp）基序的其他正链RNA病毒群区分开。研究显示SDD基序对EAV复制起关键作用[83]，PRRSVRdRp的S→G突变不影响gRNA的复制能力，但却导致sgRNA的合成缺陷[84]。此外，与冠状病毒不同的是，动脉炎病毒的RdRp没有3'校对功能[85]，因此显著的提高了突变频率。Nsp10编码PRRSV解旋酶蛋白。PRRSV多结构域解旋酶（HEL）由在1型超家族解旋酶中发现典型的核1A和2A结构域，柔性附属结构域（1B）和独特的锌结合结构域（ZBD）组成[86]。PRRSV的HEL能以5’至3’极性解开dsRNA[87]。1B结构域和ZBD都对EAV的复制功能至关重要，包括gRNA复制和sgRNA的合成[88]。据推测解旋酶与RdRp协同作用以促进复制和转录。然而，仍然不清楚5’至3’方向的解旋酶和3’至5’方向的RdRp怎样共同调整这些过程[89]。Nsp11具有胞病毒尿苷酸特异性内切核糖核酸酶（NendoU）结构域[80]。已经证明EAVNendoU是基因组复制所必需的，并且关键残基的突变对复制和sgRNA合成具有不同程度的影响，尤其是sgRNA的合成[90]。与冠状病毒突发急性呼吸道病毒（SARS）同源蛋白Nsp15不同的是，Nsp11不依赖二价阳离子Mn2+的存在。EAVNendoU蛋白也能切割3’嘧啶，并优先切割未成对的嘧啶，释放具有2’，3’-环磷酸和5’-OH末端的产物。然而NendoU在套式病毒中的功能还为验证。PRRSVRdRp是通过引物依赖性机制还通过从头合成启动复制至今未有定论。在缺乏引物情况下，多聚（U）或多聚（C）为模板时，EAVRdRp有生物活性。而当多聚（A）作为模板时则无活性，表明PRRSVRdRp是依据特异性模板从头合成启动复制的[91]。当在多聚（U）或多聚（C）为模板的体系中加入引物后降低了RdRp的活性[91]。RdRp不起末端转移酶的作用，虽然动脉病毒RdRp有催化活性并且能够从头合成，但可能需要其它病毒或细胞11 辅因子的帮助来高效地进行复制或转录过程。通常正链RNA病毒可通过其末端非编码区形成的高阶RNA二级结构的构象转化来调节翻译、sgRNA的转录和基因组复制。因此，RdRp、HEL、5’UTR、3’UTR和其他未知的病毒蛋白等这些散布在基因组的多个编码区内的关键遗传元件或蛋白相互作用是PRRSV有效复制和转录所必需的。2.2PRRSV亚基因组RNA的合成病毒可以有选择性地在时间和数量上调节转录和翻译过程[92]。在PRRSV基因组内，非结构蛋白复制酶和结构蛋白之间的表达机制是分开的。这样便于gRNA快速表达Nsps，随后sgRNAs以不同的摩尔比生成，最小的RNA通常最丰富[93]。在PRRSV基因组内由病毒RdRp参与编码合成sgRNA的过程是高度有序的。sgRNA包括5’UTR和聚腺苷酸化3'UTR以及来自基因组3’区域（ORF2-7）的一个或多个ORF，但并不含有约12kb复制酶编码区（ORF1a/b）（图1-1）[68]。在负链合成期间，通过长程RNA-RNA的相互作用，有义和反义茎环（SL）结构间产生碱基配对，进而引起病毒基因组下游多个3’端位点与5’UTR间复制融合，导致不连续复制的发生[18]。在每个结构蛋白编码区（ORF2-7）的5’端或附近存在反义转录调节序列（TRS），它们可以各自与位于5’UTR3’末端保守的TRS序列（UUAACC）接合发生相互作用。sgRNA合成和gRNA复制利用相似的初始合成机制，但是当遇见基因组内的体TRS信号序列时，从3’末端起始的负链转录延伸终止（图1-2）[93]。体TRS形成了茎-环结构，而在环状结构内编码了保守的庚糖核苷酸一级序列（体TRS信号）。该信号终止负链的转录，可以产生转录通读并继续合成；或者分离转录复合体并与5’UTR第二个茎环结构形成互补碱基配对而连接到前导TRS序列[94]。5’UTR内的前导TRS序列位于Nsp1α的AUG起始密码子的上游，并且是5’UTR和Nsp1α编码区间高度有序并且保守的RNA二级结构的一部分。所有体TRS位点的转录通读将导致gRNA合成。在体TRS处从基因组链解偶联并与前导TRS重新连接导致了不连续转录，产生六种sgRNA产物中的一种（取决于利用哪种体TRS）（图1-2）[71]。完整的EAVNsp1结构以及与其相互作用的细胞辅因子p100对于转录也是不可缺少的[57，95，96]。图1-2亚基因组RNA的合成机制[9]。Fig.1-2.IntragenomichomologousrecombinationduringnegativestrandsynthesistoproducesgRNA[9].12 虽然sgRNA产生机制是保守的，但是不连续转录过程却能够利用典型和非典型的TRS位点，而且存在毒株特异性[13]。经典和非经典TRS位点通常在PRRSV结构蛋白编码区之前，其功能是以不同的效率驱动sgRNA的合成，分别产生编码相同结构蛋白的主要和次要sgRNA。例如，美洲型PRRSV毒株VR-2332可以利用两个或者更多不同的体TRS与前导TRS连接产生不同的sgRNA4和sgRNA7亚类，也可以产生单独的一类sgRNA5-1，表达截短的GP5[13]。sgRNA7为最丰富的sgRNA，将EAVORF7体TRS突变后发现无sgRNA7的产生，但是会导致sgRNA6、5、4和2的明显增加，而sgRNA3的产生保持不变。另外，如果突变了前导TRS内保守序列（5’-UCAAG-3’）的第五核苷酸，除了sgRNA3之外所有的sgRNA都不能合成[18]。sgRNA3.1使用的非经典体TRS（5’-UCAAUACCC-3’）与经典的体TRS相比缺少了3'末端C残基，但却有额外的5个核苷酸（UACCC），可与前导TRS序列下游邻接的序列相匹配。因此EAV和PRRSV可以半依赖非经典TRS而生成sgRNA3.1[18]。敲除EAVORF3、4或5的经典体TRS序列后，可利用编码区内的第二TRS序列产生野生型水平的感染率。目前仍不清楚非经典的体TRS是否作为辅助机制拯救由易错的RdRp产生的有害突变，或者它们在病毒生命周期内有其他作用。欧洲型PRRSV毒株Lelystad病毒（LV）的sgRNA具有保守的6个核苷酸连接序列UCAACC（或相似序列），但在接合位点显示异质性，表明连接机制可能是“不精确的”[97]。提取美洲型PRRSV毒株感染的细胞的RNA进行RT-PCR，进一步研究鉴定了类似的共同前导TRS与体TRS连接序列U(G)UA(G/C)ACC[13]。在这些连接位点处也存在遗传异质性，从单个碱基的差异到几个核苷酸的差异，表明在该步骤中病毒RdRp的分离和重新连接有一定的灵活性。此外，除了主要的sgRNA7转录本外，1型和GenotypeII型PRRSV毒株间的体TRS基序与sgRNA翻译起始位点AUG的距离是不同[13]。除此之外，经Northern法分析显示，不同PRRSV毒株每种sgRNA的转录本是不等的，并且其TRS基序也是不同[98-100]。因此，比较不同的PRRSV病毒株调节sgRNA合成的机制时，比研究单个毒株时更复杂。3.PRRSV流行变异情况由于缺少校正酶，PRRSV在病毒复制过程中极易引入突变，因此PRRSV是变异率最高的病毒之一，因此PRRSV呈多样性存在。20世纪90年代中期美国爱荷华州出现了“非典型”或“急性”突变体[101]，2001年美国明尼苏达州突然爆发一种名为MN184的新型PRRSV毒株[37]，2006年在中国及随后大多数亚洲国家爆发的高度致病性PRRSV毒株[5]，以及最近在中国出现的NADC30-like毒株[62，102-106]，这些表性毒株的出现体现了PRRSV高度多态性和变异性。在多数情况下，新的分离株一般是突然出现的，并且呈现不同的基因组特征，时常伴随插入或缺失（通常是Nsp2），并且通常含有可检测的重组断裂点。PRRSV的表型和遗传多样性可能是由于持久性的感染、复制和重组的特性产生的灵活多变的病毒基因组，从而规避宿主应答、疫苗接种或其它方式的清除。自从1995年首次报道猪繁殖与呼吸综合症以来，PRRSV在我国普遍流行，并一直困扰13 着生猪养殖业。我国流行的PRRSV主要以美洲型毒株为主，但在个别地区有时也有欧洲型毒株被分离到，而且由于贸易往来的加强，欧洲型毒株的感染近年来在我国也呈上升趋势[107-109]。2006年，江西省首先出现了一种未知原因的高热病，随后迅速蔓延至我国多地。该病发病率和死亡率极高，传播快，波及范围广。通过大量研究工作最终确认是由PRRSV变异株引起的，此变异型毒株比经典PRRSV的毒力增强明显，所以将其命名为高致病性猪繁殖与呼吸道症病毒[5]。在对其氨基酸序列进行分析时发现，与经典PRRSV相比，HP-PRRSV在非结构蛋白Nsp2区域普遍存在不连续缺失的30个氨基酸。但后来经过反向遗产操作系统验证，发现Nsp2氨基酸的缺失与病毒毒力增强并没有直接关系[110]。2006-2010年，河南省的猪繁殖与呼吸道综合征病毒的流行毒株主要为高致病性毒株，经典毒株也时常被检测到，有时还会出现两种毒株的混合感染[111]。从2012年底开始，多个省份相继爆发了新一轮PRRS疫情，国内学者和检测机构陆续检测并分离到了HENAN-XINX、HENAN-HEB、CHsx1401等[102-104]与NADC-30毒株进化关系非常相近的一类毒株，被命名为NADC30-like毒株。NADC30-likePRRSV毒株主要的分子标志位Nsp区域存在不连续的131个氨基酸的缺失。该类毒株引发病毒的主要特征为母猪流产等繁殖障碍，以及哺乳仔猪、保育猪和生长育肥猪的呼吸道疾病，感染猪细菌性继发感染和死胎率增高。该毒株可在猪场持续存在很长时间，造成种猪群和生长猪群生产成绩极不稳定。研究表明现有的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗并不能有效预防和控制该毒株的感染和临床发病[112]。此外，研究表明NADC30-likePRRSV毒株容易与国内存在的C-PRRRSV和HP-PRRV发生重组，进一步加剧了控制PRRS疫情的难度[62，104-106]。4.PRRSV重组同源重组首先在鼠肝炎病毒（MHV）（冠状病毒）中发现，并且作者认为在病毒RNA复制期间可能产生短于全长的RNA中间体。这些早期研究提出MHV复制以不连续的方式进行，在二级和三级结构相应位点产生游离RNA中间体，可以用于选择复制机制产生RNA重组[113]。不存在选择压力的情况下，发现MHVRNA重组是随机的，但是经组织培养传代后，仅筛选出某些重组体，因此可以得出结论：RNA基因组中存在重组“热点”[61]。在负链和正链RNA转录期间都可以检测到重组，重组也不仅发生在两种不同的病毒株之间，甚至正在复制病毒RNA和转染的非复制型MHVRNA片段之间也可发生重组。检测病毒经细胞或动物活体培养后的重组体发现，重组易于发生在高度变异区，这些高变区易于产生缺失[114]。许多早期结论已经在PRRSV中得到证明，除了ORF6外，ORF2、3、4、5和7都发生基因内重组或基因转换[115]。第一次通过实验手段检测到PRRSV重组是使用了两种不同的GenotypeII型PRRSV毒株感染MA-104细胞。RT-PCR扩增ORF3至ORF5的约1182bp大小的片段，检测克隆培养的子代病毒在该跨度内的重组事件。选择五个克隆用于序列分析，结果显示四个克隆各自有一个独特的交换，一个克隆是三重交叉重组体。在RT-PCR分析之前，使用RNA酶处理细胞上清液，重组的RNA没有降解，因此重组的RNA应该被包装在14 病毒内，从而被保护免于降解。此外，重组体可以在三次传代内检测到，但最终复制动力学高的毒株会超越这些重组毒株而成为优势毒株。细胞培养的重组频率高达10%，并且在动物体内也可以检测到重组体[116]。使用1型PRRSV完成类似的实验，报道仅在621bp片段内发生0.1和2.5％RNA重组的频率，可能重组事件与所分析的片段的大小有关[117]。已经报道了很多不同的算法来检测同基因型PRRSV野毒株间的重组，目前发现的重组热点多在3'端结构基因、Nsp2和Nsp9中[118，119]。尽管断裂点和重组体可以帮助我们了解病毒的重组进化，但是我们仍然没有阐明PRRSV利用哪些自身或宿主的分子进行重组以及动脉病毒同源和非同源重组的详细机制。5.PRRSV感染性克隆的构建和应用5.1PRRSV感染性克隆的构建负链RNA病毒的基因组是非感染性的，并且其在细胞中的复制需要核糖核蛋白（RNP）复合物作为感染单元。相比之下，来自正链RNA病毒的基因组具有完全感染性，因此构建感染性克隆的核心是全长cDNA克隆的组装[120，121]。为了获得可以进行分子操作的模板，首先使用逆转录酶和DNA聚合酶构建全长cDNA克隆。目前已经建立了两种策略实现从全长拷贝的病毒基因组到产生子代病毒：RNA转染和DNA转染。在RNA转染策略中，通过T7或SP6RNA聚合酶与紧邻病毒基因组上游的相应启动子在体外转录合成病毒RNA。然后将合成的RNA基因组导入细胞中以启动感染周期。在DNA转染策略中，将全长基因组克隆置于真核启动子下，例如巨细胞病毒（CMV）启动子，将完整质粒导入细胞中，通过真核细胞核的功能起始病毒基因组的转录。在核中转录的病毒基因组被输出到细胞质中并进行病毒基因组翻译和复制。该策略省略了基因组RNA的体外合成和转染的步骤，因此降低转染期间RNA的降解，并且使转染效率变得一致[122]。5.2PRRSV感染性克隆的改造和应用反向遗传操作平台可以实现对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、插入、缺失、置换等，从而研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响。由于PRRSV基因组较大，穿梭质粒作为中间平台，通过病毒靶基因组序列两端的一对独特酶切位点，将突变引入穿梭质粒中的靶位点或序列。感染性克隆是在体内感染水平上研究蛋白质和基因组序列的结构与功能的重要分子工具。可以突变或缺失病毒的特异性序列基序，并观测它们的表型以确定相应蛋白和基因组结构的功能。构建去除GP5的N34和N51处N-糖基化的变异病毒，发现其可以诱导产生高水平的中和抗体，并且对血清中和抗体的敏感性增加[123]。在N34、N44和N51处等N-连接的糖基化位点引入多个突变可以显着降低病毒产量[124]。通过改变翻译起始密码子引入突变敲除基因E，PRRSV基因组可以复制和转录，但不产生感染性后代，表明E蛋白是病毒体装配所必需的[52]。通过感染性克隆构建嵌合的病毒，可以鉴定影响病毒嗜性或其他特性的蛋白分子。如使15 用PRRSV感染性克隆作为骨架，使用其它动脉炎病毒取代PRRSV的次要包膜蛋白和E蛋白，拯救的嵌合病毒有较宽的细胞嗜性，但失去感染PAM的能力。这表明GP2/GP3/GP4次要蛋白有影响入侵和细胞嗜性的决定簇[125]。高致病性毒株Nsp2包含有30个氨基酸的缺失，通过Nsp2基因交换研究显示Nsp2中的缺失与毒力和致病性无关[110]。最近的一项研究发现，通过高致病性和低致病性毒株编码区交换，发现Nsp9和Nsp10是导致HP-PRRSV高致病性和高致死毒力的主要原因[126]。PRRSV也可作为载体表达外源基因，其中Nsp2基因作为插入位点成功表达了绿色荧光蛋白（GFP）和FLAG标签[127，128]。ORF1b和ORF2间有一个碱基的间隔，将外源基因与TRS拷贝一起插入该位点，不改变病毒基因的编码序列，并且对病毒蛋白的表达和翻译后修饰的影响降低到最小化的[122]。与在Nsp2中的插入相比，该位点适合于外源基因插入，插入GFP的重组病毒传代37次后仍然是稳定的，而没有基因或荧光的损失[129]。猪圆环GenotypeII型病毒（PCV2）的衣壳蛋白，盘状病毒（海葵）红色荧光蛋白（DsRED）、海肾萤光素酶（Rluc）、IFN-α、IFN-β、IFN-δ和IFN-ω等其他外源基因都已表达成功[130]。PRRSV感染性克隆性的高效性和DNA重组技术的发展使得操纵病毒基因组以及将特异性突变引入靶向序列和产生遗传修饰的突变病毒成为可能。PRRSV的反向遗传学是一种强大的遗传工具，并且可用于基因修饰疫苗和基因载体。6.本研究的目的和意义2006年前后出现的高致病性PRRSV毒株给我国生猪养殖业带来了巨大的经济损失。近期，NADC30-likePRRSV毒株导致我国多个省份相继爆发了PRRS疫情（2013-2014），但是在我国中部地区（河南、山西）关于PRRSV流行和变异情况的信息非常有限。因此，本研究将采集中部地区PRRSV阳性临床样本，进行PRRSV的流行病学和遗传多样性分析。并分离最新的PRRSV流行毒株，分析研究其遗传进化特征。这项工作将提供有关PRRSV进化和遗传多样性的最新信息，为PRRSV的预防和治疗提供帮助。PRRSV非结构蛋白在病毒复制和增殖过程中发挥着重要作用，但仍有部分非结构蛋白的功能没有被揭示。其中Nsp7是猪繁殖与呼吸综合征病毒中较为保守的非结构蛋白之一。Nsp7、Nsp7α和Nsp7β的缺失对病毒是致命的，一系列的Nsp7α突变实验表明大多数突变以某些方式影响了PRRSV复制循环，并且导致病毒拯救失败，这些位点的鉴定对于了解Nsp7的结构或功能至关重要。然而当前对Nsp7β的研究仍然很少，且其具体功能仍然不清楚。因此我们对PRRSV毒株的Nsp7β进行分析，发现并验证保守区域和位点对PRRSV复制增殖的影响。这项工作将为Nsp7β功能的解析以及PRRSV的增殖复制机制的阐明奠定基础。16 第二章我国中部地区PRRSV毒株流行病学调查1.前言自1995年我国首次爆发以来，PRRS疫情在各地迅速蔓延。而2006年出现的经典高致病性PRRSV，给我国生猪养殖业带来了巨大的损失。HP-PRRSV引起各年龄段猪的连续高热，发病率和死亡率非常高。HP-PRRSV基因组结构的主要特征是Nsp2区域存在不连续的30个氨基酸缺失。近期，多地出现了与起源于加拿大然后传播到美国的中等强度毒株NADC30毒株有高度同源性的NADC30-like毒株，主要的分子特征为Nsp2中存在131个不连续的氨基酸缺失。NADC30-likePRRSV导致我国多个省份相继爆发PRRS疫情（2013-2014），但是在我国中部地区（河南、山西）只有有限的PRRSV流行情况信息，PRRSV毒株的多样性及其遗传进化尚不清楚。因此自2014年以来，我们收集了我国中部不同农场的阳性临床样本，进行PRRSV的流行病学和遗传多样性分析。这项工作将提供有关PRRSV遗传进化和流行多样性的最新信息。2.材料和方法2.1材料2.1.1细胞、菌种和载体PAMs和Marc145细胞由河南省动物免疫学重点实验室保存；JM109感受态细胞和pMD19-T(simple)Vector购自宝生物(大连)工程有限公司。2.1.2主要试剂TRIzol、胎牛血清（FBS）、琼脂糖凝胶购自赛默飞世尔科技公司；RPM1640培养基、胰蛋白酶（含EDTA）、青-链霉素（双抗）、DMEM培养基购自北京索莱宝科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNase-Free水、DNA连接试剂盒（DNAligationkitVer.2.1）、随机6引物、SMARTer®RACE5’/3’Kit购自宝生物(大连)工程有限公司；通用型DNA纯化试剂盒（UniversalDNAPurificationKit）购自天跟生化科技（北京）有限公司。Q5超保真DNA聚合酶和T4连接酶购自NEB公司；羊抗鼠二抗购自Abbkine公司；PRRSVN蛋白抗体由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备。2.1.3培养基和常用溶液配制LB培养基的配制：1%(w/v)Tryptone（胰蛋白胨）；0.5%(w/v)YeastExtract（酵母提取物）；1%(w/v)NaCl，高压灭菌15min。PBS（10mM/LPH7.2）：0.145mol/LNaCl；2.28mmol/LNaH2PO4·H2O；7.74mmol/LNa2HPO4·12H2OPBST：PBS；0.05%(v/v)吐温-20（v/v）封闭液：1×PBST；5%(w/v)脱脂牛奶细胞固定液：甲醇；2%双氧水Amp贮存液(50mg/ml)：500mgAmp溶于10ml蒸馏水中，0.22µm滤器过滤除菌，分17 装于1.5ml小管中,-20℃冰箱保存。50×TAE：Tris242g，冰醋酸57.1ml，0.5MEDTA(pH8.0)100ml，加水定容至1L。2.1.4主要仪器SW-CJ-2FD型超净工作台苏州净化设备有限公司ZS-2200型凝胶成像仪美国基因工程公司-80℃超低温冰箱日本三洋公司电子分析天平梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司低温保存箱海尔集团Mini-PROTEAN®Tetra电泳槽美国BIO-RAD公司PowerPac电泳仪美国BIO-RAD公司HeraeusPico17微型离心机美国Thermo公司CR21GII高速台式离心机日本HITACHI公司NanoDrop分光光度计美国Thermo公司IKA®MS3basic小型振荡器德国IKA公司台式pH计瑞士Mettler-Toledo公司超纯水系统美国Millipore公司荧光倒置显微镜德国LEICA公司PTC-200型PCR仪美国基因仪器公司2.2实验方法2.2.1总RNA提取将收集到的病料用TRIzolReagent抽提总RNA，具体操作步骤简介如下：（1）取组织病料（肺脏、肾脏等脏器）匀浆后，用PBS缓冲液按1：10（v/m）稀释。（2）取100µl组织悬液，加入1mlTRIzolReagent颠倒混合均匀，室温放置10min。（3）加入200µl三氯甲烷，轻轻颠倒几次，室温放置10min。（4）4℃，12,000g，离心15min，将上清移入新的1.5ml离心管中。（5）加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀几次，冰上放置10min。（6）4℃，12,000g，离心5min，弃上清。（7）加入预冷的75%乙醇1ml，洗涤一次，于4℃，7,500g，离心10min，弃去上清。（8）自然干燥后加10ulRNase-Free水溶解。（9）使用分光光度计测定RNA含量。2.2.2RT-PCR扩增使用特异扩增引物克隆目的片段，方法步骤如下所示：（1）反转录：（20µl体系）18 5×M-MLVbuffer4µldNTP(25pmol/µl)1µl随机6引物(10pmol/µl)0.5µlOligdT15(10pmol/µl)0.5µlRNA酶抑制剂0.5µlM-MLV反转录酶0.1µlRNA模板2-5μgddH2Oaddto20µl程序：42℃1h；95℃15min；4℃保存。（2）PCR（25µl体系）ExTaq2xMasterMix/Q5超保真DNA聚合酶12.5µl上游引物(10pmol/µl)1µl下游引物(10pmol/µl)1µlcDNA2µlddH2O8.5µl程序：94℃10min；94℃30s；55℃30s；72℃1kb/min；30次循环72℃延伸10min；4℃保存。（3）产物进行琼脂糖凝胶电泳分析2.2.3目的片段克隆测序2.2.3.1目的片段回收将目的条带从琼脂糖凝胶中切割下来，称重后按通用型DNA纯化试剂盒（UniversalDNAPurificationKit）操作说明回收目的片段，片测定回收片段浓度。2.2.3.2目的片段连接将目的片段连接到pMD19-T(simple)Vector上，连接体系与步骤如下所示：SolutionⅠ5µl载体（pMD19-Tsimple）1µl目的片段1-4µlddH2Oaddto10µl放于16℃水浴锅中连接2h。19 2.2.3.3连接产物转化（1）取5µl连接产物加入100µlE.coliJM109感受态细胞中。轻轻混匀后，冰上放置30min。（2）放于42℃水浴锅中热激60s，然后放置于冰上5min。（3）在超净台里，向离心管中加790µlLB液体培养基，37℃，220rpm培养1h。（4）将培养的菌液以4,000g离心3min，留约100µl上清，重悬菌体沉淀。（5）取菌液涂布于含Amp+的LB平板上，37℃倒置培养过夜。2.2.3.4筛选阳性克隆用PCR鉴定阳性克隆，并进行测序。菌液PCR鉴定（25µl体系）：ExTaq2xMasterMix10µl载体上游引物(10pmol/µl)0.5µl载体下游引物(10pmol/µl)0.5µl菌液1µlddH2O8µl程序：（1）94℃10min；（2）94℃30s；（3）55℃30s；（4）72℃1min/kb；（2-4）循环30次；（5）72℃延伸10min；（6）4℃保存。所得产物进行琼脂糖凝胶电泳实验鉴定特异的目的条带，将阳性克隆送至上海生工公司进行测序。2.2.4序列比对与进化分析测序结果经DNAStar等生物软件处理后上传至NCBI，登录号和分离株的来源信息见表2-1。利用DNAMAN和DNAStar软件对分离株的ORF5和Nsp2基因与VR2332、CH-1a、JXA1、HB-1、NADC30等参考毒株（表2-1）进行核酸相似性分析。使用MegAlign软件对推定的GP5和Nsp2氨基酸序列进行变异分析。使用MEGA6.06软件基于ORF5、Nsp2和全基因组核苷酸序列构建进化树，进行系统发育进化分析。在重组检测程序RDP4（v.4.51）中使用七个重组检测方法（RDP，GENECONV，BOOTSCAN，MaxChi，Chimaera，3Seq和SISCAN）鉴定重组序列和断裂位点。并通过SimPlot(v.3.5.1)进一步验证可能存在的重组事件。20 表2-1本文中分离毒株和参考毒株信息。Table2-1InformationofisolatedandreferencePRRSVStrainsinthisstudy.SamplestrainsAccessionnumbersOriginSamplestrainsAccessionnumbersOriginSXJAKU557004(GP5)China,2014HENLY2KU556985(GP5)China,2014HENXPKU556998(GP5)China,2014HENJY1KU556981(GP5)China,2014HENFYKU556994(GP5)China,2014HENNYKU556986(GP5)China,2014HENHB1KU556995(GP5)China,2014HENSP1KU556989(GP5)China,2014HENHB2KU556996(GP5)China,2014HENSP2KU556990(GP5)China,2014HENZGKU556999(GP5)China,2014HENYYKU556992(GP5)China,2014HENZYKU557001(GP5)China,2014HENJY2KU556982(GP5)China,2014HENZMDKU557000(GP5)China,2014SXGP2KU557003(GP5)China,2014SXGP1KU557002(GP5)China,2014HENHJKU556997(GP5)China,2014HENQXKU556988(GP5)China,2015HENHBYCKU556980(GP5)China,2014HEN15-1KU556977(GP5)China,2015HENZMKU556993(GP5)China,2015HENPDSKU556987(GP5)China,2014HENKFKU556983(GP5)China,2015HENFQ01KU556979(GP5)China,2014HENWSKU556991(GP5)China,2015HENLY1KU556984(GP5)China,2014HENDD03KU556978(GP5)China,2015HENDD02KU557005(GP5)China,2015HENLY3KU557006(GP5)China,2015SXJAKU557020(NSP2)China,2014HENQXKU557023(NSP2)China,2015HENXPKU557014(NSP2)China,2014HEN15-1KU557021(NSP2)China,2015HENFYKU557008(NSP2)China,2014HENDD01KU557022(NSP2)China,2015HENHB1KU557009(NSP2)China,2014HENHM1KU557011(NSP2)China,2014HENHB2KU557010(NSP2)China,2014HENHM2KU557012(NSP2)China,2014HENZGKU557016(NSP2)China,2014HENXXKU557015(NSP2)China,2014HENZYKU557018(NSP2)China,2014HENPKKU557013(NSP2)China,2014HENZMDKU557017(NSP2)China,2014HENFQ02KU557007(NSP2)China,2014SXGP1KU557019(NSP2)China,2014HNhxKX766379China,2016HN07-1KX766378China,2007ReferencestrainsAccessionnumbersOriginReferencestrainsAccessionnumbersOriginMN184ADQ176019.1USA,2006VR-2332AY150564.1USA,1995HENAN-XINXKF611905.1China,2015CH-1aAY032626China,1996HENAN-HEBKJ143621.1China,2015HB-1(sh)/2002AY150312.1China,2002150105-GD-NMBKR612159.1China,2015RespPRRSMLVAF066183.4USA,2005NVDC-HeB1-2012KP771773.1China,2012BJ-4AF331831.1China,20012014-Henan-GP5KT208307.1China,2014JXA1EF112445.1China,2007HENJZ-6KT424245.1China,2014JXA1P80FJ548853.1China,2009PRRSV2000000554EU759713.1USA,2008HuN4EU213123.1China,2009HENXX-2KT424256.1China,2014NT3KP179404.1China,2015GX0804FJ800771.1China,2009FJZ03KP860909.1China,2015FJZHKP998478.1Chian,2015NADC30JN654459.1USA,2012SCwhn14CD-1KT030946.1China,2014CHsx1401KP861625.1China,201421 2.2.5病毒的分离与增殖HNhx分离株的病料经研磨后1：10稀释于含双抗（青-链霉素）的RPMI1640培养基中，放置于-80℃中反复冻融3次，然后4,000g离心10min，并使用0.22μm滤膜过滤。将过滤液接种于PAM细胞中，37℃孵育1h后，加入新鲜的含10%FBS和1%双抗（青-链霉素）的RPMI1640培养基。在37℃二氧化碳培养箱中培养2-3天，观察病变情况。若无病变，反复冻融后转接下一代直至出现病变。2.2.6免疫荧光试验（IFA）鉴定待PAMs和Marc145细胞密度为80%时，按MOI等于0.1的毒量分别接种HNhx和HN07-1PRRSV毒株。放置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h，弃掉培养基，PBST洗涤3次后，用含2%双氧水的甲醛溶液固定细胞。经PBST洗涤3次后，加封闭液于37℃封闭1h，之后加入1：5,000稀释的鼠源抗PRRSV的N蛋白抗体于37℃温育1h。经过PBST洗涤3次，加入1:1,000稀释的Cy3标记的羊抗鼠二抗于37℃温育1h。PBST洗涤3次后，荧光倒置显微镜观察结果。2.2.7半数组织感染量（TCID50）测定与生长动力曲线绘制2.2.7.1半数组织感染量（TCID50）测定半数组织感染量（TCID50）的测定方法简要如下：（1）将Marc145细胞均匀地接种于96孔板内，培养过夜。（2）将收集的病毒液用细胞培养基进行10倍梯度稀释，弃去96孔板内原有培养基，每孔加100µl稀释好的病毒液，每个稀释度做8个重复。（3）继续培养约36h后弃去培养液，用含2%双氧水的甲醇固定液固定细胞，37℃固定15min。（4）使用PBST清洗细胞3次，加入针对PRRSVGP5的单克隆抗体，并放置于37℃孵育30min。（5）使用PBST洗3次，每次5min，然后加入有荧光素标记（Cy3）的羊抗鼠二抗，放置于37℃孵育30min。（6）使用PBST洗3次，每次5min。最后在荧光显微镜下观察荧光，记录阳性孔的个数，推算出病毒滴度。2.2.7.2生长动力曲线绘制将Marc145细胞或者分离的PAM细胞铺满6孔板，按MOI等于0.1接种病毒。分别在接毒6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h和96h后吸取100µl培养液上清，经过10倍浓度梯度稀释处理后，接种于培养单层PAM细胞的96孔细胞培养板中。放置于37℃二氧化碳培养箱中培养120h后，观察CPE情况，按Reed-Mucnch法计算TCID50，并绘制生长动力曲线。22 3.结果与分析3.1PRRSV流行变异分析3.1.1Nsp2和ORF5目的基因克隆从发病猪场收集疑似阳性组织或血清病料，经处理后提取总RNA，并反转录生成cDNA。使用表2-2中引物进行扩增检测，阳性结果如图2-1所示。目的片段回收后连接到pMD19-T(simple)Vector，转化到JM109感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序。表2-2Nsp2和ORF5扩增引物。Table2-2PrimersusedforamplificationofORF5andpartialNsp2.PrimerSequenceORF5F-TGGCAATTTGAATGTTCAAGTATGR-CTGTGCTATCATTGCAGAAGTCGTNsp2F-AGGAATGCTTGGCCAAACTTGAGAGR-GCTGAGTATTTTGGGCGTGTG图2-1ORF5(A)与Nsp2(B)基因扩增。（A）M：Marker2000；泳道1：ORF5基因（648bp）；（B）M：Marker；泳道1：NADC30-like毒株Nsp2基因扩增片段（724bp）；泳道2：HP-PRRSV毒株Nsp2基因扩增片段（1027bp）。Fig.2-1AmplificationofORF5andpartialNsp2genes.(A)M:Marker2000;Line1:ORF5forPRRSVstrains(648bp);(B)M:Marker;Line1:partialNsp2fragment(724bp)fromNADC30-likePRRSVs;Line2:partialNsp2fragment(1027bp)fromHP-PRRSV.3.1.2Nsp2和GP5基因遗传进化分析3.1.2.1Nsp2基因遗传进化分析从收集的病料中克隆出18份PRRSVNsp2基因，并进行核酸序列测定。基于18份分离毒株和NCBI下载的参考毒株（VR2333、CH-1a、JXA1、NADC30、HENAN-XINX和HENAN-HEB）的Nsp2核酸序列构建了系统进化树。结果如图2-2所示，其中14份分离株属于亚群1，代表毒株为中国高致病性毒株JXA1；4份分离株属于亚群2中，同亚群还包含有NADC30毒株和NADC30-like毒株（HENAN-HEB和HENAN-XINX）。因此HENHB1、HENXX、HENZG、HENPK、HENHB2、HENZMD、HENHM1、HENHM2、HENZY、SXGP1、HENFY、HENXPSXJA和HENFQ02分离株为高致病性毒株，而HENQ、XHEN15-1、HNhx和HENDD01分离株为最近流行的NADC30-like毒株。23 图2-2基于分离毒株和参考毒株的ORF2基因构建进化树。“▲”指本研究的分离毒株。Fig.2-2PhylogeneticanalysisofpartialORF2genesofPRRSVstrainsfromthisstudyandotherreferencestrains.“▲”indicatestheisolatesfromthisstudy.Phylogeneticandevolutionarygeneticanalyseswereconductedusingtheneighbor-joiningmethodwith1000bootstrapreplicatesthroughMEGAsoftware(version6.06).3.1.2.2ORF5基因遗传进化分析从PRRS发病的猪场中收集的病料经过处理后，扩增出了31份PRRSVORF5基因，克隆到pMD19-T(simple)载体进行核酸序列测定。31份分离株的ORF5测序结果与VR2332进行成对比对，结果显示核酸序列同源性为84.25-99%，因此31株分离株属于美洲型（GenotypeII）毒株。基于31份分离毒株及NCBI数据库中存放的参考毒株（VR2333、CH-1a、SDSU73、HB-1(sh)/2002、BJ-4、GX0804、RespPRRSMLV、07HEN、JXA1、JXA1P80、NT3、NVDC-HeB1-2012、150105-GD-NMB、MN184A、NADC30、HENAN-XINX、HENAN-HEB、JL580、HENJZ6、HENXX-2、XW016、PRRSV2000000554和2014-Henan-GP5）的ORF5核酸序列构建了系统进化树。结果如图2-3所示，所有毒株主要被分为3个亚群，其中18份分离株（HEN15-1、HENDD03、HENFQ01、HENHBYC、HENJY1、HENJY2、HENKF、HENLY1、HENLY2、HENNY、HENPDS、HENQX、HENSP1、HENSP2、HENWS、HENYY、HENZM和HNhx）和9株参考毒株（2014-Henan-GP5、HENJZ6、HENXX-2、XW016、NADC30、24 HENAN-XINX、HENAN-HEB、JL580和PRRSV2000000554）属于亚群1，这18株分离株彼此的核酸序列同源性为91.71%-99.34%，而与NADC30毒株的同源性为94.36%-96.56%，因此亚群1中的毒株为NADC30-like毒株；HENLY3和HENDD02毒株与4份参考毒株（VR2333、CH-1a、RespPRRSMLV和GX0804）被分到亚群2中，2株分离株与VR2332的核酸序列同源性为99.34%，因此亚群2中的分离株为经典毒株；本研究中剩余的11株分离株（HENZMD、HENZY、SXGP1、SXGP2、HENHB1、HENHB2、HENHJ、SXJA、HENFY、HENZG和HENXP）和6株参考毒株（07HEN、JXA1、JXA1P80、NVDC-HeB1-2012、150105-GD-NMB和NT3）属于亚群3，11株分离株彼此的同源性为98.84%-99.67%，为与高致病性毒株JXA1的同源性为98.34%-100%，因此亚群3中的分离株为高致病性毒株。综上，当前在田间存在三类毒株（C-PRRSV、HP-PRRSV和NADC30-like），而广泛流行的为高致病性毒株和NADC30-like毒株。图2-3基于分离毒株和参考毒株的ORF5基因构建进化树。“▲”指本研究的分离毒株。Fig.2-3PhylogeneticanalysisofpartialORF5genesofPRRSVstrainsfromthisstudyandotherreferencestrains.25 “▲”indicatestheisolatesfromthisstudy.Phylogeneticandevolutionarygeneticanalyseswereconductedusingtheneighbor-joiningmethodwith1000bootstrapreplicatesthroughMEGAsoftware(version6.06).3.1.2.3GP5氨基酸序列突变分析GP5是PRRSV主要的结构蛋白和最重要的免疫原性蛋白，然而GP5却是PRRSV结构蛋白中变异性最大的。在信号肽区域（aa1-26）、诱骗表位（aa27-30）、主要中和表位（aa37-44）和可能的N-糖基化位点（NXS/T，X为脯氨酸外的任意氨基酸）等重要区段存在较多的变异。多重比对结果显示，亚群2中的经典毒株HENDD02和HENLY3与VR2332相比几乎没有突变，且国内仍有一部分猪场在使用以VR2332为亲本的疫苗，所以推断它们可能为疫苗毒株。亚群3中的毒株为在我国流行的高致病性毒株，与代表性毒株JXA1相比存在少量新出现的氨基酸变异，如F23Y(HENZMD和HENZY)、N30D(SXGP1和SXGP2)、S32N(HENFY和HENXP)、N33R(HENZMD和HENZY)、N33K(HENFY和HENXP)、K59N(SXGP1和SXGP2)、G164R(HENZMD、HENZY、SXGP1、SXGP2、HENFY、HENXP、HENHB1、HENHB2、HENHJ和HENZG)和G164M(SXJA)。而亚群1中的NADC30-like毒株变异性非常大，存在两个高度变异区（HVR），其中HVR1（aa30-37）包含的氨基酸突变有N32S/A、S33N、N34S/T和S35N，HVR2（aa54-61）包含的氨基酸突变有D54E、N57D/S/G、E58R/D/K/Q/T、R59N/K/H、Y61N/S/D。除此之外，在NADC30-like毒株在其他位点也存在大量的变异，如A8G、Y10C、Q13R、L14S、P15L、C19Y、A26V、A27V、G92A、Y102F/W/R/L、R104K/E/G、K163R、R178K和P200L（图2-4）。以前的研究表明，GP5中的R13Q和R151G突变导致毒力衰减，因此GP5蛋白13和151位点被认为与PRRSV的毒力有关[131，132]。与VR2332毒株相比，亚群2中所有分离毒株都有R13Q和R151G突变，亚组3没有突变，这与系统发育树结果一致，表明亚组2和3中的分离毒株分别属于疫苗毒株和经典HP-PRRSV（图2-3）。在亚群1中，除了HENKF和HENWS之外，所有分离株都有R13Q，但在aa151位点，所有分离毒株都具有R151K的改变（图2-4）。以前的研究报道了部分HP-PRRSV出现R151K突变[133]。目前然未验证aa151位点突变为K是否会影响NADC30-like毒株的生理特性和致病性。GP5胞外域中间的37SHLQLIYNL序列为RRRSV中和表位，H38、I42、Y43和N45位点已经被证明是表位的主要识别位点[47，134]。在主要中和表位，与VR-2332相比，亚群3中的所有分离株具有L39I突变。除了HENHBYC（含有H38Y和L39S突变）和HENYY（含有H38N突变）之外，亚群1和亚群2中几乎所有的分离毒株都与VR-2332相同。此外，aa27-30基序可以充当诱饵表位，诱导大多数针对表位的抗体，并延迟中和抗体的产生以减少免疫应答。亚群2和3中的分离毒株分别具有ALAN和VLVN诱饵表位。有趣的是亚群1中的分离株具有ALVN（HENZM、HENFQ01、HENHBYC、HENKF、HENWS、HEN15-1、HENNY、HENPDS、HENQX、HENYY、HENSP1、HENSP2），VLAN（HENJY1、HENJY2、26 HENLY2、HENDD03）和VLVN（HENLY1）三种诱饵表位（图2-4）。NADC30-likePRRSV的诱饵表位的高度变异可能参与抗宿主免疫和持续感染。所有毒株在氨基酸44和51处都含有潜在的N-糖基化位点。aa30-37区域的突变将导致N-糖基化位点消失、转移或增加。例如，与JXA1相比，亚组3中N30D突变可能导致SXGP1和SXGP2的aa30处潜在的N-糖基化位点的丧失；S32N和N33K突变导致HENXP丢失aa32/33处的糖基化位点；S32N、N33K和S36R突变导致HENFY分离株丢失氨基酸30和34处潜在的N-糖基化位点。亚群1中NADC30-likePRRSVaa30-37区域变异性非常大，导致该区域N-糖基化位点的多态性，几乎所有的分离株在aa30、32、33、34和35分布了两个或三个潜在的N-糖基化位点，但是HENYY和HENFQ分离毒株与NADC30和MN184A相同，仅具有氨基酸34处一个潜在的N-糖基化位点，而S32H、N33D、D34N和S36G突变将导致HNhx菌株失去所有潜在的N-糖基化位点（图2-4，表2-3）。所以分离研究HNhx毒株有利于阐明N-糖基化位点的功能。表2-3PRRSV分离株的糖基化位点。Table2-3PotentialN-GlycosylationsitesinGP5.PotentialN-GlycosylationSitesPotentialN-GlycosylationSitesStrainsStrains3032333435445130323334354451NADC30√√√VR2332√√√√HENZM√√√√JXA1√√√√√HENFQ01√√√HENLY3√√√√HENHBYC√√√√HENDD02√√√√HENJY1√√√√SXJA√√√√√HENJY2√√√√HENXP√√√√HENKF√√√√HENHJ√√√√√HENWS√√√√HENHB1√√√√√HEN15-1√√√√√HENHB2√√√√√HENLY1√√√√HENZG√√√√√HENLY2√√√√SXGP1√√√√HENDD03√√√√SXGP2√√√√HENNY√√√√√HENZY√√√√√HENPDS√√√√HENZMD√√√√√HENQX√√√√HENFY√√√HENYY√√√HENSP1√√√√HENSP2√√√√HNhx√√27 图2-4PRRSVGP5氨基酸序列多重比对。Fig.2-4MultiplealignmentofaminoacidsequencesofGP5fromPRRSVsamplestrainsandreferencestrains.3.2PRRSV流行毒株分离、鉴定与分析3.2.1HNhx毒株分离组织病料经过研磨、反复冻融、离心过滤等处理后接种于原代PAM细胞。放置于37℃二氧化碳培养箱中培养2天后转接下一代，直至第3代PAM细胞开始裂解。PAM细胞病变达50%时，冻存于-80℃。反复冻融3次，0.22μm滤膜过滤后保存病毒，并将其命名为HNhx28 毒株。使用PAM细胞测定其毒价为107.5TCID50/ml。以不同的MOI的毒量接种于PAM细胞，36h后可清楚观察到PAM出现裂解、皱缩、脱落等PRRSV感染的典型病变（图2-5）。A.Mock；B.MOI=0.02；C.MOI=0.2；D.MOI=2图2-5不同MOIHNhx毒株接种后PAM的病变结果（36h，100*）。Fig.2-5Thecytopathiceffect(CPE)ofPAMinfectedwithHNhxatdifferentMOI(36h,100*).按MOI等于0.1分别将分离毒株HNhx与HP-PRRSVHN07-1毒株接种于PAM和Marc145细胞，24h后使用抗PRRSVN蛋白的特异性抗体进行间接免疫荧光试验（IFA）。结果显示，HNhx毒株和HN07-1毒株感染的PAM和Marc145细胞均出现特异红色荧光（图2-6），证明了分离株HNhx确为PRRSV毒株。图2-6PAM(A)和Marc145(B)细胞上IFA试验检测结果（24h，100*）。Fig.2-6IdentificationoftheHNhx.PAM(A)andMarc145(B)wereinfectedwithHN07-1orHNhx(24h,100*).3.2.2HNhx毒株生长动力曲线按MOI等于0.1将HNhx分别接种到铺满PAM和Marc145细胞的6孔板中。分别在接毒特定时间后吸取100µl培养液上清，经过10倍浓度梯度稀释处理后接种于培养单层PAM细胞的96孔细胞培养板中。培养120h后观察CPE情况，按Reed-Mucnch法计算TCID50，并绘制生长动力曲线。结果如图2-7所示，在感染PAM36h后病毒滴度达到顶峰，之后开29 始缓慢降低。而HNhx毒株感染Marc145细胞后，滴度缓慢上升，96h达到107.5TCID50/ml。结果表明，HNhx毒株在PAM上具有更好的增殖特性，PRRSV感染Marc145后，滴度较低，但随着时间延长，滴度缓慢升高。因此，推测HNhx经多次繁殖后也可在Marc145上适应。图2-7HNhx和HN07-1生长动力曲线。Fig.2-7ThegrowthkineticsofHNhxandHN07-1.3.2.3HNhx全基因组序列扩增使用6对特异引物（表2-4）扩增出可覆盖全长的编码区，如图2-8A所示，N1-N6目的条带大小依次约为2780bp、3380bp、2970bp、4310bp、1610bp和890bp，与预期目的片段大小一致。同时按SMARTer®RACE5’/3’Kit操作说明，使用RACE方法分别扩增出了大小约为250bp的5’UTR和330bp的3’UTR（图2-8B）。将所有目的片段连接到pMD19-T(simple)Vector载体上进行测序。测序结果拼接后得到全长为15040nt的HNhx全基因组序列，并上传至NCBI数据库（Access.no.：KX766379）。表2-4HNhx毒株全基因组扩增引物。Table2-4PrimersusedforamplificationofcompletegenomeofHNhx.PrimersequenceProductsize(bp)N1F-GCACTGCTTTACGGTCTR-ACGCATCACATTGAGGTA2784N2F-TACTCAGCTCAAGCCATCATTR-CACAACACCACACGCAATC3384N3F-TACTTATGCCTTCCTGCCTCGR-CCATTCCAACCACAAGTTCTTCA2970N4F-TTGTGCTGTATGCCGAATR-GAGAAGGTCAGAGGAATGC4312N5F-CAGTGTCTATGCTTGGTTR-CAGAGGAGAGCGACTAC1612N6F-CACCTACACGCCAATAATGR-GAGGCACAATATCAATCAGT8935’RACEACCGATCAAGAATCCCAGAC2513’RACECGCTGGAACTTGTGCCCTGT32630 图2-8HNhx全基因组扩增。（A）M：Marker10000；泳道1-6：HNhx基因组扩增片段N1-N6；（B）M:Marker10000；泳道1:HNhx毒株的5’UTR；泳道2：HNhx毒株的3’UTR.Fig.2-8AmplifiedproductsofHNhxPRRSVgenomebyRT-PCR.(A)M:Marker10000;Liner1-6:N1-N6fragmentsofHNhxPRRSVvirusgenome;(B)M:Marker10000;Liner1-2:5’UTRand3’UTRofHNhxvirusgenome(RACE).3.2.4HNhx毒株全基因组遗传进化分析3.2.4.1HNhx毒株同源性分析将HNhx毒株的全基因组序列与参考毒株（VR2332、CH-1a、HB-1(sh)/2002、JXA1、NADC30及国内分离到的NADC30-likePRRSVs）进行核苷酸序列同源性分析，结果如图2-9所示，HNhx与NADC30毒株的同源性最高（93%），而与VR2332、CH-1a、HB-1(sh)/2002、JXA1的同源性依次为85.1%、85.4%、85.0%和85.2%。此外，国内分离到的NADC30-likePRRSVs与NADC30的同源性为92.6%-97.1%，而成对间的差异度则为4.4%-12.0%，因此NADC30-like毒株在田间经历着快速地变异。图2-9PRRSV毒株间的核苷酸同源性和差异度。Fig.2-9Nucleotidesequencehomologyanddivergencebetweendifferentstrains.31 3.2.4.2HNhx毒株全基因系统进化分析为了进一步分析HNhx毒株的系统进化过程，选取国内分离的NADC30-like毒株和其他代表性毒株构建了系统遗传进化树。结果如图2-10所示，HNhx毒株与经典毒株和国内流行的HP-PRRSV毒株亲缘关系较远，而与NADC30毒株和国内流行的NADC30-like毒株同属以一个亚群中。除了JL580毒株（与HP-PRRSV重组）独立于一个分支外，所有在国内报道的其他NADC30-likePRRSV都属于两个不同的簇（第1-2组），HNhx菌株与HENZMD-9毒株（与HP-PRRSV重组）一起分入亚群2中。此外，与亚群1中的NADC30-likePRRSV分离株相比，HNhx、JL580和HENZMD-9毒株与NADC30PRRSV毒株系统发育关系较远。图2-10基于HNhx分离毒株和参考毒株全基因组构建进化树。“▲”指HNhx分离毒株。Fig.2-10PhylogeneticanalysisofpartialORF5genesofPRRSVstrainsfromthisstudyandotherreferencestrains.“▲”indicatestheisolateHNhxfromthisstudy.3.2.5HNhx全基因序列重组分析由于HNhx毒株与HENZMD-9位于同一分支中（图2-10），而HENAMD-9为重组毒株，所以推测HNhx毒株基因组可能也存在重组。我们使用RDP4软件基于系统发育树中不同亚群中代表性PRRSV毒株进行重组检测。包括NADC30、JXA1、JXA1P80等（图2-10）。RDP4中的所有检测程序均显示HNhx是NADC30病毒与我国流行的HP-PRRSV毒株重组而来。接着我们通过SimPlotv3.5.1软件进一步确认了该结果，并鉴定了两个重组断点，分别位于Nsp4（nt5,261）和Nsp9（nt7,911）中（图2-11A）。两个断点将基因组分为三个区32 域，断点之间的区域（次要亲本区域，nt5,261-7,911）与我国商业化的HP-PRRSV疫苗毒株同源性更高（图2-11B），剩下的两端区域（主要亲本区域，nt1-5260，nt7912-15019）与NADC30毒株具有更高的相似性（图2-11C）。因此可以得出，HNhx毒株是有NADC30毒株和HP-PRRSV疫苗毒株组成的嵌合病毒。图2-11PRRSVHNhx毒株重组分析。（A）HNhx全基因组与NADC30（红）、JXA1（绿）和JXA1P80（蓝）相似性比对。次要亲本（B）与主要亲本（C）系统进化分析，红色代表NADC30-likePRRSV亚群，蓝色代表HP-PRRSV亚群。Fig.2-11RecombinationanalysisofPRRSVstrainHNhx.(A)GenomescalesimilaritycomparisonsofHNhx(query)withNADC30(red),JXA1(green)andJXA1P80(blue).Recombinationbreakpointsindicatedatthebottom.Phylogeniesoftheminorparentalregion(B)andmajorparentalregion(C)areshownbelowthesimilarityplot.ThemajorparentalNADC30-likePRRSVgroupisshowninred;theminorparentalHP-PRRSVgroupisshowninblue.4.讨论PRRSV存在高度的变异性，给PRRS的预防和治疗带来了极大的困难。分子变异和进化信息有助于更深入的了解PRRSV流行和演变特征，为PRRS的有效防控提供帮助。因此，我33 们采集了中部地区猪场的阳性病料，进行了PRRSV流行病学研究。数据表明，NADC30-likePRRSV毒株已经开始大面积流行，并经历了快速变异；而HP-PRRSV毒株仍然广泛存在，但相对趋于保守。值得注意的是，与经典的HP-PRRSV和减毒的疫苗株相比，NADC30-like毒株在aa13和aa151、主要中和表位、N-糖基化、诱骗表位等与毒力、入侵、复制和免疫逃逸相关位点或区域存在大量的突变。目前正在广泛使用的商业化疫苗如CH-1R、VR-2332、JXA1-R、HuN4-F112和TJM-F92都来源于HP-PRRSV毒株。因此NADC30-like毒株的流行将会对我们的防控体系提出了巨大的挑战。图2-12NADC30-likePRRSV毒株重组分析结果。Fig.2-12RecombinationanalysisofNADC30-likePRRSVstrainsinChina.更令人担忧的是，NADC30-likePRRSV和经典的HP-PRRSV或减毒疫苗株有时可以在单个农场中检测到。最近已经有很多研究报道分离到了与HP-PRRSV和C-PRRSV重组的NADC30-like毒株[62，103，104]。如图2-12所示，HENXX-1、HENZMD-9、WUH6、JL580、FJ1402、34 HENAN-HEB和FJW05分离毒株为NADC30毒株与HP-PRRSV毒株重组而来；CHsx1401、HENAN-XINX、HNyc15为NADC30毒株与C-PRRSV毒株重组而来。值得注意的是，已经报道的NADC30-likePRRSVHNjz15毒株与HP-PRRSVJXA1相比具其致病性相对较低，与中等强度毒株NADC30相似。而JL580的致病性远高于NADC30并与我国HP-PRRSV毒株相似。基因组分析显示，JL580是由NADC30-likePRRSV与HP-PRRSV09HEN1毒株在Nsp2(nt3,446)至Nsp3(nt4,549)、Nsp3（nt5,225）至Nsp7(nt7,244)和ORF2a(nt12,572)至ORF4(nt13,648)重组而来[62]。Nsp9和Nsp10编码区已被证明是我国HP-PRRSV毒株的毒力决定基因，但上述重组区域并不包括这段区域。因此，NADC30-likePRRSV毒株的致病性差异的原因仍未知。通过重组分析，我们发现在滑县猪场中分离到的HNhxNADC30-like毒株与高致病性疫苗毒株发生了重组（nt5261-7911）。生长动力曲线绘制结果显示分离株HNhx与HP-PRRSV疫苗株JXA1P80在Nsp4(nt5,261)至Nsp9(nt7,911)中的重组，将为阐明NADC30-likePRRSV毒株毒力变化的机制提供帮助。综上，我们发现NADC30-likePRRSV开始广泛流行，详细描述了NADC30-likePRRSV毒株的系统发育并进行了广泛的氨基酸突变分析。NADC30毒株的流入并经历快速的变异和广泛的重组，极大地增加了我国流行毒株的多样性，给PRRS我的预防和控制带来了更多的困难。我们的数据提供了有关我国中部地区PRRSV流行、变异的重要信息，将为PRRSV毒力因子的探究及致病机制的研究奠定基础。35 第三章PRRSVNsp7β保守位点功能验证1.前言PRRSV的复制过程、致病机理和免疫学特性非常复杂，至今并未完全揭示。非结构蛋白在病毒发病机制和宿主免疫中的发挥重要作用，Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4、Nsp7和Nsp11参与调控宿主对PRRSV感染的免疫应答。并且对于病毒复制的响应，机体免疫系统可产生Nsp特异性抗体，特别是针对Nsp1α、Nsp1β、Nsp2和Nsp7。Nsp7是猪繁殖与呼吸综合征病毒中较为保守的非结构蛋白之一，可以被酶切割为Nsp7α和Nsp7β。Nsp7、nap7α和Nsp7β的缺失对病毒是致命的，因此Nsp7可能是PRRSVRNA合成和病毒蛋白翻译的关键蛋白质结构域。一系列的Nsp7α突变实验表明大多数突变以某些方式影响了PRRSV复制循环，并且导致病毒拯救失败，这些位点的鉴定对于了解Nsp7的结构或功能至关重要。然而当前对Nsp7β的研究仍然很少，且其具体功能仍然不清楚。因此我们对GenotypeII型PRRSV毒株的Nsp7β进行了分析，并验证了保守区域和位点对PRRSV复制增殖的影响。2.材料和方法2.1材料2.1.1细胞、菌种和载体PAMs和Marc145细胞由河南省动物免疫学重点实验室保存；JM109感受态细胞和pMD19-T(simple)Vector购自宝生物(大连)工程有限公司；pcDNA3.1(+)载体购自Invitrogen公司。2.1.2主要试剂Lipofectamine®LTX&PLUS™Reagent、胎牛血清（FBS）、琼脂糖凝胶购自赛默飞世尔科技公司；胰蛋白酶（含EDTA）、青-链霉素（双抗）、DMEM培养基购自北京索莱宝科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、RNase-Free水、DNA连接试剂盒（DNAligationkitVer.2.1）、随机6引物、病毒基因组提取试剂盒ViralRNA/DNAExtractionKit、反转录试剂盒PrimeScript™RTMasterMix、SMARTer®RACE5’/3’Kit购自宝生物(大连)工程有限公司；通用型DNA纯化试剂盒（UniversalDNAPurificationKit）购自天跟生化科技（北京）有限公司。SwaI、XhoI、AflII、EcoRV、NotI、FseI、SbfI、ClaI和BssHII核酸内切酶、Q5超保真DNA聚合酶和T4连接酶购自NEB公司；DAPI购自Sigma公司；Cy3标记的羊抗鼠二抗购自Abbkine公司；PRRSVN蛋白抗体由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备。2.1.3培养基和常用溶液配制LB培养基的配制：1%(w/v)Tryptone（胰蛋白胨）；0.5%(w/v)YeastExtract（酵母提取物）；1%(w/v)NaCl，高压灭菌15min。PBS（10mM/LPH7.2）：0.145mol/LNaCl；2.28mmol/LNaH2PO4·H2O；7.74mmol/LNa2HPO4·12H2O36 PBST：PBS；0.05%(v/v)吐温-20（v/v）封闭液：1×PBST；5%(w/v)脱脂牛奶细胞固定液：甲醇；2%双氧水Amp贮存液(50mg/ml)：500mgAmp溶于10ml蒸馏水中，0.22µm滤器过滤除菌，分装于1.5ml小管中，-20℃冰箱保存。50×TAE：Tris242g，冰醋酸57.1ml，0.5MEDTA(pH8.0)100ml，加水定容至1L。蛋白电泳缓冲液(Tris-甘氨酸溶液)：3gTris•HCl,14.4g甘氨酸，1gSDS加水至1L。转膜缓冲液(1L)：25mMTris•HCl(3g)，192mM甘氨酸(14.4g)，20%甲醇(200ml)2×蛋白上样缓冲液(20ml)：0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)4ml，20%SDS4ml，1%溴酚蓝1ml，甘油4ml，2mlβ-巯基乙醇，分装，-20℃贮藏。考马斯亮蓝R-250染色液（1L）：考马斯亮蓝R-2501g，异丙醇250ml，冰醋酸100ml，搅拌均匀，加双蒸水定容至1000ml。考马斯亮蓝脱色液（1L）：冰醋酸100ml，无水乙醇50ml，双蒸水850ml，混匀。2.1.4主要仪器SW-CJ-2FD型超净工作台苏州净化设备有限公司ZS-2200型凝胶成像仪美国基因工程公司-80℃超低温冰箱美菱公司分析电子天平梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司低温冰箱德国SIEMENS集团PTC-200型PCR仪美国基因仪器公司PowerPac电泳仪美国BIO-RAD公司HeraeusPico17微型离心机美国ThermoFisherScientific公司CR21GII高速台式离心机日本HITACHI公司NanoDrop2000C紫外可见分光光度计美国ThermoFisherScientific公司IKA®MS3basic小型振荡器德国IKA公司台式pH计瑞士Mettler-Toledo公司超纯水系统美国Millipore公司CO2恒温培养箱美国ThermoFisherScientific公司荧光倒置显微镜德国LEICA仪器有限公司2.2实验方法2.2.1总RNA提取（1）细胞的裂解。倒出培养液，使用PBS清洗一次。向培养细胞中加入适当量的裂解BufferRL，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞。将内含细胞的裂解液转移37 至离心管中，反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置2min。（2）向上述步骤1中加入等体积的70%乙醇，将溶液混匀立即转入到RNASpinColumn中。（3）12,000rpm离心1分钟，弃滤液。将RNASpinColumn放回到2mlCollectionTube中。（4）将500µl的BufferRWA加入RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。（5）将600µl的BufferRWB加入至RNASpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。重复操作2次（6）将RNASpinColumn重新安置于2mlCollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。（7）将RNASpinColumn安置于1.5ml的RNaseFreeCollectionTube上，在RNASpinColumn膜中央处加入50～200µl的RNaseFreedH2O，室温静置5分钟。12,000rpm离心2分钟洗脱RNA。2.2.2RT-PCR扩增目的片段同二章2.2.22.2.3目的片段克隆测序同第二章2.2.32.2.4质粒构建挑选目的片段测序正确的阳性克隆，按照质粒小提试剂盒（TIANprepMiniPlasmidKit）操作说明提取质粒。双内切酶切割回收目的片段和表达载体，回收好的DNA片段与表达载体测定浓度后，按1:2-1:10的分子比例，16℃连接过夜。Nsp7β突变体以构建好的rHN07-1质粒为模板，使用超保真聚合酶和特异的突变引物对进行扩增，经DpnI限制性内切酶处理后转化JM109感受态细胞，挑选克隆进行测序。2.2.5质粒转染与病毒拯救（1）将Mrac145细胞均匀铺至6孔板中，培养至70‑90%；（2）将LipofectamineLTX®试剂（15µl）稀释在Opti-MEM®培养基（135µl）中；（3）将纯化的质粒DNA（3µg）稀释在Opti-MEM®培养基（150µl）中，加3µlPLUS；（4）将稀释的DNA加入稀释的LipofectamineLTX®试剂（1：1比例），孵育5min；（5）将DNA-脂质复合物（250µl）加入细胞，37℃孵育细胞2天；（6）将细胞放置于超低温冰箱中，反复冻融3次；（7）使用0.22µm滤膜过滤培养液收集病毒。2.2.6免疫荧光试验（IFA）鉴定同第二章2.2.62.2.7WesternBlot2.2.7.1收集蛋白样品（Proteinsamplepreparation）使用碧云天RIPA裂解液裂解贴壁细胞，收集完蛋白样品后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度，确保每个蛋白样品的上样量一致。38 2.2.7.2电泳（Electrophoresis）(1)SDS-PAGE凝胶配制12%分离胶（10ml）5%浓缩胶（4ml）H2O3mlH2O2.8ml30%丙烯酰胺混合液4ml30%丙烯酰胺混合液0.66ml1.5MTris•HCl(PH8.8)2.5ml1.5MTris•HCl(PH8.8)0.5ml10%SDS100µl10%SDS40µl10%过硫酸氨（APS）100µl10%过硫酸氨（APS）40µlTEMED4µlTEMED4µl(2)样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。(3)上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。电泳时在上层胶时使用80-100V低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用120V高电压恒压电泳。根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。2.2.7.3转膜（Transfer）在Western实验中选用PVDF膜并使用Bio-Rad的标准半干转膜装置，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。2.2.7.4封闭（Blocking）转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。2.2.7.5一抗孵育（Primaryantibodyincubation）立即加入稀释好的一抗，室温下在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。2.2.7.6二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)弃掉洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温下在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。2.2.7.7蛋白检测（Detectionofproteins）使用BeyoECLPlus试剂在荧光成像系统下检测目的蛋白。39 3.结果与分析3.1PRRSV非结构蛋白Nsp7β保守位点分析为了分析非结构蛋白Nsp7β保守基序，我们在GenotypeII型PRRSV中选取了代表性毒株（10株经典PRRSV毒株、21株HP-PRRSV毒株和15株NADC30-likePRRSV毒株）进行氨基酸变异分析。结果如图3-1A所示，Nsp7βaa30-50区段在GenotypeII型PRRSV中相对保守。接着我们进一步选取了动脉炎病毒属中其它病毒如EAV、SHFV等病毒代表性毒株与GenotypeI型和GenotypeII型PRRSV毒株的Nsp7β氨基酸序列与进行比较，结果如图3-1B所示，aa38在动脉炎病毒属中相对保守。图3-1Nsp7β氨基酸序列多重比对结果。（A）PRRSV毒株（B）动脉炎病毒属毒株。Fig.3-1MultiplealignmentofNsp7βaminoacidsequencesofPRRSVstrains(A)andvirusesinArteriviridae(B).3.2PRRSV反向遗传操作平台构建3.2.1HN07-1全基因组克隆测序HP-PRRSV毒株HN07-1感染Marc14548h后按病毒基因组提取试剂盒ViralRNA/DNAExtractionKit操作说明提取总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScript™RTMasterMix反转40 录得到cDNA。使用8对特异引物（表3-1）扩增出可覆盖HN07-1基因组全长的编码区，如图3-2所示，P1-P8目的条带大小依次约为1967bp、2174bp、1110bp、2315bp、2244bp、2447bp、2250bp和2377bp，与预期目的片段大小一致。同时按SMARTer®RACE5’/3’Kit操作说明，使用RACE方法分别扩增出包含全长5’UTR和3’UTR目的片段。将所有目的片段连接到pMD19-T（simple）载体上进行测序。测序结果拼接后得到全长为15345nt的HN07-1全基因组序列，并上传至NCBI数据库（Access.no.：KX766378）表3-1HN07-1毒株全基因组扩增引物。Table3-1PrimersusedforamplificationofcompletegenomeofHN07-1.PrimerSequenceProductsize(bp)P1F-GCACTGCTTTACGGTCTR-CCACGGAGGTACTGATC1967P2F-ATTGAGGATTGCTGCTGR-TCCCAAGGTTTGAGAAG2174P3F-TGGGTGTATTTTCTGGGTCTR-CCACAAGTGCTGTCAAGG1110P4F-CTACGGACCTGGCTCTR-GGACCTCCTCATAAAACA2315P5F-CCTCTCCCACCGAAAGTTR-CCGAGGCGTAGTATTCAGA2244P6F-AACTGCTGCCACGACTTAR-ACCGCAACTGATTCCTT2447P7F-TCCCTCCCACATGCCTTCR-TCTCAGAAGCATAGAAAAGG2250P8F-TGGCGTTCCTGTCCTTCAR-GCCGCATGGTTCTCGC23775’RACEACCGATCAAGAATCCCAGAC2513’RACECGCTGGAACTTGTGCCCTGT326图3-2HNhx全基因组扩增。（A）M：Marker10000；泳道1-8：HNhx基因组扩增片段P1-P8；泳道9:HNhx毒株的5’UTR；泳道10：HNhx毒株的3’UTR。Fig.3-2AmplifiedproductsofHN07-1PRRSVgenomebyRT-PCR.(A)M:Marker10000;Liner1-8:P1-P8fragmentsofHNhxvirusgenome;Liner9-10:5’UTRand3’UTRofHN07-1virusgenome(RACE).41 3.2.2反向遗传操作平台构建3.2.2.1rHN07-1构建以HP-PRRSVHN07-1为亲本毒株构建反向遗传操作系统rHN07-1。对HN07-1全基因组序列进行限制性酶切位点分析，选取酶切位点XhoI（*3400/3404、*6901/6905）、AflII（6465/6469）和EcoRV（12071）将全长分为4段进行克隆连接（图3-3A）。为了将全长基因组序列构建到pcDNA3.1(+)载体中，在全长序列两端引入了基因组序列未包含的SwaI和NotI酶切位点，以及对pcDNA3.1(+)载体进行改造将多克隆位点替换为SwaI、XhoI、AflII、EcoRV和NotI酶切位点。为了提高转录效率，我们将载体TATAbox与病毒基因组序列之间的距离调整为24nt。使用表3-2中引物分别扩增Vector、F1、F2、F3和F4，结果如图3-4所示，将所有目的片段连接到pMD19-T(simple)Vector载体上进行测序。根据测序结果挑选测序正确的克隆构建载体。载体改造引物V-R引物引入SwaI、XhoI、AflII，V-F引物引入AflII、EcoRV和NotI。由于F3段包含XhoI酶切位点，所以构建pcDNA3.1(+)-rHN07-1时选择F2-F1-F4-F3的顺序插入载体中。3.2.2.2rHN07-1-EGFP构建在rHN07-1基础上，我们又构建了ORF1b和ORF2a间插入额外转录单元EGFP的重组病毒rHN07-1-EGFP。通过分析，选取了Cla（I8798/8800）、BssHI（I*11883/11887、*12165/12169）和EcoRV（12071）酶切位点进行载体构建。使用表3-2中引物扩增CE（ClaI-EcoRV），将该段基因序列克隆到T载体中进行测序并挑选测序正确的克隆。设计合成BssHII-FseI-Kazok-EGFP-SbfI-TRS6-EcoRV序列后通过酶切、连接将其插入到ClaI-EcoRV载体中。最后将ClaI-BssHII-FseI-Kazok-EGFP-SbfI-TRS6-EcoRV序列插入构建成功的pcDNA3.1(+)-rHN07-1中，组成rHN07-1-EGFP。其中TRS6用于sgRNA2的合成，Kazok序列可以增强EGFP的表达。EGFP两端引入的FseI和SbfI两个酶切位点（基因组未含）可以用于插入其它外源基因。图3-3反向遗传操作平台构建策略。（A）pcDNA3.1(+)-rHN07-1构建策略；（B）pcDNA3.1(+)-rHN07-1-EGFP构建策略。Fig.3-3Constructionoffull-lengthPRRRSVcDNAcloneofHN07-1(rHN07-1)(A)andarecombinantHP-PRRSVexpressinganadditionaltranscriptionunit(rHN07-1-EGFP)(B).42 表3-2HN07-1毒株全基因组扩增引物。Table3-2PrimersusedforamplificationofcompletegenomeofHN07-1.PrimerSequenceVF-GGCTTAAGCGATATCGCGGCCGCCTCGACTGTGCCTTCTAR-CGCTTAAGCTCGAGCCATTTAAATTTAGCCAGAGAGCTCTGCF1F-TAAATTTAAATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATR-ACCGAAGAATGGGTAACTGTAACF2F-GAATCAGACAACCGAACAACCTCAR-CCCTTCCCTCAACTTTCCCTCF3F-AGCTCGGGTCCCTCCTTGAR-AGCATGTCTTGCCCTGGTGATAF4F-TGATTAGGGCTTTGGGGACGR-TTATTAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTACGGCCGCATGGTTCTCEF-CAACCAAGGACATTCAGAGR-ATAAGACCACCAGCCAAC3.2.3rHN07-1和rHN07-1-EGFP毒株拯救与验证3.2.3.1rHN07-1和rHN07-1-EGFP毒株验证构建的感染性克隆质粒转染Marc145细胞，盲传一代后细胞出现典型的病变（图3-4）。使用鼠源抗PRRSV的N蛋白抗体进行免疫荧光检测。结果如图3-4所示，与亲本毒株HP-PRRSVHN07-1一样，rHN07-1和rHN07-1-EGFP感染的Marc145细胞都出现特异的红色荧光。而rHN07-1-EGFP感染的Marc145细胞能发出绿色荧光，表明插入ORF1b和ORF2a间的EGFP能够表达。培养48h后收集细胞，进行Western鉴定。结果如图3-5所示，HN07-1、rHN07-1和rHN07-1-EGFP感染的样品中都能检测到PRRSVN蛋白。rHN07-1-EGFP毒株可能由于EGFP的插入，复制变慢，所以N蛋白含量较低。图3-4拯救毒株IFA鉴定。Fig.3-4Marc145cellsinfectedwithHN07-1(A),rHN07-1(B)andrHN07-1-EGFP(C)(48h,100*).43 图3-5Westernblot鉴定。Fig.3-5TheN-proteinexpressionofHN07-1,rHN07-1andrHN07-1-EGFPwasmonitoredbyWesternblot.3.2.3.2rHN07-1和rHN07-1-EGFP生长动力曲线绘制按MOI等于0.1将分别将HN07-1、rHN07-1和rHN07-1-EGFP接种到铺满PAM细胞的6孔板中。分别在接毒特定时间后吸取100µl培养液上清，经过10倍浓度梯度稀释处理后接种于培养单层PAM细胞的96孔细胞培养板中。培养120h后观察CPE情况，按Reed-Mucnch法计算TCID50，并绘制生长动力曲线。结果如图3-6所示，rHN07-1与HN07-1有相似的生长特性，因此rHN07-1可以作为操作工具进行反向遗传学研究。由于额外转录单元EGFP的插入，重组病毒rHN07-1-EGFP复制能力明显降低。图3-6HN07-1、rHN07-1和rHN07-1-EGFP毒株生长动力曲线。Fig.3-6ThegrowthkineticsofHN07-1,rHN07-1andrHN07-1-EGFP.3.3PRRSV非结构蛋白Nsp7β保守位点功能鉴定使用表3-3中的引物以rHN07-1为骨架构建Nsp7β突变体，挑选测序正确的突变体质粒转染Marc145细胞进行病毒拯救。结果如表3-4所示，除Mut-aa39(K-A)突变体能拯救出病毒外，其他突变体都不能拯救出病毒。因此我们推测aa30-50区段可能是Nsp7β发挥功能影响PRRSV增殖复制的关键区域，而aa37/38位点可能是其中关键位点。4.讨论PRRSV复制过程极为复杂，有多种病毒蛋白和宿主因子参与该过程。而非结构蛋白Nsp7β的缺失导致不能拯救出有活性的病毒粒子[135]，因此推测Nsp7β可能参与了PRRSV的增殖和复制过程。通过分析GenotypeII型PRRSV毒株的氨基酸序列，我们发现了Nsp7β序列中存在一段保守区域（aa30-50）。进一步比较了整个动脉炎病毒属中所有种类的病毒，发现该保守区域中的aa38在整个动脉炎病毒属中的成员间都较为保守。为了分析保守区域44 和保守位点对Nsp7β在PRRSV的增殖和复制过程中功能的影响，我们构建了多个Nsp7β突变体进行病毒拯救。首先我们对高致病性PRRSV毒株HN07-1进行全基因组测序，通过对测序结果的分析，我们按照图3-3所示的方案构建了反向遗传操作平台。生长动力曲线结果表明我们构建的反向遗传操作系统rHN07-1与亲本毒株有相似的生长特性，因此可以在此基础上进行广泛的反向遗传操作，以验证PRRSV相关元件的功能。在该反向遗传平台基础上我们构建了多个Nsp7β突变体，转染易感细胞Marc145进行重组病毒的拯救。结果如表3-4所示，除了aa39位氨基酸突变可以包装出完整的病毒粒子之外，aa30-50和aa37-39区段氨基酸的缺失，aa37-39、aa37和aa38位氨基酸的突变都未能拯救出病毒粒子。以上结果表明aa30-50区域对于PRRSV增殖至关重要，而aa37/38可能是Nsp7β发挥功能从而影响PRRSV复制的关键位点。该研究结果可能会对阐明PRRSV复制的机制和过程提供帮助，进而为PRRSV的预防和治疗提供思路。此外，我们在rHN07-1-EGFP的ORF1a和ORF2b之间引入了FseI和SbfI两个酶切位点（图3-3），可以用于连接其他外源基因，因此rHN07-1-EGFP可以作为载体表达外源蛋白。表3-3Nsp7β突变引物。Table3-3PrimersusedformutationofNsp7β.PrimerSequenceDel-aa30-50F-CATTTTTGTCATGGACGAGGAGGTCCATATTAGR-CTAATATGGACCTCCTCGTCCATGACAAAAATGDel-aa37-39F-GTACCAGAAATTTAGTTCCGGTGATGR-CATCACCGGAACTAAATTTCTGGTACMut-aa37-39(WDK-AAA)F-GTACCAGAAATTTGCGGCCGCGAGTTCCGGTGATGR-CATCACCGGAACTCGCGGCCGCAAATTTCTGGTACMut-aa37(W-A)F-GAAAAAGTACCAGAAATTTGCGGACAAGAGTTCCGGTGATGR-CATCACCGGAACTCTTGTCCGCAAATTTCTGGTACTTTTTCMut-aa38(D-A)F-GTACCAGAAATTTTGGGCCAAGAGTTCCGGTGATGR-CATCACCGGAACTCTTGGCCCAAAATTTCTGGTACMut-aa39(K-A)F-CAGAAATTTTGGGACGCGAGTTCCGGTGATGTGR-CACATCACCGGAACTCGCGTCCCAAAATTTCTG表3-4Nsp7β突变拯救结果。Table3-4CPEoftherescuedvirus.MutantsCPEDel-aa30-50NDel-aa37-39NMut-aa37-39(WDK-AAA)NMut-aa37(W-A)NMut-aa38(D-A)NMut-aa39(K-A)Y注：N：有CPE；Y：无CPE45 全文总结PRRSV的遗传变异和进化信息有助于更深入的了解PRRSV流行和演变特征，为PRRS的有效防控提供帮助。为此我们在我国中部地区进行了PRRSV流行病学研究。结果表明，NADC30-likePRRSV毒株在中部地区已经开始大面积流行，并经历了相对快速地变异；而HP-PRRSV毒株仍然广泛存在，但相对趋于保守。此外，NADC30-like毒株在aa13、aa151、主要中和表位、N-糖基化位点、诱骗表位等与毒力、入侵、复制和免疫逃逸相关位点或区域存在大量的突变。全基因组测序与重组分析结果显示，NADC30-like毒株HNhx可能与高致病性疫苗毒株发生了重组（nt5261-7911）。此外，生长动力曲线绘制结果显示分离株HNhx与HP-PPRSV毒株相似，有非常强的增殖能力，并引起宿主细胞产生明显的病变。我们的数据提供了有关我国中部地区PRRSV流行、变异的重要信息，将为PRRSV毒力因子及致病机制等相关研究奠定基础。为了分析保守区域和保守为对Nsp7β功能的影响，我们构建了多个Nsp7β突变体进行病毒拯救，结果表明aa30-50区域对于PRRSV增殖至关重要，而aa37/38可能是Nsp7β发挥功能从而影响PRRSV复制的关键位点。该研究结果可能会对阐明PRRSV复制的机制和过程提供帮助，进而为PRRSV的预防和治疗提供思路。此外，我们构建了反向遗传操作系统rHN07-1和重组病毒rHN07-1-EGFP。rHN07-1可以用于反向遗传操作以验证PRRSV相关元件的功能，而rHN07-1-EGFP可以作为载体表达外源蛋白。46 参考文献[1]T.Baron，E.Albina，Y.Leforban,etal.Reportonthefirstoutbreaksoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)inFrance.Diagnosisandviralisolation[J].AnnRechVet,1992,23(2):161-6.[2]G.Wensvoort，C.Terpstra，J.M.Pol,etal.MysteryswinediseaseinTheNetherlands:theisolationofLelystadvirus[J].VetQ,1991,13(3):121-30.[3]J.G.Cho，S.A.Dee.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Theriogenology,2006,66(3):655-62.[4]L.Zhou，H.Yang.PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeinChina[J].VirusRes,2010,154(1-2):31-7.[5]K.Tian，X.Yu，T.Zhao,etal.EmergenceoffatalPRRSVvariants:unparalleledoutbreaksofatypicalPRRSinChinaandmoleculardissectionoftheuniquehallmark[J].PLoSOne,2007,2(6):e526.[6]M.Dunowska，P.J.Biggs，T.Zheng,etal.IdentificationofanovelnidovirusassociatedwithaneurologicaldiseaseoftheAustralianbrushtailpossum(Trichosurusvulpecula)[J].VetMicrobiol,2012,156(3-4):418-24.[7]P.G.Plagemann，V.Moennig.Lactatedehydrogenase-elevatingvirus,equinearteritisvirus,andsimianhemorrhagicfevervirus:anewgroupofpositive-strandRNAviruses[J].AdvVirusRes,1992,41:99-192.[8]R.Hilgenfeld，M.Peiris.FromSARStoMERS:10yearsofresearchonhighlypathogenichumancoronaviruses[J].AntiviralRes,2013,100(1):286-95.[9]M.A.Kappes，K.S.Faaberg.PRRSVstructure,replicationandrecombination:Originofphenotypeandgenotypediversity[J].Virology,2015,479-480:475-86.[10]S.I.Yun，Y.M.Lee.Overview:Replicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JMicrobiol,2013,51(6):711-23.[11]Y.Fang，E.E.Treffers，Y.Li,etal.Efficient-2frameshiftingbymammalianribosomestosynthesizeanadditionalarterivirusprotein[J].ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(43):E2920-8.[12]J.J.Meulenberg，M.M.Hulst，E.J.deMeijer,etal.Lelystadvirus,thecausativeagentofporcineepidemicabortionandrespiratorysyndrome(PEARS),isrelatedtoLDVandEAV[J].Virology,1993,192(1):62-72.[13]C.J.Nelsen，M.P.Murtaugh，K.S.Faaberg.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscomparison:divergentevolutionontwocontinents[J].JVirol,1999,73(1):270-80.[14]Y.Li，A.Tas，Z.Sun,etal.Proteolyticprocessingoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusreplicase[J].VirusRes,2015,202:48-59.[15]Y.Li，E.E.Treffers，S.Napthine,etal.Transactivationofprogrammedribosomalframeshiftingbyaviralprotein[J].ProcNatlAcadSciUSA,2014,111(21):E2172-81.[16]E.J.Snijder，M.Kikkert，Y.Fang.Arterivirusmolecularbiologyandpathogenesis[J].JGenVirol,2013,94(Pt10):2141-63.[17]J.Han，M.S.Rutherford，K.S.Faaberg.Theporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnsp2cysteineproteasedomainpossessesbothtrans-andcis-cleavageactivities[J].JVirol,2009,83(18):9449-63.[18]G.vanMarle，J.C.Dobbe，A.P.Gultyaev,etal.ArterivirusdiscontinuousmRNAtranscriptionis47 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