C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6在2型糖尿病发生发展中的作用及其相关性研究

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分类号：R58学号：2015020192重庆医科大学博士学位论文（专业学位）C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6在2型糖尿病发生发展中论文题目的作用及其相关性研究作者姓名张林指导教师姓名（职称、单位名称）杨刚毅教授重庆医科大学附属第二医院专业学位类别名称临床医学专业学位领域名称内科学(内分泌与代谢病学)论文答辩年月2018年5月 重庆医科大学研宄生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成人已经果。据我所知，论文中不包含其他，除了文中特别加以标注和致谢的地方外发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作，了明确的说明并表示谢意。之处一申请学位论文与资料若有不实。，本人承担切相关责任学位论文作者签名：：日期：夕０／又／次＾、／，Ｙ学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），并编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用本授权书。论文作者签名：巧指导教曰期：Ｌ％ 目录英汉缩略语名词对照.......................................................................................................1中文摘要...........................................................................................................................3英文摘要...........................................................................................................................8正文：CTRP6在2型糖尿病发生发展中的作用及其相关性研究...........................16前言.................................................................................................................................16第一部分不同程度胰岛素抵抗人群血浆CTRP6水平变化....................................181对象和方法..........................................................................................................182结果......................................................................................................................313小结......................................................................................................................32第二部分血浆CTRP6与2型糖尿病的关联性研究................................................421对象与方法..........................................................................................................422结果......................................................................................................................433小结......................................................................................................................44第三部分口服葡萄糖耐量试验对血浆CTRP6水平的影响....................................511对象与方法..........................................................................................................512结果......................................................................................................................523全文讨论..............................................................................................................52全文总结.........................................................................................................................58参考文献.........................................................................................................................59文献综述.........................................................................................................................64致谢.................................................................................................................................81博士期间发表的文章.......................................................................................................82 重庆医科大学博士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称ADPAdiponectin脂联素ANOVAAnalysisofVariance单因素方差分析BMIBodymassindex体重指数CTRP1C1q/TNF-RelatedProtein1C1q/TNF相关蛋白1CTRP6C1q/TNF-RelatedProtein6C1q/TNF相关蛋白6CIConfidenceinterval可信区间ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫法测定FAT%Bodyfatpercentage%全身脂肪百分比FINSFastingplasmainsulin空腹胰岛素FPGFastingplasmaglucose空腹血糖HbA1CGlycosylatedhemoglobin糖化血红蛋白HDL-CHighdensitylipoprotein-cholesterol高密度脂蛋白胆固醇HOMA-IRHomeostasismodelassessmentofinsulin稳态模型胰岛素抵抗指数resistanceIGTImpairedglucosetolerance糖耐量减低IRInsulinresistance胰岛素抵抗LDL-CLowdensitylipoprotein-cholesterol低密度脂蛋白胆固醇NGTNormalglucosetolerance糖耐量正常OROddsratio比值比ODOpticaldensity光密度OGTTOralglucosetolerancetest口服葡糖糖耐量实验ROCReceiveroperatingcharacteristiccurve受试者工作曲线SPSSStatisticPackageforSocialScience统计分析软件TCTotalcholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯1 重庆医科大学博士研究生学位论文T2DMType2diabetesmellitus2型糖尿病TMBTetramethylbenaidine四甲基联苯胺TNF-αTumorNecrosisFactor-α肿瘤坏死因子αWHRwaisthipratio腰臀比WHOWorldhealthorganization世界卫生组织2hPG2hplasmaglucoseafterglucoseload葡萄糖负荷后两小时血糖2hINS2hplasmainsulinafterglucoseoverload葡萄糖负荷后2小时血浆胰岛素2 重庆医科大学博士研究生学位论文C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6在2型糖尿病发生发展中的作用及其相关性研究中文摘要第一部分不同程度胰岛素抵抗人群血浆CTRP6水平变化目的：通过检测健康人群、糖耐量受损人群和初发的2型糖尿病患者基础测量指标、临床生化指标和血浆C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6(C1q/TNF-RelatedProtein6，CTRP6)水平，分析不同程度胰岛素抵抗人群CTRP6浓度变化，明确血浆CTRP6在胰岛素抵抗发生发展中的作用。方法：根据WHO糖尿病诊断指南，纳入健康人群(NGT组，n=132)、初诊糖耐量受损者(IGT组，n=98)和初诊的2型糖尿病患者(T2DM，n=118)。酶偶联速率法检测血浆TG、TC、HDL-C、LDL-C，葡萄糖氧化酶法检测血浆葡萄糖，离子交换高效液相色谱法检测全血糖化血红蛋白（HbA1c）水平，电化学发光法检测血浆胰岛素，酶联免疫法检测血浆肿瘤坏死因子(TNF-α)、脂联素(Adiponectin，ADP)和CTRP6蛋白浓度。结果：T2DM和IGT组人群BMI、FAT%、WHR、TC、TG、LDL-C、HbA1c(%)、FBG、2hPG、FINS、2hINS和HOMA-IR均高于NGT组3 重庆医科大学博士研究生学位论文(P<0.05或P<0.01)，而T2DM组HDL-C较NGT组明显降低(P<0.05或P<0.01)；在所有研究人群中，女性血浆ADP水平高于男性(P<0.01)，而血浆CTRP6和TNF-α水平在男性和女性之间没有显著差异；与正常体重组相比，超重/肥胖组血浆ADP水平明显降低(P<0.01)，而血浆CTRP6水平和TNF-α水平明显升高(P<0.01)。与NGT组相比，T2DM和IGT组血浆TNF-α、CTRP6水平明显升高(P<0.01)，且T2DM组血浆TNF-α、CTRP6浓度高于IGT组(P<0.05或P<0.01)；而ADP在T2DM和IGT组明显降低(P<0.01)。结论：2型糖尿病和超重/肥胖人群血浆CTRP6明显升高；CTRP6与胰岛素抵抗密切相关，在2型糖尿病、胰岛素抵抗的发生发展中发挥着重要的作用。关键词：糖耐量减退；2型糖尿病；胰岛素抵抗；CTRP6；4 重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分血浆CTRP6与2型糖尿病的关联性研究目的：通过分析血浆CTRP6与人体基础测量指标与临床生化指标的相关性，明确血浆CTRP6与胰岛素抵抗、2型糖尿病的相关关系方法：利用SPSS20.0统计学软件，通过简单相关、多元逐步线性回归与二元Logistic回归分析等统计学方法，分析血浆CTRP6水平变化与2型糖尿病、胰岛素抵抗等临床指标的关联关系；利用受试者工作曲线(ReceiverOperatingCharacteristiccurve，ROC)分析血浆CTRP6预测2型糖尿病发生的价值。结果：在所有研究人群中，血浆CTRP6水平与BMI、FBG、FINS、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C和TNF-α呈显著正相关，与HDL-C和脂联素呈负相关(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。多元逐步线性回归分析显示，BMI、FBG、HOMA-IR和TNF-α是影响血浆CTRP6水平的独立相关因素(P<0.001)；二元Logistic回归分析显示，在控制年龄、性别、BMI、WHR、血脂谱和TNF-α后，CTRP6仍是T2DM的独立危险因素，将血浆CTRP6根据浓度四分位水平分为4组(IGT组：T1,<286.7µg/L;T2,286.8–364.1µg/L;T3,364.1-476.8µg/L;T4,>476.8µg/L；T2DM组T1,<312.5µg/L;T2,312.5-418.4µg/L;T3,418.4-557.7µg/L;T4,>557.7µg/L)之后，发现IGT组T4分位组CTRP6水平发生IGT的OR为3.20(95%CI1.48;6.91)(vs.tertile1,P<0.01)；T2DM组中T4分位组CTRP6水平发生T2DM的OR为43.85(95%CI14.61;131.60)(vs.tertile1,P<0.01)。使用受试者工作特征曲线（ROC5 重庆医科大学博士研究生学位论文曲线）评估CTRP6对IGT、T2DM的预测价值，最佳切点分别为368.8µg/L和478.2µg/L(IGT：灵敏度：60.2%；特异度：60%，AUC面积为0.61，P<0.01；T2DM组：灵敏度：64.4%，特异度84.8%，AUC面积为0.81，P<0.001)。结论：作为新的脂肪细胞因子，血浆CTRP6水平升高与T2DM的发生发展密切相关，CTRP6浓度水平变化能够很好地预测IGT、T2DM进展。因此，CTRP6可作为新的临床检测指标预测和评估2型糖尿病、胰岛素抵抗的发生、迁延。关键词：CTRP6；简单线性相关；逐步回归；ROC曲线6 重庆医科大学博士研究生学位论文第三部分口服葡萄糖耐量试验对血浆CTRP6水平的影响目的：分析高血糖和/或高胰岛素对健康人群血浆脂肪细胞因子CTRP6、TNF-α和脂联素水平的影响。方法：给予48例健康人群标准75g口服葡萄糖耐量试验，分析外周血葡萄糖、胰岛素、TNF-α、脂联素和CTRP6的变化；利用葡萄糖氧化酶法检测血浆葡萄糖浓度，电化学发光法检测胰岛素，ELISA检测TNF-α、脂联素和CTRP6的变化。采用配对t检验、单因素方差分析(ANOVA)等统计学方法进行统计分析。结果：口服糖耐量后不同时间点，血浆CTRP6、脂联素和TNF-α水平明显升高，30分钟达峰(CTRP6：0min:379.2±148.4µg/L，30min：571.4±176.8µg/L；ADP：0min:18.3±7.9μg/L，30min：29.1±12.1µg/L；TNF-α：0min:1.67±0.76ng/L，30min：3.15±1.25ng/L；vs.0min(P<0.05或P<0.01)，随后逐渐降低，120分钟降低至基线水平(CTRP6：60min:436.4±163.2µg/L；120min：398.3±160.7；ADP：60min:21.3±10.0μg/L，120min:19.5±8.6μg/L；TNF-α：60min:2.43±1.19ng/L，120min:0.96ng/L;vs.0min(P<0.05或P<0.01)。结论：健康人群血浆脂肪细胞因子TNF-α、脂联素和CTRP6水平受口服葡萄糖耐量引起的体内高血糖和/或高胰岛素影响，这说明CTRP6可能是体内一种重要的代谢和营养调节因子，能够感受机体胰岛素敏感性和能量代谢改变。关键词：口服葡萄糖耐量试验；高血糖；高胰岛素；CTRP6；7 重庆医科大学博士研究生学位论文THECORRELATIONBETWEENC1Q/TUMORNECROSISFACTOR-RELATEDPROTEIN-6ANDTHEDEVELOPMENTOFDIFFERENTGLUCOSETOLERANCEABSTRACTPARTILEVELSOFPLASMACTRP6LEVELSINPEOPLEWITHDIFFERENTLEVELSOFINSULINRESISTANCEObjective：TodeterminetherolesofplasmaCTRP6inthedevelopmentofinsulinresistancebymeasuringplasmaCTRP6levelsinhealthypeople,impairedglucosetoleranceandnewlydiagnosedtype2diabetesmellitus.Methods:AccordingtotheWHODiabetesDiagnosisGuideline,118patientswithnewlydiagnosedT2DM,98impairedglucosetolerant(IGT)and132healthysubjectswererecruitedforthisstudy.Aftera10-12hourovernightfast,allindividualsparticipatedintheseriesofanthropometricandbodycompositionexamination.BMI,waistcircumference(WC)and8 重庆医科大学博士研究生学位论文hipcircumferencewereexamined.Thewaist-to-hipratio(WHR)wascalculatedbythesameobserver.Ananalyzerofbioelectricalimpedancewasusedtomeasurethepercentageofbodyfat(FAT%).PlasmaTG,TC,HDL-C,andLDL-Cweredetectedbyenzymecouplingratemethod,plasmaglucosewasdetectedbyglucoseoxidasemethod,andhemoglobinA1Cwasmeasuredbyionexchangehighperformanceliquidchromatography.Seruminsulinwasmeasuredwithelectrochemilumi-nescence.Thehomoeostasismodelassessmentofinsulinresistance(HOMA-IR)wascalculatedusingthefollowingequations:HOMA-IR=[fastinginsulin(FINS,mu/L)×fastingbloodglucose(FBG,mmol/L)]/22.5.PlasmaCTRP6,TNF-αandadiponectinlevelsweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassayaccordingtomanufacturer’sprotocol.Results:InIGTandT2DMindividuals,BMI,FAT(%),WHR,triglyceride(TG),totalcholesterol(TC),low-densitylipoproteincholesterol(LDL-C),HbA1c,FBG,2-hourbloodglucoseafterglucoseoverload(2hPG),FIns,2-hplasmainsulinafterglucoseoverload(2hINS),andHOMA-IRweresignificantlyincreasedrelativetothehealthysubjects(P<0.05orP<0.01).Moreover,inT2DMpatients,high-densitylipoproteincholesterol(HDL-C)wassignificantlydecreasedascomparedwithhealthyandIGTsubjects(P<0.05orP<0.01).NodifferencewasfoundincirculatingCTRP6betweenmaleandfemaleinthehealthysubjects.Importantly,circulatingCTRP6concentrationsweresignificantlyincreasedinbothIGTsubjectsand9 重庆医科大学博士研究生学位论文T2DMpatientscomparedwithnormalindividuals,whereascirculatingCTRP6levelswerefurtherincreasedinT2DMpatientsrelativetoIGTsubjects(bothP<0.01).Furthermore,circulationadiponectinconcentrationsweremarkedlydecreasedinIGTandT2DMindividualscomparedwithhealthysubjects,whereasinpatientswithT2DM,adiponectinlevelswerelowerthanIGTgroups(allP<0.01).SimilartocirculatingCTRP6,serumTNF-αconcentrationsweremarkedlyincreasedinT2DMpatientsrelativetoIGTandhealthycontrols(P<0.05orP<0.01).Conclusion:TheplasmaCTRP6issignificantlyelevatedintype2diabetesandoverweight/obesitypeople.CTRP6iscloselyrelatedtoinsulinresistanceandplaysanimportantroleinthedevelopmentofinsulinresistance.Keywords:ImpairedGlucoseTolerance,Type2Diabetes,InsulinResistance,C1q/tumornecrosisfactor-relatedprotein-610 重庆医科大学博士研究生学位论文PARTIITHERELATIONSHIPBETWEENPLASMACTRP6ANDTYPE2DIABETESMELLITUSObjective:TodeterminetherelationshipbetweenplasmaCTRP6andinsulinresistanceandtype2diabetesmellitusbyanalyzingthecorrelationofplasmaCTRP6withclinicalandbiochemicalparametersinhuman.Methods:SPSSversion20.0wasusedforallstatisticalanalyses.TheassociationofCTRP6withothervariableswasdeterminedbysimplecorrelationtestbycontrollingthecovariates.MultiplelinearregressionanalyseswereusedtoanalyzevariablesthathadindependentassociationswithCTRP6andthosewithpossiblebiologicalrelevance.Multiplestepwiseregressionanalyseswereusedtoassesstheindependentlyassociatedfactorsinallsubjectsparticipatedinthestudy.TheassociationofCTRP6withIGTandT2DMwasexaminedbybinarylogisticregressionanalysis.TheutilityofcirculatingCTRP6levelstodetermineIGT,IRandT2DMwasevaluatedbyreceiveroperatingcharacteristic(ROC)curveanalysis.Results:Inbivariatecorrelationanalyses,serumCTRP6concentrationswerecorrelatedpositivelywithBMI,FAT%,TC,TG,HbA1c,FBG,2hPGFINS,HOMA-IRandTNF-α,whereasnegativelywithHDL-CandAdipoqinallstudyindividuals(P<0.05orP<0.01orP<0.001).Multipleregression11 重庆医科大学博士研究生学位论文analysisdisplayedthatHbA1c,TGandTNF-αwereindependentinfluencedfactorsofcirculatingCTRP6(YCTRP6=2.28+0.024XHbA1c+20.091XTG+0.087XTNF-α;R=0.197,P<0.001).Usingamultivariatelogisticregressionanalysis,circulatingCTRP6wasrelatedtoT2DMandIGT,evenaftercontrollingforanthropometricvariablesandothers,WhenserumCTRP6levelsweredividedintofourtertilesinallstudysubjects(tertile1,<286.7µg/L;tertile2,286.8–364.1µg/L;tertile3,364.1-476.8µg/L;tertile4,>476.8µg/LforIGTandtertile1,<312.5µg/L;tertile2,312.5-418.4µg/L;tertile3,418.4-557.7µg/L;tertile4,>557.7µg/LforT2DM),wefoundthatinthetertile4ofCTRP6concentration,theoddsratioofdevelopingIGTwas3.20(95%CI1.48;6.91)(vs.tertile1,P<0.01),whereasinanothertertile4,theoddsratioofdevelopingT2DMwas43.85(95%CI14.61;131.60)(vs.tertile1,P<0.01).BasedonROCanalyses,wefoundthatforIGTsubjects,theareaundertheROCcurves(AUC)was0.61(P<0.01)withasensitivityof60.2%,specificityof60%andforT2DMpatients,AUCwas0.81(P<0.001)withasensitivityof64.4%,specificityof84.8%.ThebestcutoffvaluesofcirculatingCTRP6forpredictingIGTandT2DMwere368.8and478.2µg/L,respectively.Conclusion:Asanewadipocytokine,theincreaseofplasmaCTRP6leveliscloselyrelatedtotheoccurrenceanddevelopmentofT2DM.ThechangesofCTRP6canwellpredicttheprogressionofIGTandT2DM.Therefore,CTRP6canbeusedasanewclinicaltesttopredictandassess12 重庆医科大学博士研究生学位论文thedevelopmentoftype2diabetesandinsulinresistance.Keywords:CTRP6,Simplecorrelation,Multipleregressionanalysis,ROCanalyses13 重庆医科大学博士研究生学位论文PARTIIIEFFECTSOFDIFFERENTINTERVENTIONSONPLASMACTRP6LEVELSObjectives:Toanalyzetheeffectofhyperglycemiaand/orhyperinsulinemiaonplasmaCTRP6，TNF-αandadiponectinlevelsinhealthypeople.Methods:Aftera12-hourovernightfast,a75gOGTTwasperformedonhealthysubjects.Bloodsamplesweredrawnatindicatedtimepointsforthemeasurementsofbloodglucoseandseruminsulin.SerumCTRP6,adipoqandTNFαlevelswerealsomeasuredatindicatedtimepointin48healthyindividuals(24manand24women).ThelevelsofCTRP6,TNF-αandadiponectinweredetectedbyELISAasmentionedabove.Results:Afteroralglucosechallenge,circulatingCTRP6levelsexhibitedasimilarchangewithbloodglucoseandinsulin.CTRP6concentrationsincreasedtoanapogeeat30minandthenprogressivelydecreaseduntil60min,finallyreturnedtothebaselineat120min(from379.2±148.4µg/Lat0minto571.4±176.8µg/Lat30minandthento436.4±163.2µg/Lat60min,andfinallyto398.3±160.7at120min;vs.baselineP<0.05orP<0.01).Similarly,AdiponectinconcentrationsinhealthyindividualswereincreasedrapidlyattheearlyphaseofOGTTandthendecreasedgradually14 重庆医科大学博士研究生学位论文atthelatephase(from18.3±7.9μg/Lat0minto29.1±12.1μg/Lat30min,andthento21.3±10.0μg/Lat60min,andfinallyto19.5±8.6μg/Lat120min;vs.baselineP<0.05orP<0.01).Furthermore,thetrendofTNFαlevelsisalsosimilartothatofCTRP6andAdiponectinlevelsduringtheOGTT,whichreacheditspeakat30minandthenreduceduntil120min(from1.67±0.76ng/Lat0minto3.15±1.25ng/Lat30min,andthento2.43±1.19ng/Lat60min,andfinally1.89±0.96ng/Lat120min;vs.baselineP<0.05orP<0.01).Conclusions：ThedynamicchangesofCTRP6duringtheOGTTmaybeassociatedwithinsulinandglucoselevelsinvivoandindicatethatCTRP6maybeametabolicandnutritiveregulator.Keywords：Oralglucosetolerancetest；Hyperglycaemia；CTRP6；Hyperinsulinemia15 重庆医科大学博士研究生学位论文C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6在2型糖尿病发生发展中的作用及其相关性研究前言2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）和肥胖常伴有全身慢性系统[1]性低度炎症状态，尤其是在脂肪组织中。脂肪组织不仅是一种能量储存器官，而且是一种分泌多种生物活性蛋白的内分泌器官，如脂联素(adiponectin，ADP)、瘦素(1eptin，LEP)、抵抗素(resistin)、白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)、[2]肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor-α，TNF-α)。这些蛋白质，统称为脂肪细胞因子，广泛调节全身糖代谢、脂代谢、胰岛素敏感性、炎症反应、血压和血[3-6]管生成。虽然众多的脂肪细胞因子已得到广泛认同，但脂肪细胞因子在2型糖尿病和胰岛素抵抗发生发展中的具体作用及其分子调控机制尚不完全明确，亟需进一步深入研究。脂联素(Adiponectin,又名Acrp30、AdipoQ、apM1和GBP28)，被认为是[2]由脂肪细胞特异性分泌的一种脂肪细胞因子。大量研究显示脂联素具有抵抗糖尿病、增强胰岛素敏感性、减重、抑制动脉粥样硬化发生发展和抗炎等特性。脂联素属于较大的C1q蛋白家族，因其包含与免疫补体蛋白C1q具有序列同源性的C末端球状结构域而定义。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRPs)是目前发现的高度保守的脂联素家族，由[7]CTRP1到CTRP15的15个家族成员组成。虽然CTRPs成员与脂联素具有结构同源[8-10]性，但每个CTRP都有独特的组织表达模式，并显示出不同的功能。CTRP6在脂肪组织、心脏、胎盘和脑中表达，是由四个结构域(信号肽、一个或多个Cys残基的N端保守结构域、具有可变数量的Gly-X-Y重复序列的胶原样结构域和C端球状C1q结构域)组成的含有240个氨基酸的糖蛋白。CTRP6在心肌梗死后心肌纤维[11][12][12]化、血管紧张素Ⅱ诱导的高血压、血管内皮功能障碍、肌纤维化等方面发挥重要作用。最近的研究表明，高脂饮食诱导的肥胖、瘦素缺乏性肥胖(ob/ob)和脂联素敲除小鼠的脂肪组织中CTRP6的表达增强，而罗格列酮(Rosilitazone)治疗降低了16 重庆医科大学博士研究生学位论文[8]ob/ob小鼠CTRP6的表达。此外，据报道CTRP6的表达在2型糖尿病患者和非2型糖尿病超重患者的内脏脂肪和皮下脂肪中也明显上调，并且与体重指数(BMI)呈[18]正相关。更重要的是，在动物研究中，利用基因敲除和基因过表达实验，表明CTRP6已经成为脂肪合成、脂肪组织炎症、脂肪氧化、葡萄糖代谢和胰岛素抵抗的[13-15，18-19]重要调控因子。全基因组相关研究(GWAS)也将CTRP6作为可能导致人类1[20]型糖尿病易感性的候选基因。然而，迄今为止，还没有研究表明人体中CTRP6的水平与胰岛素抵抗或糖尿病的相关关系。因此，为了解CTRP6在人体中的生理作用，我们进行了横断面研究，以检测正常糖耐量(NGT)、糖耐量受损(IGT)和新诊断的2型糖尿病(T2DM)患者血浆CTRP6水平，并进一步评估CTRP6是否与胰岛素抵抗和肥胖相关，并评价口服葡萄糖耐量试验对正常人血浆CTRP6的影响。17 重庆医科大学博士研究生学位论文第一部分不同程度胰岛素抵抗人群血浆CTRP6水平变化1对象和方法1.1研究对象全部研究对象均来自于内蒙古自治区巴彦淖尔市医院门诊、住院患者及健康体检者，共348例，分为三组，其中初诊的T2DM组118例（男61例，女57例），平均年龄：52±11岁，初诊的IGT组98例（男50例，女48例），平均年龄：51±10岁,健康对照组(NGT组）132例（男68例，女64例），平均年龄：49±9岁。该研究按照赫尔辛基宣言进行并且得到了内蒙古自治区巴彦淖尔市医院医学伦理委员会的批准，每位受适者均签署知情同意书。T2DM纳入标准：均为初次诊断并且未进行任何药物治疗及饮食、运动等干预的2型糖尿病患者。糖尿病的诊断标准(血糖指静脉血浆葡糖糖）采用国际上通用的世界卫生组织（WHO）糖尿病专家委员会（1999）提出的诊断和分类标准：糖尿病症状（典型症状包括多尿、烦渴多饮和难于解释的体重减轻）加上以下3条中任何1条可诊断：（1）随机血糖（指一天中任意时间的血糖）≥11.1mmol/L（200mg/dl)；（2）空腹血糖（空腹状态指至少8小时无任何热量摄入）≥7.0mmol/L(126mg/dl)；（3）OGTT2小时血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)；无糖尿病症状者，需另日重复测定血糖明确诊断。T2DM排除标准：排除1型糖尿病患者或酮症酸中毒患者，大血管或微血管并发症，高血压，肝肾功能衰竭，肝硬化，充血性心力衰竭等主要疾病。IGT的诊断也根据WHO糖尿病专家委员会报告（1999）提出的分类和诊断标准：空腹血糖<6.1mmol/L，75g葡萄糖负荷后2小时血糖（2hPG）>7.8mmol/L并且<11.1mmol/L。健康对照组是在内蒙古自治区巴彦淖尔市医院体检中心接受体检的受试者。这些受试者身体健康，肾、肝、心血管功能正常，空腹血糖<6.1mmol/l，2hPG血糖<7.8mmol/l，无糖尿病家族史。健康对照组(NGT)、糖耐量受损(IGT)和新诊断2型糖尿病（T2DM）组，三组18 重庆医科大学博士研究生学位论文研究对象均无重大器官疾病，无妊娠、无高血压、无甲状腺和甲状旁腺等内分泌系统疾病，近30天内没有服用已知影响血糖和胰岛素水平的药物。1.2方法1.2.1一般临床资料的采集：由专人记录受试者的年龄、性别、既往史、家族史、用药史，女性患者记录月经生育史等。体重身高测量：测量者站在受试者的旁边，嘱受试者空腹、免冠、脱鞋、着单衣站立，两手自然下垂，肩背部、骶骨部、脚跟紧靠身高体重仪的立柱上，两眼平视正前方，按照智能体重身高测量仪语音提示，自动测出身高（m)、体重（kg),做好记录。腰围的测量：受试者取站立位站立，双脚分开25cm左右，双臂抬起，用皮尺紧贴（不压迫皮肤)皮肤于正常呼气末的肋缘和髂嵴中间进行测量，计量单位cm，做好记录。臀围的测量：受试者取站立位，双脚并拢用皮尺紧贴（不压迫皮肤)皮肤前经耻骨联合，两侧经股骨大转子，后经臀部最突出处进行测量，计量单位cm，做好记录。体脂率（FAT%）的测量：采用生物电阻抗法，使用欧姆龙hbf701体脂仪测量，在体脂仪上输入患者年龄、性别、身高，嘱受试者脱去鞋袜，光脚站于体脂仪上测出体脂率。1.2.2实验室生化指标的测定1.2.2.1一般生化指标的测定所有血样均于清晨7：00-9：00从肘前静脉取入真空采血管备双份，一份用于检测血糖、胰岛素、糖化血红蛋白、血脂等项目，葡萄糖氧化酶法测定血糖，高效液相色谱法测定HbA1c，用电化学发光免疫法测定血桨胰岛素(瑞士罗氏，COBAS602)。空腹甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）采用酶比色法测定（罗氏Cobas8000，瑞士）。另一份血样于常温4000r/min离心10min后，取血浆放置在-80°C低温冰箱保存备19 重庆医科大学博士研究生学位论文用。1.2.2.2人肿瘤坏死因子（TNF-α）的测定1)实验原理将特异性TNF-α单克隆抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中标本或标准品中TNF-α与包被于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的多克隆TNF-α抗体，在将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和检测样本中的TNF-α浓度呈正直线相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。2)试剂盒主要性能参数：检测范围：15.6pg/mL-1,000pg/mL；最低检测限6.5pg/mL；回收率范围：85%-105%；批内差：CV<10%，批间差：CV<12%。3)试剂盒组成(Cat:#SEA133Hu)试剂名称数量试剂名称数量96孔板（预包被）196孔板覆膜4标准品2标准品稀释液1×20mL检测溶液A1×120μL检测溶液A稀释液1×12mL检测溶液B1×120μL检测溶液B稀释液1×12mLTMB底物1×9mL终止液1×6mL洗涤液（30×）1×20mL使用说明书14)试剂准备a.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25℃）。b.标准品（冻干品）：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时轻轻摇动（避免起泡），其浓度为1000pg/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液，如下图所示依次倍比稀释成1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL；标准品稀释液（0pg/mL）直接作为空白孔。为保证实验结果的有效性，每次实验均使用新的标准品溶液。20 重庆医科大学博士研究生学位论文试管编号12345678pg/mL100050025012562.531.215.60c.检测溶液A及检测溶液B：DetectionA及DetectionB在使用前请用手甩几下或短暂离心处理，以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B1:100稀释(如：10μL检测溶液A/990μL检测稀释液A)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μL/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2mL。d.浓洗涤液：580mL蒸馏水或去离子水加入20mL洗涤液（30×）稀释至600mL至工作液浓度。e.底物溶液：请用灭菌的移液器和吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不倒回TMB瓶中。5)操作步骤a.加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品（见试剂准备2）。空白孔加100μL标准品稀释液（见试剂准备o第二步最后一管），余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37C温育1小时。b.弃去液体，甩干，不用洗涤。oc.每孔加检测溶液A工作液100μL（临用前配制），酶标板覆膜，37C温育1小时。d.弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。此过程也可采用喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。e.每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100μL，酶标板覆膜，37℃温育3021 重庆医科大学博士研究生学位论文分钟。f.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。g.每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色（反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。h.每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。6)计算各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（或对数坐标），OD值为横坐标2（或对数坐标），绘出标准曲线（以R值越趋近于1为好）。使用专业制作曲线软件进行分析，如curveexpert1.30，用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。7)操作流程22 重庆医科大学博士研究生学位论文1.2.2.3人脂联素(ADP)的测定1)实验原理(Cat.No.AG-45A-0001YEK-KI01)将特异性脂联素抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中样本或标准品中脂联素与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入脂联素特异性多克隆抗体，在将未结合的抗体洗涤干净后，加入HRP标记的抗兔IgG二抗，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在终止液稀硫酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。2)试剂盒主要性能参数：检测范围：0.5ng/ml–32ng/ml；最低检测限100pg/mL；回收率范围：95%-105%；批内差：CV<5%，批间差：CV<8.5%。3)试剂盒组成(Cat:#SEA133Hu)试剂名称数量试剂名称数量23 重庆医科大学博士研究生学位论文96孔板（预包被）196孔板覆膜2标准品1(64ng)洗液10X2×30mL检测抗体1×30μL样本稀释液10X2×30mLHRP-Ab21×150uLTMB底物1×12mL终止液1×12mL使用说明书14)试剂准备a.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25℃）。b.标准品（冻干品）：每瓶标准品加入去离子水1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时轻轻摇动（避免起泡），其浓度为64ng/mL。准备8个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液，如下图所示依次倍比稀释成64ng/mL，32ng/mL，16ng/mL，8ng/mL，4ng/mL，2ng/mL，1ng/mL，0.5ng/mL；标准品稀释液（0pg/mL）直接作为空白孔。为保证实验结果的有效性，每次实验均使用新的标准品溶液。编号123456789ng/mL64321684210.50c.检测抗体：检测抗体在使用前短暂离心处理，以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液1:1000稀释(如：10μL检测溶液/10ml稀释液)，充分混匀，实际配制时应多配制1mL；HRP-Ab2同上稀释方法稀释100倍。d.浓洗涤液：540mL蒸馏水或去离子水加入60mL洗涤液（10×）稀释至600mL至工作液浓度。e.底物溶液：请用灭菌的移液器和吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不倒回TMB瓶中。5)操作步骤24 重庆医科大学博士研究生学位论文a.加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔8孔，依次加入100μL不同浓度的标准品（见试剂准备2）。空白孔加100μL标准品稀释液（见试剂准备第二步最后一管），余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37度温育1小时。b.弃去液体，甩干，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。此过程也可采用自动洗板机来完成。。c.每孔加检测抗体工作液100μL，酶标板覆膜，37度温育1小时。d.弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。e.每孔加HRP-Ab2工作液（临用前配制）100μL，酶标板覆膜，37度温育1小时。f.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同前。g.每孔加TMB底物溶液100μL，酶标板覆膜，37度避光显色20分钟。h.每孔加终止溶液100μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。6)计算各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（或对数坐标），OD值为横坐标2（或对数坐标），绘出标准曲线（以R值越趋近于1为好）。使用专业制作曲线软件进行分析，如curveexpert1.30，用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。7)操作流程25 重庆医科大学博士研究生学位论文3)采用ELISA试剂盒测量不同人群血浆CTRP6水平1)实验原理(Cat.No.AG-45A-0001YEK-KI01)将特异性CTRP6抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中样本或标准品中CTRP6与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素偶联CTRP6特异性单克隆抗体，在将未结合的抗体洗涤干净后，加入HRP标记的链霉亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。2)试剂盒主要性能参数：检测范围：250ng/ml–8000ng/ml；最低检测限100ng/mL；回收率范围：95%-105%；批内差：CV<6-8%，批间差：CV<8-12%。3)试剂盒组成(Cat:#SEA133Hu)试剂名称数量试剂名称数量96孔板（预包被）196孔板覆膜2标准品1洗液10X1×50mL检测溶液A1×120μL溶液A稀释液1×12mL26 重庆医科大学博士研究生学位论文样本稀释液10X1×30mL溶液B稀释液1×12mL检测溶液B1×120uLTMB底物1×11mL终止液1×11mL使用说明书1阳性对照14)试剂准备a.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25℃）。b.标准品（冻干品）：每瓶标准品加入去离子水500uL，盖好后室温静置大约10分钟，同时轻轻摇动（避免起泡），其浓度为8000ng/mL。准备8个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入250μL的标准品稀释液，如下图所示依次倍比稀释成4000ng/mL，2000ng/mL，1000ng/mL，500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，63ng/mL；标准品稀释液（0pg/mL）直接作为空白孔。为保证实验结果的有效性，每次实验均使用新的标准品溶液。编号123456789ng/mL800040002000100050025012562.30c.检测抗体：检测抗体在使用前瞬时离心处理，以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液1:1000稀释(如：120μL检测溶液/11.88ml稀释液)，充分混匀，实际配制时应多配制0.1-0.2mL；HRP-Ab2同上稀释方法稀释100倍。d.浓洗涤液：450mL蒸馏水或去离子水加入50mL洗涤液（10×）稀释至600mL至工作液浓度。e.底物溶液：请用灭菌的移液器和吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不倒回TMB瓶中。5)操作步骤27 重庆医科大学博士研究生学位论文a.加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔8孔，依次加入100μL不同浓度的标准品（见试剂准备2）。空白孔加100μL标准品稀释液（见试剂准备第二步最后一管），余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，室温孵育2小时。b.弃去液体，甩干，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板4次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。此过程也可采用自动洗板机来完成。c.每孔加检测抗体工作液100μL，酶标板覆膜，室温孵育2小时。d.弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板5次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。此过程也可采用喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。e.每孔加HRP工作液（临用前配制）100μL，酶标板覆膜，室温孵育1小时。f.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同前。g.每孔加TMB底物溶液100μL，酶标板覆膜，37度避光显色20分钟。h.每孔加终止溶液100μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使i.在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。g.操作细节注意：试剂准备准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。加样实验操作中使用一次性的高压灭菌无酶吸头，避免污染。加样时注意不要有气泡产生，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样过程中第一个孔与最后一个孔加样时间间隔一般控制在十分钟以内。28 重庆医科大学博士研究生学位论文温育为防止样品蒸发，实验时将覆膜的酶标板置于水浴箱内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，严格控制试剂盒要求的温育时间和温度。洗涤充分洗涤，在每次洗涤过程中，将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔内残留的洗涤液应在吸水滤纸上拍干，勿将吸水纸直接放入反应孔中吸水，同时要轻轻擦除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。反应时间的控制加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（每隔5分钟观察一次），如观察到颜色较深，加入终止液终止反应，避免反应过强而影响酶标仪光密度读数。底物底物避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。6)计算各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用专业制作曲线软件curveexpert1.4进行分析，绘制标准工作曲2线（以R值越趋近于1为好）。使用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。7)操作流程29 重庆医科大学博士研究生学位论文1.3主要实验仪器及试剂身高体重测量仪欧姆龙健康医疗（中国）有限公司中国-80°C低温冰箱青岛海尔特种电器有限公司青岛低速医用离心机北京白洋医疗器械有限公司北京全自动生化免疫分析仪罗氏公司瑞士酶标仪赛默飞世尔（上海）仪器有限公司上海电热恒温水温箱上海慧泰仪器有限公司上海移液枪Eppendorf德国体脂测量仪欧姆龙健康医疗（中国）有限公司中国CTRP6试剂盒AvisceraBioscience公司美国ADP试剂盒AdipogenLifeSciences公司美国TNF-α试剂盒武汉优尔生公司武汉1.4计算公式：（1）胰岛素抵抗(HOMA-IR)的稳态模型评估采用以下方程：HOMA-IR=[空腹胰岛素(FINS，mu/L)×空腹血糖（FPG）mmol/L)]/22.52体重指数（BMI）=体重(kg)/身高的平方（m)腰臀比（WHR)=腰围(cm)/臀围(cm)30 重庆医科大学博士研究生学位论文1.5统计分析所有统计分析均使用SPSS20.0软件包进行。通过Kolmogorov-Smirnov检验评估变量的分布。CTRP6、TNF-α和脂联素进行对数转换以获得正态分布。所有数据均以平均值±SD或中位数（四分位数间距[25-75％]）表示。两组间比较采用T检验；多组间比较采用配对t检验、单因素方差分析(ANOVA)等统计学方法进行统计分析，方差齐用LSD检验，方差不齐用Dunnett检验。在所有统计检验中，p<0.05为差异具有显著性。2结果2.1NGT、IGT和T2DM人群基础测量数据和临床生化指标特征NGT、IGT和T2DM三组间年龄、性别无明显差异。IGT组和T2DM组人群体重指数(BMI)、全身脂肪百分比（FAT％）、腰臀比（WHR）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FPG）、75g葡萄糖负荷后2小时血糖（2hPG）、空腹胰岛素（FINS）、75g葡萄糖负荷后2小时血浆胰岛素（2hINS）和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）均显著高于健康对照组（P<0.05或P<0.01）。然而，在T2DM组患者中，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）显著低于NGT组和IGT组受试者（P<0.05或P<0.01）。（见表1.1，图1.1~1.9）。2.2NGT、IGT和T2DM人群脂联素(Adiponectin,ADP)水平变化NGT、IGT和T2DM三组间年龄无明显差异。按性别分组结果表明：NGT、IGT和T2DM三组人群中，女性患者血浆脂联素（ADP）水平高于男性（P<0.01）。与健康受试者相比，IGT和T2DM人群的血浆ADP浓度显著降低，而在T2DM患2者中，ADP水平低于IGT组（P<0.01）。按按体重（BMI≥25kg/m为超重/肥胖）分组，对各组脂联素水平进行检测。结果表明：与正常体重组相比，超重/肥胖组31 重庆医科大学博士研究生学位论文血浆ADP水平明显降低（P<0.01）(见表1.1，图1.10，图1.15，图1.18）。2.3NGT、IGT和T2DM人群TNF-α水平变化NGT、IGT和T2DM三组间年龄、性别无明显差异。与健康受试者相比，IGT和T2DM人群的血浆TNF-α浓度显著升高，而在T2DM患者中，TNF-α水平高于2IGT组（P<0.01）。按按体重（BMI≥25kg/m为超重/肥胖）分组，对各组脂联素水平进行检测。结果表明：超重/肥胖组血浆TNF-α水平明显高于正常体重组（P<0.01）(见表1.1，图1.11，图1.16，图1.19）。2.4健康人群CTRP6分布特征在健康受试者中，男性和女性之间血浆CTRP6水平无显著差异。图1.13显示了血浆CTRP6浓度的分布，这些受试者的CTRP6浓度范围90％在201~550μg/L。2.5NGT、IGT和T2DM人群CTRP6水平变化与健康受试者相比，IGT组和T2DM组人群的血浆CTRP6浓度显著增加；而相对于IGT组受试者，T2DM患者的血浆CTRP6水平进一步增加（P<0.01）。校正年龄、性别、BMI后，空腹血浆CTRP6水平在三组间仍存在差异，NGT组:354.3±117.2ng/ml，IGT组:406.2土136.6ng/ml，T2DM组:539.1土169.7ng/mlP<0.01。女性患者CTRP6水平同男性患者CTRP6水平相比较无明显差异。按BMI分组结果表明：与正常体重组相比，超重/肥胖组血浆CTRP6水平明显增高（P<0.01）(见表1.1，图1.12，图1.14，图1.17)。3小结本部分中，我们首先通过对初诊的T2DM、IGT和健康人群进行基础指标测量和临床生化指标进行检测，发现T2DM人群腰臀比、体重指数、全身脂肪比率、血脂、糖化血红蛋白、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）32 重庆医科大学博士研究生学位论文均显著高于健康对照组和糖耐量受损组，表明本次研究纳入人群可靠，这无疑为本研究后续检测奠定了良好的基础。脂联素作为主要的脂肪细胞因子，具有抵抗糖尿病、改善胰岛素敏感性、减轻体重等作用；TNF-α是促进2型糖尿病发生发展的主要炎症因子，近几年对脂联素和TNF-α在2型糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖等代谢综合征中的作用及其机制已经进行了深入而广泛的研究。因此，本研究对不同糖尿量人群脂肪细胞因子脂联素和促炎因子TNF-α进行了检测，发现T2DM和糖耐量受损组脂联素均低于健康对照组，而TNF-α高于健康对照组，这与国内外研究一致，这更加说明了本研究人群的可靠性，以及通过高灵敏度的ELISA检测血浆细胞因子的准确性及可信性。基于此，本研究通过ELISA对新近发现的CTRP6脂肪细胞因子进行了检测，发现CTRP6在T2DM和IGT中明显升高。体内动物和体外细胞实验表明，CTRP6具有抑制外周组织糖摄取、加剧胰岛素抵抗等作用。虽然IGT或T2DM患者CTRP6水平升高的机制尚不清楚，但CTRP6水平的升高可能反映了对高血糖、高胰岛素血症或胰岛素抵抗的病理反应，或代谢应激的结果；CTRP6的升高也有可能是促进胰岛素抵抗、T2DM发生及进展的原因之一，但其具体升高原因有待于进一步解析。33 重庆医科大学博士研究生学位论文附表表1.1NGT、IGT、T2DM三组一般资料及临床生化特征比较(x±s)Tab1.1MainclinicalfeaturesandplasmaCTRP6levelsinNGT,IGT,andT2DMgroups（x±s）VariableNGT(n=132)IGT(n=98)nT2DM(n=118)Age(y)49±951±1052±112****BMI(kg/m)24.3±2.626.9±3.127.7±2.9***▲FAT(%)28.2±4.629.7±3.831.7±5.1***WHR0.88±0.060.91±0.070.93±0.08****∆TC(mmol/L)4.38±1.005.01±1.125.36±1.17****▲TG(mmol/L)1.09±0.101.42±0.341.89±0.39****▲HDL-C(mmol/L)1.27±0.231.41±0.201.08±0.39***▲LDL-C(mmol/L)2.73±0.862.98±0.803.36±0.96****▲HbA1c(%)5.10±0.405.79±0.278.75±1.18****▲FBG(mmol/L)4.80±0.456.21±0.3910.91±1.31****▲2hPG(mmol/L)5.69±0.709.03±1.0318.69±4.22****FIns(mu/L)10.89(8.68-12.90)13.99(11.88-16.40)14.67(11.33-16.61)****2hIns(mu/L)45.5±8.076.5±8.977.7±22.0****▲HOMA-IR2.32(1.80-2.84)3.87(3.32-4.47)7.04(5.15-8.03)****▲Adipoq(μg/L)22.3614.398.15**∆TNF-α(ng/L)1.98±0.742.15±0.852.45±1.17****▲CTRP6(µg/L)354.3±117.2406.2±136.6539.1±169.7***▲CTRP6(adjusted)362.79±13.34403.07±14.50532.186±13.684***注：与NGT组比较vs.comparedwithNGTgroupP<0.05,P<0.01；与IGT组比较vs.∆▲comparedwithIGTgroupP<0.05,P<0.0134 重庆医科大学博士研究生学位论文附图40****)30220BMI(Kg/m100NGTIGTT2DM图1.1各组BMI水平变化Fig1.1ThechangeofBMIlevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.0140***3020FAT%100NGTIGTT2DM图1.2各组体脂比水平变化Fig1.2Thechangeoffat%levelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.011.5****1.0WHR0.50.0NGTIGTT2DM图1.3各组WHR水平变化Fig1.3ThechangeofWHRlevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.0135 重庆医科大学博士研究生学位论文8*****）64mmol/l（2TC0NGTIGTT2DM图1.4各组总胆固醇水平变化Fig1.4Thechangeoftotalcholesterollevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.01**2.5****2.0）1.5mmol/l1.0（TG0.50.0NGTIGTT2DM图1.5各组甘油三酯水平变化Fig1.5Thechangeoftriglycerideslevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.012.0**）****1.5mmol/l1.0（0.5HDL-C0.0NGTIGTT2DM图1.6各组HDL-C水平变化Fig1.6ThechangeofHDL-Clevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.0136 重庆医科大学博士研究生学位论文**5***）43mmol/l（21LDL-C0NGTIGTT2DM图1.7各组LDL-C水平变化Fig1.7ThechangeofLDL-Clevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.01**10****864HbA1c(%)20NGTIGTT2DM图1.8各组HbA1C水平变化Fig1.8ThechangeofHbA1Clevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.01**25****NGT20IGTT2DM15******105Glucose(mmol/L)0FBG2h-OGTT图1.9各组血糖水平变化Fig1.9Thechangeofplasmaglucoselevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.0137 重庆医科大学博士研究生学位论文40**）****g/L30μ（2010Adiponectin0NGTIGTT2DM图1.10各组脂联素水平变化Fig1.10Thechangeofplasmaadiponectinlevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.01**4*）3ng/L（2α1TNF-0NGTIGTT2DM图1.11各组TNF-α水平变化Fig1.11ThechangeofplasmaTNF-αlevelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.01**800****600g/L)μ400CTRP6(2000NGTIGTT2DM图1.12各组CTRP6水平变化Fig1.12ThechangeofplasmaCTRP6levelsindifferentgroups注:*P<0.05,**P<0.0138 重庆医科大学博士研究生学位论文图1.13不同浓度CTRP6水平人群分布变化Fig1.13ThedistributionofplasmaCTRP6levelsinhealthygroups图1.14不同性别CTRP6水平变化Fig1.14ThechangeofplasmaCTRP6levelsindifferentgender图1.15不同性别脂联素水平变化Fig1.15Thechangeofplasmaadiponectinlevelsindifferentgender注:vs.male*P<0.05,**P<0.0139 重庆医科大学博士研究生学位论文图1.16不同性别TNF-α水平变化Fig1.16ThechangeofplasmaTNF-αlevelsindifferentgender图1.17不同组CTRP6水平变化Fig1.17ThechangeofplasmaCTRP6levelsindifferentgroups注:vs.Normalweight*P<0.05,**P<0.01图1.18不同组脂联素水平变化Fig1.18Thechangeofplasmaadiponectinlevelsindifferentgroups注:vs.Normalweight*P<0.05,**P<0.0140 重庆医科大学博士研究生学位论文图1.19不同组TNF-α水平变化Fig1.19ThechangeofplasmaTNF-αlevelsindifferentgroups注:vs.Normalweight*P<0.05,**P<0.0141 重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分血浆CTRP6与2型糖尿病的关联性研究CTRP6作为新近发现的脂肪细胞因子，广泛表达于机体各组织，在胰岛素抵抗db/db小鼠和高脂饮食诱导的肥胖DIO小鼠中CTRP6表达升高，而胰岛素增敏剂罗格列酮抑制其表达和分泌。在肥胖和/或糖尿病小鼠模型中，脂肪组织、脂肪间质和巨噬细胞CTRP6表达明显增加。CTRP6表达升高明显抑制外周组织葡萄糖摄取，促进胰岛素抵抗的发生发展；而CTRP6基因敲除能够改善DIO小鼠胰岛素敏感性，增加能量代谢。进一步研究发现，CTRP6通过促进脂肪细胞和巨噬细胞释放促炎因子TNF-α激发并加剧机体系统性炎症。CTRP6抑制胰岛素刺激的脂肪细胞AKT磷酸化水平和葡萄糖摄取。此外，研究发现慢病毒介导的CTRP6表达沉默改善饮食诱导的肥胖；CTRP6通过脂联素受体AdipoRI/AMPK调节脂肪细胞分化。本研究第一章中，研究结果显示与健康人群相对比，初诊的2型糖尿病和糖耐量受损患者血浆CTRP6明显升高；相较于正常体重组，CTRP6在超重/肥胖人群中也明显升高，这与体内外动物实验研究结果相一致。但是在人体，CTRP6与糖脂代谢、胰岛素敏感性、系统性炎症等相关临床指标是否相关，血浆CTRP6是否与胰岛素抵抗的进展相关，其次，血浆CTRP6的浓度变化是否能够作为胰岛素抵抗或2型糖尿病的诊断标志物，目前尚无研究报道。基于此，本研究通过系列统计学方法，将血浆CTRP6水平变化与人体糖脂代谢等生化指标进行相关关联分析，为探究CTRP6在2型糖尿病和/或胰岛素抵抗发生发展的作用提供临床研究基础。1对象与方法1.1研究对象同第一部分1.2试验方法42 重庆医科大学博士研究生学位论文同第一部分1.3统计学方法：利用SPSS20.0统计学软件，通过简单相关、多元逐步线性回归与二元Logistic回归分析等统计学方法，分析血浆CTRP6水平变化与糖尿病、胰岛素抵抗等临床指标的关联关系；利用受试者工作曲线(ReceiverOperatingCharacteristiccurve，ROC)分析血浆CTRP6预测2型糖尿病发生的应用价值。2结果2.1血浆CTRP6水平变化与IGT、T2DM的相关性根据IGT组血浆CTRP6浓度，按照其四分位水平分为4组。T1<286.7µg/L;T2：286.8–364.1µg/L；T3：364.1-476.8µg/L；T4：>476.8µg/L。经过统计，发现IGT组T4分位组CTRP6水平发生IGT的OR为3.20(95%CI1.48;6.91；)(vs.tertile1,P<0.01)。其次，我们根据T2DM组血浆CTRP6浓度，按照其四分位水平分为4组：T1<312.5µg/L；T2：312.5-418.4µg/L；T3：418.4-557.7µg/L；T4>557.7µg/L。结果表明T2DM中T4分位组CTRP6水平发生T2DM的OR为43.85(95%CI14.61;131.60)(vs.tertile1,P<0.01)。2.2所有研究人群中CTRP6与基础测量数据、临床生化指标的简单相关分析简单相关分析结果表明：空腹血浆CTRP6水平与BMI、FAT%、FPG、FINS、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C和TNF-α呈显著正相关，与HDL-C和脂联素水平呈负相关（P<0.05或P<0.01或P<0.001）（见表2.1）。43 重庆医科大学博士研究生学位论文2.3所有研究人群中CTRP6与基础测量数据、临床生化指标的多重相关分析以空腹血浆CTRP6浓度为应变量，以Age、BMI、WHR、FAT%、FPG、2hPG、FINS、2hINS、HbA1c、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR等为自变量行多元逐步回归分析，结果表明：BMI、FPG、HOMA-IR和TNF-α是影响循环CTRP6水平的独立相关因素(YCTRP62=2.28+0.024XHbA1c+0.091XTG+0.087XTNF-α;R=0.197,P<0.001)。在控制年龄、性别、BMI、WHR、血脂谱和TNF-α后，CTRP6仍是T2DM的独立危险因素（P<0.05或P<0.01或P<0.001，见表2.2）。2.4ROC曲线分析CTRP6在T2DM诊断中的效能使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）评估CTRP6对IGT、T2DM的预测价值，我们发现对于IGT受试者，ROC曲线下面积（AUC）为0.61（P<0.01），灵敏性为60.2％，特异性为60％（图2.4），对于T2DM患者，AUC为0.81（P<0.001），敏感性为64.4％，特异性为84.8％（图2.5）。血浆CTRP6预测IGT和T2DM的最佳临界值分别为368.8μg/L和478.2μg/L。3小结本部分研究对血浆CTRP6水平与人体胰岛素抵抗、2型糖尿病的相关基础测量数据和临床生化指标的相关关系进行了统计学分析。研究结果表明空腹血浆CTRP6水平与BMI、FAT%、FPG、FINS、HbA1c、HOMA-IR和TNF-α呈显著正相关，提示血浆CTRP6水平可能与糖代谢和胰岛素抵抗有关。其次，简单相关分析表明CTRP6与LDL-C呈显著正相关而与HDL-C水平呈负相关。第一部分结果显示CTRP6在肥胖人群中浓度升高，结合其他研究者的小鼠实验结果，这无疑进一步说明CTRP6在肥胖的发生发展中可能发挥着重要的作用。其次，本部分根据IGT组和T2DM组血浆CTRP6浓度，按照不同浓度水平进行分组分析，发现随着浓度的升高，IGT和T2DM的发生率明显增加。T2DM组血浆CTRP6浓度高于IGT组，提示从糖尿病前期到糖尿病组CTRP6水平逐渐升高。虽然IGT或T2DM患者CTRP6水平升高的机制尚不清楚，但CTRP6水平的升高可能反映了对44 重庆医科大学博士研究生学位论文高血糖、高胰岛素血症或胰岛素抵抗的病理反应，或代谢应激的结果。然而，关于其具体分子发生机制需要进一步阐释解析。45 重庆医科大学博士研究生学位论文附表表2.1CTRP6与一般基础资料及临床生化指标的相关性分析Tab2.1SimplecorrelationandmultipleregressionanalysisofvariablesassociatedwithserumCTRP6instudypopulation1SimpleMultipleVariablerPbPAge(yr)0.0800.1352BMI(kg/m)0.239<0.001WHR0.216<0.001FAT(%)0.159<0.01TC(mmol/L)0.188<0.001TG(mmol/L)0.417<0.0010.091<0.001HDL-C(mmol/L)-0.143<0.01LDL-C(mmol/L)0.0280.600HbA1c(%)0.443<0.0010.024<0.001FBG(mmol/L)0.394<0.0012hPG(mmol/L)0.436<0.001FIns(mmol/L)0.123<0.052hIns(mmol/L)0.337<0.001HOMA-IR0.372<0.001Adipoq(μg/L)-0.354<0.001TNF-α(ng/L)0.146<0.0010.087<0.001注：多重回归分析中，纳入变量包括Age,BMI,WHR,FAT%,TC,TG,HDL-C,LDL-C,HbA1c,HOMA-IR,TNF-αandAdiponectin.46 重庆医科大学博士研究生学位论文表2.2CTRP6与IGT、T2DM的二元logistic回归分析Tab2.2AssociationofcirculatingCTRP6withIGTandT2DMinfullyadjustedmodelsIGTT2DMModeladjustmentOR95%CIPOR95%CIPAge1.0031.001-1.005<0.011.0091.006-1.011<0.001Age,Sex1.0031.001-1.005<0.011.0091.006-1.011<0.001Age,Sex,BMI1.0031.000-1.005<0.051.0081.006-1.011<0.001Age,Sex,BMI,WHR1.0031.000-1.005<0.051.0081.005-1.011<0.001Age,Sex,BMI,WHR,1.0021.000-1.005NS1.0091.005-1.011<0.001FAT%Age,Sex,BMI,WHR,1.0020.999-1.004NS1.0081.004-1.011<0.001FAT%,AdipoqAge,Sex,BMI,WHR,1.0020.999-1.004NS1.0081.004-1.011<0.001FAT%,Adipoq,TNF-α47 重庆医科大学博士研究生学位论文附图图2.1CTRP6浓度不同分位组IGT患病率Fig2.1PrevalenceofelevatedIGTindifferenttertilesofCTRP6注:vs.1,*P<0.05,**P<0.01图2.2CTRP6浓度不同分位组T2DM患病率Fig2.2PrevalenceofelevatedT2DMindifferenttertilesofCTRP6注:vs.1,*P<0.05,**P<0.0148 重庆医科大学博士研究生学位论文图2.3所有研究人群中CTRP6与各变量的逐步回归分析Fig2.3AllfactorsandstepwisemultipleregressionanalysesofthecirculatingCTRP6inallstudypopulation图2.4ROC曲线预测CTRP6对IGT的诊断Fig2.4ROCcurveanalysiswasperformedforthepredictionofIGT49 重庆医科大学博士研究生学位论文图2.5ROC曲线预测CTRP6对T2DM的诊断Fig2.5ROCcurveanalysiswasperformedforthepredictionofT2DM50 重庆医科大学博士研究生学位论文第三部分口服葡萄糖耐量试验对血浆CTRP6水平的影响第一部分和第二部分研究结果表明CTRP6与2型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗的发生发展密切相关。基于高血糖、高胰岛素血症是2型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗的主要临床特征和发病主要原因，本部分通过对健康正常人群进行口服葡萄糖耐量试验，经检测不同时间点血浆TNF-α、脂联素和CTRP6的水平变化，分析高血糖和/或高胰岛素对人体血CTRP6浓度的影响。1对象与方法1.1对象从第一部分132例正常受试者中选取48例正常体重(女性24例，男性24例，2年龄38~80岁，体重指数(BMI)20~25kg/m)的健康受试者。该研究同样遵照赫尔辛基宣言进行并且得到了内蒙古自治区巴彦淖尔市医院医学伦理委员会的批准，每个人均签署知情同意书。1.2标本收集受试者均隔夜禁食至少8小时，试验前三天需摄入足够热量的碳水化合物，一般300克/天左右，最少不少于200克，试验前8小时内禁止吸烟、喝茶、饮酒、饮咖啡，试验过程中避免过度运动。采集空腹静脉血，口服75克葡糖糖后采集30min、60min、120min静脉血。标本离心分离两部分，一部分用于立即测定血糖、胰岛素等指标。另一部分保存于-80℃冰箱，以备后续用于测定血浆CTRP6、ADP、TNF-α等因子。1.3试验方法用葡萄糖氧化酶法检测血浆葡萄糖浓度，电化学发光法检测胰岛素，ELISA检51 重庆医科大学博士研究生学位论文测TNF-α、脂联素和CTRP6的变化；具体方法同前。1.4统计学方法利用SPSS20.0统计学软件，采用配对t检验、单因素方差分析(ANOVA)等统计学方法进行统计分析。2结果为进一步分析高血糖和/或高胰岛素对CTRP6的影响，我们对招募的性别、年龄均衡的健康人群进行口服标准75g葡萄糖耐量试验，对不同时间点的血糖、血胰岛素、TNF-α、脂联素和血浆CTRP6的水平进行检测，以明确高血糖和/或高胰岛素对CTRP6的动态调控。结果表明，口服葡萄糖耐量试验各时间点血糖、血胰岛素均在30min达高峰，而后逐渐降低，于120min降低至接近于空腹水平。其中各时间点血糖均小于<7.8mmol/L，空腹血糖<7.0mmol/L，2h血糖<7.8mmol/L。这也进一步说明我们这部分研究人群糖耐量均正常。口服糖耐量后30min，血浆脂联素水平明显升高达峰，从空腹18.3±7.9μg/L升高至30min：29.1±12.1µg/L(P<0.01)；之后逐渐降低为21.3±10.0μg/L(P<0.01)，120min几乎降低至基线水平19.5±8.6μg/L（见图3.2）。其次，口服糖耐量后，血浆TNF-α水平于30min明显升高达峰，从空腹1.67±0.76ng/L升高至3.15±1.25ng/L(P<0.01)；之后逐渐降低，于120min降低至空腹水平(60min:2.43±1.19ng/L；120min:0.96ng/L;vs.0minP<0.05或P<0.01)（见图3.3）。最后，我们口服葡萄糖后不同时间点CTRP6水平进行检测，发现CTRP6从0min:379.2±148.4µg/L升高至30min：571.4±176.8µg/L；(vs.0minP<0.05或P<0.001)；随后逐渐降低，于120分钟降低至基线水平(60min:436.4±163.2µg/L；120min：398.3±160.7µg/L)（见图3.1）。3全文讨论52 重庆医科大学博士研究生学位论文本研究对血浆CTRP6与人体胰岛素抵抗的关系进行了探讨，首次证明初诊和未治疗的IGT、T2DM患者血浆CTRP6水平明显高于健康对照组，血浆CTRP6与BMI、FPG、FINS、HOMA-IR、HbA1c呈正相关，这提示血浆CTRP6水平可能与糖代谢和胰岛素抵抗有关。T2DM组血浆CTRP6明显高于糖尿病前期组(IGT组)，提示随着胰岛素抵抗程度的加重，从糖尿病前期到糖尿病组CTRP6水平逐渐升高，这无疑提示我们CTRP6参与胰岛素抵抗进展。[8，体内动物实验表明，肥胖和糖尿病模型小鼠脂肪组织中CTRP6表达明显上调18]。与此相一致，我们同样发现肥胖患者血浆CTRP6浓度较低体重对照组升高。LeiX及其研究团队利用CTRP6真核过表达载体，通过高流体动力学尾静脉注射，短期内过表达CTRP6，结果表明野生型小鼠肝脏胰岛素信号传导减弱，外周组织葡萄糖利用降低，促进糖耐量受损。相反，利用CTRP6敲除小鼠，给予高脂饮食喂养，发现CTRP6基因缺失导致高脂饮食诱导肥胖小鼠代谢率和能量消耗明显增加，胰[18]岛素敏感性显著改善。综合体内动物实验和体外细胞研究，结合我们的临床检测结果，表明CTRP6在葡萄糖稳态和胰岛素敏感性调节中发挥着重要作用。虽然IGT或T2DM患者CTRP6水平升高的机制尚不清楚，但CTRP6水平的升高可能反映了对高血糖、高胰岛素血症或胰岛素抵抗的病理反应，或代谢应激的结果。CTRP6是一种分泌性脂肪细胞因子，主要由脂肪组织中的巨噬细胞和脂肪组织[18]间质细胞表达并分泌。近年来发现CTRP6通过P42/44丝裂原活化蛋白激酶依赖[21]性途径诱导人巨噬细胞白细胞介素10(IL-10)的表达。此外，CTRP6可诱导巨噬细胞TNF-α的表达和产生，而CTRP6缺失则可减少循环炎性细胞因子和促炎巨噬[18]细胞在脂肪组织中的浸润。无论是在各种类风湿关节炎小鼠模型或患者中，16，22]CTRP6的表达均明显增强[。有趣的是，在胶原诱导的类风湿性关节炎(CIA)小鼠模型中，CTRP6缺乏加重炎症关节病情，这是由于B220+B免疫细胞大量浸润滑膜；而CTRP6过表达转基因小鼠抵抗CIA的发生发展，且关节内注射CTRP6重组[21]蛋白能够明显逆转关节炎表型。此外，CTRP6通过与补体因子b竞争结合[21]c3(H2O)，从而抑制了补体途径的选择。针对这些，在我们目前的研究中，我们发现，血浆CTRP6水平与血浆TNF-α浓度呈正相关，且TNF-α是CTRP6的独立影响因素。这些结果进一步表明，CTRP6和TNF-α之间强有力的联系，也指出CTRP6可能在体内发挥致炎作用，并作为一个新的肥胖、脂肪组织炎症和胰岛素抵抗联53 重庆医科大学博士研究生学位论文系的代谢/免疫调节因子。重要的是，在本研究中，我们发现T2DM患者血浆CTRP6水平高于正常对照组，而血浆脂联素水平低于正常对照组，CTRP6水平与循环脂联素浓度呈负相关，提示CTRP6水平增高可能是代谢应激环境下脂联素降低的下游信号变化。[8]此外，研究发现CTRP6在小鼠间质血管中表达存在性别差异。然而，我们的研究表明，血浆CTRP6水平在男性、女性之间没有显著的统计学差异，这些差异可能是由于物种差异、环境多样性、研究方法和样本数量的差异，这需要进一步研究来证实这一问题。为了进一步探讨T2DM中高血糖和高胰岛素血症状态对CTRP6的影响，我们在胰岛素敏感个体(正常对照)中进行了口服葡萄糖耐量试验，观察75克葡萄糖负荷后的CTRP6水平变化，发现血浆CTRP6浓度在30min迅速升高，在60min达到高峰，120min后略有下降。据报道，这可能是首次确定高血糖和/或高胰岛素对循环CTRP6水平变化的影响。这种变化模式与血糖和胰岛素类似。值得注意的是，循环ADP和TNF-α水平在OGTT不同时间点也显示出双相模式表达;在早期阶段增加，然后逐渐减少，与CTRP6类似，表明这些脂肪细胞因子受到代谢和营养变化的调节。因此，OGTT早期血浆CTRP6的升高可能与葡萄糖和/或胰岛素升高有关，而后期CTRP6水平的下降可能与葡萄糖和/或胰岛素水平的下降有关。这提示OGTT引起的血糖或胰岛素水平的短暂升高可能对CTRP6的分泌有调节作用，但短期高血糖和/或高胰岛素血症是否是导致血清CTRP6水平升高的原因尚不清楚，有待进一步证实。ADP是一种主要由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，是胰岛素敏感性的增敏剂[24][25]。它与调节胰岛素敏感性、糖脂代谢以及抗炎作用有关。众多研究表明脂[26-28]联素水平降低是肥胖、IR和T2DM的重要特征。因此，ADP被认为是这些疾病的生物标志物。在目前的研究中，我们发现与血浆ADP水平相反，IGT和TDM的血浆CTRP6水平显著增加，并且与脂联素水平呈负相关，与HOMA-IR呈正相关。CTRP6和ADP在结构上非常相似，但CTRP6和ADP可能与IR具有相反的作用，因此，进一步探索CTRP6和其他脂肪细胞因子在IR状态中的作用是十分必要的。毫无疑问，本研究仍存在一些缺陷。首先，本研究是横断面研究，并没有证实血浆CTRP6水平升高与T2DM发生发展或胰岛素抵抗的之间存在因果关系；其次，54 重庆医科大学博士研究生学位论文CTRP6是CTRP家族蛋白中CTRP1的高度同源体，在体内外CTRP6可以与CTRP1形成异源三聚体，提示CTRP1可能是CTRP6功能不可缺少的部分，甚至调控CTRP6功能；已有研究表明，T2DM患者血清CTRP1水平明显升高，并与糖代谢和胰岛素[23-26]抵抗有关。然而，CTRP1在本研究中尚未检测，我们只检测了血浆总的CTRP6水平，而没有分析异三聚体CTRP1/CTRP6的浓度，这就需要进一步研究CTRP1和CTRP6之间的关系，以及这两种蛋白是否功能紧密连锁。因此，需要进行大样本和长期随访的研究，以深入阐明CTRP6在胰岛素抵抗、2型糖尿病及相关疾病中的作用。总之，我们对中国人血浆CTRP6的水平进行了横断面和干预研究，首次证明IGT或T2DM患者的血浆CTRP6水平高于正常对照组，并与胰岛素抵抗、肥胖和肥胖相关的慢性炎症的各种人体测量和代谢指标有关，并受到口服葡萄糖耐量的影响。我们的发现也说明CTRP6可以作为早期预测和诊断T2DM、肥胖和胰岛素抵抗等的潜在的血清生物学标志物。55 重庆医科大学博士研究生学位论文附图图3.1口服葡萄糖耐量不同时间点血浆CTRP6水平变化Fig3.1CirculatingCTRP6atdifferenttimepointsafteroralglucoseadministration注：Vs.0min,**P<0.01图3.2口服葡萄糖耐量不同时间点血浆脂联素水平变化Fig3.2Circulatingadiponectinatdifferenttimepointsafteroralglucoseadministration注：Vs.0min,**P<0.0156 重庆医科大学博士研究生学位论文图3.3口服葡萄糖耐量不同时间点血浆TNF-水平变化Fig3.3CirculatingTNF-αatdifferenttimepointsafteroralglucoseadministration注：Vs.0min,**P<0.0157 重庆医科大学博士研究生学位论文全文总结1.首次证明初诊和未治疗的IGT、T2DM患者血浆CTRP6水平明显高于健康对照组；肥胖患者血浆CTRP6浓度较低体重组明显升高。2.血浆CTRP6与BMI、FPG、FINS、HOMA-IR、HbA1c呈正相关，而与脂联素水平呈负相关，提示血浆CTRP6水平可能与糖代谢和胰岛素抵抗有关，在胰岛素抵抗的发生发展中发挥着重要的作用。3.作为新的脂肪细胞因子，血浆CTRP6水平升高与T2DM的发生发展密切相关，CTRP6浓度水平变化能够很好地预测IGT、T2DM进展。因此，CTRP6可作为新的临床检测指标预测和评估2型糖尿病、胰岛素抵抗的发生、迁延。4.健康人群血浆脂肪细胞因子TNF-α、脂联素和CTRP6水平受口服葡萄糖耐量引起的体内高血糖和/或高胰岛素影响，这说明CTRP6可能是体内一种重要的代谢和营养调节因子，能够感受机体胰岛素敏感性和能量代谢改变。58 重庆医科大学博士研究生学位论文参考文献[1]LuoL,LiuM.Adiposetissueincontrolofmetabolism[J].JEndocrinol.2016,231:R77-99.[2]RasouliN,KernPA.Adipocytokinesandthemetaboliccomplicationsofobesity[J].JClinEndocrinolMetab.2008,93:S64-73.[3]RosenED,SpiegelmanBM.Adipocytesasregulatorsofenergybalanceandglucosehomeostasis[J].Nature.2006,444:847-53.[4]MauryE,BrichardSM.Adipokinedysregulation,adiposetissueinflammationandmetabolicsyndrome[J].MolCellEndocrinol.2010,314:1-16.[5]PolyzosSA,KountourasJ,MantzorosCS.Adipokinesinnonalcoholicfattyliverdisease[J].Metabolism,2016,65:1062-79.[6]LauWB,OhashiK,WangY,OgawaH,MuroharaT,MaXL,OuchiN.RoleofAdipokinesinCardiovascularDisease[J].CircJ.2017,81(7):920-928.[7]WongGW,WangJ,HugC,TsaoTS,LodishHF.AfamilyofAcrp30/adiponectinstructuralandfunctionalparalogs[J].ProcNatlAcadSciUSA,2004,101:10302-7.[8]WongGW,KrawczykSA,Kitidis-MitrokostasC,RevettT,GimenoR,LodishHF.Molecular,biochemicalandfunctionalcharacterizationsofC1q/TNFfamilymembers:adipose-tissue-selectiveexpressionpatterns,regulationbyPPAR-gammaagonist,cysteine-mediatedoligomerizations,combinatorialassociationsandmetabolicfunctions[J].BiochemJ.2008,416:161-77.[9]SeldinMM,TanSY,WongGW.MetabolicfunctionoftheCTRPfamilyof59 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重庆医科大学博士研究生学位论文Sfrp5isasignatureofobesity-relatedmetabolicdisordersandisregulatedbyglucoseandliraglutideinhumans.JClinEndocrinolMetab2013;98:290-298.63 重庆医科大学博士研究生学位论文文献综述CTRPs家族成员与机体代谢的研究进展【摘要】哺乳动物保持适宜的能量收支平衡需要各系统、组织和器官之间的密切协作。外周血液、淋巴循环和组织细胞微环境中的内分泌激素作为重要的细胞信号转导物质，在维持能量稳态中极其重要。通过分泌的激素（例如胰岛素、胰高血糖素、瘦素、脂联素和抵抗素等）调节复杂的代谢网络构成了综合控制全身代谢的重要机制。激素水平的失调经常导致病理性的能量代谢失衡。作为新近发现的脂肪细胞因子，C1q/TNF相关蛋白家族(C1q/TNF-relatedproteins1-15,CTRP1-15)进化高度保守。虽然脂联素与CTRPs家族成员结构高度同源，但每个CTRPs都具有其独特的组织表达谱和调节糖和/或脂肪代谢的重要功能。鉴于此，本文对CTRPs家族成员在调节代谢的功能研究进展作一综述。【关键词】脂肪细胞因子；激素；胰岛素抵抗；肥胖；CTRPs【Abstract】Maintainingoptinalenergybalanceentailsintimatecrosstalkamongvarioussystems,tissuesandorgansinmammals.Thesecommunicationsaregreatlymediatedbyhormones,whichcirculateinbloodvesselsormicroenvironments.Coordinationofthecomplexmetabolicnetworksbysecretedhormones(insulin,glucagon,leptin,adiponectinandresistin)constitutesanimportantmechanismbywhichgoverningthewhole-bodymetabolism.Impairinghormone-mediatedmetaboliccircuitsfrequentlyleadstodysregulatedenergymetabolism.Asannovelmetabolicadipokine,C1q/TNF-relatedproteins(CTRP1-15)werehighlyconserved.Whilerelatedtoadiponectininsequenceandstructuralorganization,eachCTRPhasitsownuniquetissueexpressionprofileandspecificfunctioninregulatingglucoseand/orfatmetabolism.Here,wesummarizethecurrentunderstandingofthephysiologicalfunctionsofCTRPs,emphasizingtheirmetabolicroles,whichwillprovidegreatermechanisticinsightsintothecriticalroleofCTRPsinsystemicenergyhomeostasis.【Keywords】Adipokine;hormone;Insulinresistance;Obesity;CTRPs64 重庆医科大学博士研究生学位论文1.脂联素(adiponectin)和C1q家族脂肪组织一直被认为是能量的储存库，在摄食时储存能量，而在饥饿或能量利用障碍时通过释放脂肪酸向其他组织提供能源。近年来，脂肪组织被发现作为机体的主要内分泌组织，分泌多种细胞因子或活性肽，被称为脂肪细胞因子[1-3](Adipokines)。在正常生理状态下，这些由脂肪细胞分泌的细胞因子通过内分泌、自分泌或者旁分泌作用，与中枢神经系统、免疫系统、心血管系统、消化系统及其他内分泌器官如下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺、性腺等一起协同维持机体稳[1-3]态，影响能量平衡，调节糖脂代谢、代谢性炎症、凝血与纤溶、血管活性等功能。脂联素(Adiponectin,又名Acrp30、AdipoQ、apM1和GBP28)，被认为是由[4]脂肪细胞特异性分泌的一种脂肪细胞因子。大量研究显示脂联素具有抵抗糖尿[6-10]病、改善胰岛素敏感性、减轻体重、遏制动脉粥样硬化发生发展等特性。脂联素属于较大的C1q蛋白家族，因其包含与免疫补体蛋白C1q具有序列同源性的C[11][11-12]末端球状结构域而定义。人和小鼠基因组编码>30个C1q结构域蛋白，包括补体C1q（A-，B-和C-链）、multimerins、emilins，C1q/TNF相关蛋白（CTRPs）、cerebellins、脂联素、C1q相关因子（CRF）、C1qDC1/caprin-2、非纤维性胶原蛋[13-24]白VIII和胶原蛋白X。除胞质C1qDC1外，几乎所有C1q家族成员都属于分[21]泌蛋白。C1q蛋白在哺乳动物病理生理过程中发挥着广泛而不可替代的作用，[11,14,15,17,25,26]包括调节免疫、发育和代谢。在C1q家族成员中，CTRP1-15与脂联[16,27-36]素具有极其相似的化学结构和生物化学性质。本文就近年来关于CTRPs家族与糖脂代谢相关的研究进展作一综述，以期为CTRPs家族成员的深入研究提供理论依据。2.CTRPs结构特点[16]CTRPs因与脂联素的C1q球状结构域序列高度同源性而被识别。此外，CTRP家族蛋白整体结构与脂联素也高度相似：即每个CTRP蛋白均包括信号肽、一个或多个胱氨酸残基的N-端保守结构域、具有可变数量的Gly-X-Y重复序列的胶原样结构域和C端球状C1q结构域。所有CTRPs家族成员在进化过程中高度保守，并且在其他物种和人类基因组中具有明显的同源序列。在CTRPs成员中，[28]CTRP9在与脂联素同源性最高，高度54％。脂联素几乎全部由脂肪细胞表达、[18][27-36]分泌，而CTRPs广泛表达于人类和小鼠各组织。虽然脂肪主要表达CTRP65 重庆医科大学博士研究生学位论文1-3、CTRP5-7、CTRP9、CTRP12和CTRP13，但是每个CTRP都具有独特的组织[27-28,31-32]表达特征谱，这也可以反映其各具有独特的功能。[37-42]具有C1q结构的成员（包括CTRPs）均形成三聚体。脂联素三聚体可以[43-44]进一步组装成高度有序的六聚体和十八聚体复合物。这些结构的组装需要高[45,46]度保守的N-末端Cys-39残基和内质网蛋白(例如ERp44和DsbA-L)共同实现。同样，CTRP3，CTRP5，CTRP6，CTRP9，CTRP10，CTRP12，CTRP13和CTRP15[27-28,31-34]/myonectin也通过保守的N端胱氨酸残基组装形成多聚体复合物。CTRP11是与氧化还原酶ERp44相互作用形成多聚体复合物，但装配时不需要保[33]守的N端Cys-28和Cys-32残基。虽然不同的脂联素寡聚体可能具有不同的信号特征，据推断这可能与人类胰岛素敏感性相关；但CTRP寡聚体的功能仍尚不完全不明确。3.CTRP转录后修饰(posttranslationalmodifications)及循坏中存在形式从不同细胞分泌后的CTRP1，CTRP2，CTRP6，CTRP12和CTRP15/myonectin均含有N-连接的聚糖结构，而CTRP3，CTRP5，CTRP9，CTRP10，CTRP11和CTRP13[27-28,31-34]含有其他碳水化合物结构区域。质谱分析显示，CTRP9的N-末端胶原结构域中Gly-X-P重复序列内的脯氨酸残基被羟基化，GXKG（E/D）基序内的赖氨酸残[28]基被糖基化。研究表明脂联素胶原蛋白结构域内的脯氨酸羟基化和赖氨酸糖基化不同程度的影响其稳定性、功能和生物活性。除CTRP4，CTRP12和CTRP15/myonectin以外，所有CTRP的胶原蛋白结构域中均含有单个或多个GXKG（E/D）[47-48]基序，表明这些修饰可能发生在CTRP中以影响蛋白质稳定性和/或功能。脂联素含有对其稳定性极其重要的唾液酸序列，但是目前还不清楚CTRPs是否被唾液酸修饰。随着单克隆抗体技术和分子克隆的成熟，多种内源性CTRPs已在血液中被检[49-52]测。CTRPs的血浆浓度明显低于脂联素。人和小鼠中，性别和遗传背景都会不同程度的影响肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病的发展。女性的血浆脂联素水平明显高于男性，这可能是由于雄性激素睾酮抑制体内脂联素的表达、分泌。同样，多种CTRPs的循环水平呈现出性别差异，雌性小鼠相对于雄性表达更高水平的[27-28,32-33]CTRP5、CTRP9、CTRP11和CTRP13。然而，性激素是否直接或间接调节CTRP表达和分泌水平尚不完全清楚。营养代谢状态的改变也会影响血浆和组织细胞66 重庆医科大学博士研究生学位论文CTRPs水平，肥胖和2型糖尿病患者脂联素表达水平持续下降，在饮食诱导的肥胖小鼠模型(DIO,diet-inducedobesity)中，CTRP1，CTRP3，CTRP9，CTRP12和CTRP15[29-31]/肌球蛋白的循环水平明显降低，而CTRP6表达和分泌升高。但是其具体变化机制尚不明确，有待深入研究。4.CTRP家族成员对代谢的影响脂联素对机体代谢功能的影响和调节机制已被广泛研究，然而，关于CTRPs的代谢调节功能知之甚少。下面我们总结了目前关于对CTRP代谢功能的报道。4.1CTRP1[27]CTRP1主要表达于脂肪组织。血浆CTRP1水平在DIO小鼠中降低，而在脂联[27]素敲除小鼠中升高，且抗糖尿病药物罗格列酮能够升高小鼠血清CTRP1浓度。[27]给予野生型小鼠重组CTRP1蛋白可急剧降低血糖。此外，在CTRP1转基因小鼠模型中，循环CTRP1水平增加的同时，胰岛素敏感性显著提升，并且高脂饮食诱导的体重增加得到抑制，可能是由于骨骼肌脂肪氧化增加导致小鼠能量消耗增加[29]。研究发现，CTRP1转基因小鼠骨骼肌中磷酸化AMP-活化的蛋白激酶a（AMPKa，AMP-activatedproteinkinase）及其下游脂肪合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC，[29]acetyl-CoAcarboxylase）磷酸化增加而失活。此外，重组CTRP1蛋白同样诱Thr172Ser79[29]导野生型小鼠中骨骼肌AMPKα和ACC磷酸化增加。这些研究共同表明，CTRP1是一种新型增强骨骼肌脂肪酸氧化蛋白。4.2CTRP3[53]CTRP3，又名CORS26/cartducin，主要由脂肪细胞和脂肪基质细胞等组织[30,54-57]表达。空腹增加小鼠CTRP3的循环水平，而高脂肪喂养可将CTRP3水平降低[30]约50％。在人体中，循环CTRP3水平与脂联素水平正相关，而与腰围、血压、[50]空腹血糖、甘油三酯和胆固醇呈负相关。循环CTRP3水平增加显着降低野生型、db/db和ob/ob小鼠血糖;CTRP3通过激活蛋白激酶B/Akt信号通路抑制肝脏糖异生关键基因表达（G6Pase和PEPCK）和糖异生。这与脂联素作用机制不同，脂[30]联素通过激活AMPK以抑制肝糖输出。CTRP3转基因小鼠抵抗高脂诱导的肝脂肪变性。此外，重组CTRP3蛋白可能通过抑制甘油三酯合成酶（GPATs，AGPATs和DGATs）的表达来减少DIO小鼠肝脏甘[58]油三酯含量，然而，CTRP3对肝脏脂肪氧化无明显影响。此外，CTRP3也可能67 重庆医科大学博士研究生学位论文[25]通过抗炎过程间接调节代谢。重组CTRP3减少脂多糖诱导的单核细胞、脂肪细[59-61]胞和结肠成纤维细胞的炎症。CTRP3还在心血管系统中发挥着重要的生理作用。重组CTRP3通过激活ERK1/[62]2和p38MAPK介导的信号转导通路诱导血管内皮细胞迁移和增殖，这表明CTRP3在调节血管生成发育方面，具有重要作用。虽然冠状动脉闭塞诱导的心肌梗塞脂肪组织和循环中的CTRP3表达显着降低，但是CTRP3过表达明显改善甚至恢复心脏功能和存活率，CTRP3通过激活AKT而非AMPK激酶抑制心肌细胞凋亡、间质纤[63]维化，增加心肌梗塞后的血运重建。总之，CTRP3在代谢、免疫和心血管功能方面具有重要的调控作用。4.3CTRP5[27]CTRP5高表达于眼和脂肪组织。延长线粒体耗尽诱导大鼠L6心肌细胞CTRP5表达。此外，重组CTRP5表达刺激AMPK信号转导，促进GLUT4胞膜表达并且通过[64]体外AMPK-ACC途径增强脂肪氧化。体外培养的小鼠和人类脂肪细胞表达并分泌[52]CTRP5。饱和脂肪酸上调脂肪细胞CTRP5表达，而CTRP5以自分泌方式抑制脂联[52]素和抵抗素分泌。尽管CTRP5在代谢中的生理作用仍不明确，但点突变（S163R）使CTRP5的折叠和分泌受损，从而导致常染色体显性遗传性疾病-迟发性视网膜黄[65-68]斑变性（L-ORD）的出现。两种L-ORD的S163R敲除小鼠模型中，一种模型成[69-70]功模拟视网膜变性表型，而另一种不会出现此。4.4CTRP6CTRP6广泛表达于机体各组织，在胰岛素抵抗db/db小鼠中CTRP6表达升高，[27]而胰岛素增敏剂抑制其表达。在肥胖和/或糖尿病模型中，脂肪组织、脂肪间质[71]和巨噬细胞CTRP6表达明显增加。CTRP6表达升高抑制外周组织葡萄糖摄取，促进胰岛素抵抗的发生发展；而CTRP6基因敲除能够改善DIO小鼠胰岛素敏感性，[71]增加能量代谢。进一步研究发现，CTRP6通过促进脂肪细胞和巨噬细胞释放TNF-α促进机体炎症。CTRP6抑制胰岛素刺激的脂肪细胞AKT磷酸化水平和葡萄糖摄取[71][72]。此外，研究发现慢病毒介导的CTRP6表达沉默改善饮食诱导的肥胖；CTRP6[73]通过脂联素受体AdipoRI/AMPK调节脂肪细胞分化。其次，CTRP6能够明显改善[74]类风性关节炎的发生发展。4.5CTRP968 重庆医科大学博士研究生学位论文CTRP9主要由脂肪表达。在瘦素缺陷肥胖ob/ob小鼠中，脂肪组织在8周龄的[28]外周循环中CTRP9表达升高，但随后在12周龄时正常化。这一观察结果提示，在发展成为严重肥胖和胰岛素抵抗之前，幼龄的Ob/Ob肥胖小鼠可能会出现适应[28]性代偿反应。同时，在DIO小鼠中循环CTRP9水平显著降低。通过腺病毒介导[28]的CTRP9过表达明显降低ob/ob小鼠的血糖水平而不改变体重和血浆胰岛素。在CTRP9转基因模型中，小鼠热量摄入减少，而代谢率随着高脂喂养逐渐增加，因此，CTRP9转基因小鼠能够抵抗高脂饮食诱导的体重增加，而这是由于骨骼肌中[75]AMPK激活、线粒体含量增加和脂肪氧化增强。此外，高脂饮食喂食的CTRP9转基因小鼠表现出改善的全身性胰岛素敏感性并且抵抗肝脏脂肪蓄积。这些观察结[75]果表明CTRP9可能以AMPK依赖性方式增强脂肪氧化。CTRP9还可以调节心脏和内皮细胞功能。在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和新鲜分离的血管环中，重组CTRP9蛋白通过AMPK-eNO合成酶途径促进NO的产生以诱[76]导血管舒张。CTRP9也有助于心脏对抗压力应激。CTRP9过表达通过AMPK减少[77]心肌梗塞面积和心肌缺血/再灌注后缺氧诱导的心肌细胞凋亡，进一步研究发现只有CTRP9的C-末端球状结构域能够抑制缺血/再灌注损伤诱导的氧化应激和心肌[78]梗塞面积，并增强DIO小鼠心输出量。在股动脉损伤模型中，CTRP9过表达腺病毒通过cAMP/PKA/ERK途径抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，最终减少新生内膜[79]的形成。由于肥胖和胰岛素抵抗是心血管脏功能障碍的危险因素，因此，在心脏抵抗压力应激等反应中，CTRP9具有明显的保护作用。4.6CTRP11[33]CTRP11主要表达在白色和棕色脂肪组织。序列比对表明不同脊椎动物物种的CTRP11之间存在显著的氨基酸同源程度。在白色脂肪组织中，CTRP11主要由脂[33]肪基质细胞产生。CTRP11表达受到代谢状态变化的调节，禁食再喂养诱导[33]CTRP11表达上调。CTRP11特异性抗体的缺乏使内源性蛋白质分析受限，因此，CTRP11是否存在于外周循环尚不确定。功能研究表明CTRP11在调节脂肪生成中发挥重要作用。CTRP11通过抑制脂肪形成的两个主要转录调节因子PPAR-γ和[33]C/EBP-α的表达以抑制3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。此外，CTRP11抑制3T3-L1前脂肪细胞有丝分裂克隆扩增—脂肪细胞分化所必需的过程[33]。这些体外研究表明，CTRP11可能以旁分泌方式作用介导脂肪细胞和间质细胞69 重庆医科大学博士研究生学位论文之间的“Cross-Talk”相互作用，从而维持脂肪组织稳态。4.7CTRP12研究表明，CTRP12与C1q家族其他成员之间在C1q结构域只有适度的序列同[31][31]源。CTRP12广泛表达在小鼠各组织，人类脂肪组织主要表达CTRP12。与其他[31,35]CTRPs不同，内源性CTRP12以两种不同大小的同种型存在。Furin/PCSK3是前蛋白转化酶家族的成员，在N-末端KKXR基序内Lys-91位点酶解CTRP12。两种CTRP12型别在寡聚体结构和信号特异性方面截然不同，全长蛋白优先激活AKT信[80]号，而球状gCTRP12亚型优先激活p44/42-MAPK和p38-MAPK信号。DIO小鼠脂肪组织中CTRP12表达显著降低，但胰岛素或罗格列酮能够急性诱导脂肪细胞中[81]CTRP12表达。研究表明DIO小鼠中CTRP12的酶解作用增强。通过腺病毒过表达或重组蛋白能够在增加循环CTRP12水平的同时降低野生型、DIO和ob/ob小鼠血[31]糖，而改善胰岛素敏感性。这主要是由于肝脏和脂肪组织中胰岛素信号传导增[31]强介导，而非骨骼肌组织介导的。独立于胰岛素，重组CTRP12抑制肝细胞中的糖异生并促进脂肪细胞葡萄糖摄取。因此，CTRP12通过胰岛素依赖和胰岛素非依赖机制改善代谢功能。CTRP12过度表达的肥胖小鼠中脂肪组织炎症被抑制，表明[35]CTRP12改善全身胰岛素敏感性可能由其抗炎作用介导。相反，CTRP12过表达腺[31]病毒不改变脂肪组织形态学或炎性基因表达（例如，IL-1β、IL-6和TNF-α）。因此，CTRP12是一种具有抗糖尿病特性的新型脂肪因子。然而，关于其具体病理生理功能和调控机制有待于进一步研究、系统阐释4.8CTRP13CTRP13主要表达于小鼠脂肪、脑组织，以及人的脂肪组织。在小鼠脂肪组织[32]内，CTRP13也主要由脂肪组织间质细胞产生。在培养的脂肪细胞、肌管和肝细胞中，重组CTRP13激活AMPK以促进葡萄糖摄取。CTRP13还通过抑制SAPK/JNK[32]信号传导部分逆转脂质诱导的肝细胞胰岛素抵抗。此外，CTRP13通过激活AMPK[32]信号传导抑制葡萄糖异生酶G6Pase和PEPCK表达以抑制肝细胞糖异生。在大脑中，CTRP13作为厌食因子调节食物摄入。限制摄食抑制野生型小鼠下丘脑CTRP13表达，而其在DIO小鼠中枢表达上调；此外，中枢微量注射CTRP13重组蛋白显著抑制食物摄入并降低小鼠体重；中枢CTRP13过表达抑制下丘脑食欲肽AgRP表达，[82]而中枢AgRP表达增加Ctrp13水平。摄食限制的小鼠下丘脑CTRP13表达降低而70 重庆医科大学博士研究生学位论文[82]神经肽（NPY和AgRP）的表达增加。这些结果表明CTRP13和AgRP形成下丘脑反馈回路以调节食物摄入。4.9CTRP15[83]CTRP15又被称为myonectin。与其他CTRPs不同，CTRP15是一种主要由小鼠和人类骨骼肌组织表达的肌细胞因子。禁食后再喂食能够明显增加CTRP15[34]/myonectin的表达和上调循环水平，而其在DIO小鼠中明显下调。有趣的是，CTRP15/myonectin在不同肌纤维类型中表达迥异。基础水平下，与快速糖酵解纤维相比，CTRP15/myonectin在氧化性慢肌纤维中表达更多。禁食后再喂食增加CTRP15/myonectin的表达，在慢肌纤维中增加约80倍，而在快肌纤维中仅约4倍;[34]空腹后，葡萄糖或脂质处理能明显增加血清CTRP15/myonectin水平。这些结果表明CTRP15/myonectin可能作为一种饮食诱导的由骨骼肌产生并分泌激素，能够感应能量摄入；与此相一致，通过上调CD36，脂肪酸结合蛋白和脂肪酸转运蛋白促进肝细胞摄取，重组CTRP15/myonectin蛋白可能通过上调对脂肪酸结合蛋白[34]和脂肪酸转运蛋白的表达，促进肝细胞脂肪酸摄取，从而降低血清脂质水平。5.结语近几年来，尽管国内外学者对CTRPs蛋白在代谢中的作用及其机制做了许多研究，然而，还有许多问题亟待解决。CTRPs进化保守，拥有C1q结构域的共性，也具有其自身的特性。未来转基因过表达、传统系统敲除和组织细胞特异性条件敲除小鼠模型的利用将为CTRPs家族成员揭示新的生理功能和作用机制，也势必会为其在代谢性疾病中的作用提供实验基础和理论依据。71 重庆医科大学博士研究生学位论文参考文献[1]DengY,SchererPE.Adipokinesasnovelbiomarkersandregulatorsofthemetabolicsyndrome[J].AnnNYAcadSci.2010,1212:E1–E19.[2]SchererPE.Adiposetissue:fromlipidstoragecompartmenttoendocrineorgan[J].Diabetes.2006,55:1537–1545.[3]FantuzziG.Adiposetissue,adipokines,andinflammation[J].JAllergyClinImmunol.2005,115:911–919.[4]KadowakiT,YamauchiT,KubotaN,HaraK,UekiK,TobeK.Adiponectinandadiponectinreceptorsininsulinresistance,diabetes,andthemetabolicsyndrome[J].JClinInvest.2006,116:1784–1792.[5]TurerAT,SchererPE.Adiponectin:mechanisticinsightsandclinicalimplications[J].Diabetologia.2012,55:2319–2326.[6]OkamotoY,KiharaS,OuchiN,NishidaM,AritaY,KumadaM,etal.AdiponectinreducesatherosclerosisinapolipoproteinE-deficientmice[J].Circulation.2002,106:2767–2770.[7]TullinS,SamsA,BrandtJ,DahlK,GongW,JeppesenCB,etal.Recombinantadiponectindoesnotlowerplasmaglucoseinanimalmodelsoftype2diabetes[J].PLoSOne.2012,7:e44270.[8]QiY,TakahashiN,HilemanSM,PatelHR,BergAH,PajvaniUB,etal.Adiponectinactsinthebraintodecreasebodyweight[J].NatMed.2004,10:524–529.[9]KubotaN,YanoW,KubotaT,YamauchiT,ItohS,KumagaiH,etal.AdiponectinstimulatesAMP-activatedproteinkinaseinthehypothalamusandincreasesfoodintake[J].CellMetab.2007,6:55–68.[10]EhlingA,SchafflerA,HerfarthH,TarnerIH,AndersS,DistlerO,etal.Thepotentialofadiponectinindrivingarthritis[J].JImmunol.2006,176:4468–4478.[11]KishoreU,GaboriaudC,WatersP,ShriveAK,GreenhoughTJ,ReidKB,etal.C1qandtumornecrosisfactorsuperfamily:modularityandversatility[J].TrendsImmunol.2004,25:551–561.72 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重庆医科大学博士研究生学位论文致谢白驹过隙，时光荏苒，三年的博士学习即将结束了，在这三年的学习生活中不仅使我收获了知识，更获得了友谊，三年来有多少可亲可敬的师长、同学、朋友给了我无私的关心、支持和帮助，在这里请接受我最诚挚的谢意。首先衷心感谢敬爱的导师杨刚毅教授和师母李伶教授。三年来导师不仅在学业上给我以悉心指导，同时在思想、生活、工作方面也给我以无微不至的关怀和教导，在此谨向导师杨刚毅教授和师母李伶教授致以最诚挚的谢意和最崇高的敬意！导师崇高的品格、渊博的知识、严谨务实的作风、富有创新的科研思维使我获益匪浅、终身受益，深刻影响着我今后的工作和生活。也特别感谢同门师兄弟、姐妹在课题阶段及论文撰写过程中对我遇到的困难和疑惑给予悉心指点，提出了许多有益的改善性意见，投入了很多的心血和精力。感谢内蒙古自治区巴彦淖尔市医院检验科和体检中心李培华主任、姬智、王伟副主任和内分泌科王秀春、贾文丽、李玉梅医师以及我的学生们在仪器使用、病例采集方面给与的帮助。感谢这篇论文所涉及到的各位学者。本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学者的研究成果的帮助和启发，我很难完成本篇论文的写作。感谢重庆医科大学所有老师及论文评阅老师们的辛苦工作。感谢我的家人，是他们的理解、支持、包容和帮助，使我顺利完成三年的学习。感谢所有给予过我关心、帮助、理解、支持和信心的老师、领导、同事和朋友们。81 重庆医科大学博士研究生学位论文博士期间发表的文章1.LinZhang,XiaFang,LingLi,RuiLiu,ChengZhang,HuaLiu,MinghongTan,GangyiYang.TheAssociationbetweenCirculatingIrisinLevelsandDifferentPhenotypesofPolycysticOvarySyndrome.JournalofEndocrinologicalInvestigation,2018(已接收)2.HuangH,WangW,YangG,ZhangY,LiX,LiuH,ZhangL,ZhengH,LiL.Circulatingbonemorphogeneticprotein-9levelsareassociatedwithhypertensionandinsulinresistanceinhumans.JAmSocHypertens,2018;pii:S1933-1711(18)30046-93.LeiL,LiK,LiL,FangX,ZhouT,ZhangC,LuoY,LiuH,LiX,ZhengH,ZhangL,YangG,GaoL.Circulatingzinc-α2-glycoproteinlevelsarelowinnewlydiagnosedpatientswithmetabolicsyndromeandcorrelatewithadiponectin.NutrMetab(Lond),2017;14:53.4.HuW,TianB,LiX,LiL,ZhangL,LiuH,YangG,LiuY,FanX.CirculatingZbed3LevelsinSubjectsWithandWithoutMetabolicSyndrome.MetabSyndrRelatDisord,2017;15(5):207-21282