《趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
Ｉ：－－去靈码；画５＾二－学号：２０１３５２３２０６４＇ｙＷ＾＾夺ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ…画細麵ＢＩＷ－趋化因子ＣＣＬ２０与Ｔｈｌ７细胞在ＩｇＡ腎病发病机制悄贴側—＿圓圓■—ＩＩ■■Ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆ沈ｅｍｏｋｉｎｅＣＣＬ２０ａｎｄＴｈ１７ｃｅｌｌｓｍｔｈｅａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＩＡＮｅｈｒｏＥｉｔｈｐｇｐｐｙ研究生姓名张小攀指导教！１巧姓名卢国元专业名称賢脏内科—研究方向ＩｇＡ醬病的发龍制所在院部綱化報貞第－医院论交提如期２０１６年５月 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。＇论文作者签名：故小聲曰期：）乂ＩＬｌｋｉ４） 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，质良Ｐ论：文学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸信的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献息情报中也、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、文中档国学术期刊（光盘版）电子杂志巧送交本学位论文的复印件和电子，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或其他复制手段据保库存和进行汇编学位论文，可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数检索。涉密论文口本学位论文属在年＿＿月解密后适用本规定。非涉密论文□论文作者签名：旅水曰期：聲＾－导师签名：日期：加Ｉ巧 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用中文摘要趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用中文摘要目的：检测趋化因子CCL20在IgAN患者的表达水平，探讨其受体CCR6在外周血免疫细胞的表达，并探究他们与Th17细胞在IgAN之间的相互作用，为IgAN的发病机制提供一条新思路。方法：1、用IgAN患者血清与人肾小球系膜细胞孵育24小时，运用RT-PCR技术筛选出高表达的趋化因子；运用Jacalin-Agrose亲和层析法提取IgAN患者血清和健康人血清中的IgA1，然后分别与肾小球系膜细胞孵育24小时，再通过RT-PCR检测两组CCL20的mRNA表达水平；再用ELISA的方法直接检测IgAN及健康人两组血清中CCL20的表达水平。2、通过transwell趋化实验及流式细胞分析了解CCL20优先趋化的细胞及其受体在哪种（哪几种）细胞上表达水平较高。+3、通过胞内因子染色实验及细胞因子表达谱实验检测CCR6细胞与Th17细胞之间的关系。4、应用免疫组化和免疫荧光技术分别检测CCL20、T细胞及Th17细胞三者在IgAN患者肾脏组织、其他肾病组织及癌旁组织的表达。结果：1、趋化因子CCL20在IgAN患者血清与HMC孵育后的表达上升；且无论是检测两组血清提取的IgA1与HMC孵育，还是单测IgAN患者和健康对照组的血清，结果均是CCL20的表达水平在IgAN患者组显著高于健康对照组；2、趋化因子CCL20优先趋化外周血T细胞（成熟T细胞），并且其受体CCR6在成熟T细胞中表达水平及平均荧光强度都较高；I 中文摘要趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用+3、CCR6T细胞主要是分泌IL-17的Th17细胞，它们分泌炎症因子到引起肾脏损伤或者形成免疫炎症反应进一步损伤；4、用免疫组化法检测在IgAN患者组织检测到CCL20，而对照组则否；用免疫+++荧光法检测到CD3CCR6IL-17细胞的存在，而对照组则否。结论：在IgAN中CCL20的高表达引起CCR6+T细胞（主要是Th17细胞）的高表达，Th17细胞通过分泌大量的炎症因子和细胞因子进一步引起肾脏损伤。关键词：IgAN；CCL20/CCR6；Th17/IL-17；发病机制作者：张小攀指导老师：卢国元II 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用英文摘要TheinteractionofchemokineCCL20andTh17cellsinthepathogenesisofIgANephropathyAbstractObjective:DetectionoftheexpressionlevelofchemokinesCCL20inpatientswithIgANandtheexpressionofitsreceptorCCR6inperipheralimmunecells,andfurtherexplorationtheinteractionbetweenCCL20/CCR6andTh17cellsinIgAN,inordertoprovideanexcitongnewwayforthepathogenesisofIgAN.Methods:1、IncubatinghumanglomerularmesangialcellswithIgANpatientsserumfor24hours,usingRT-PCRtechnologytoscreenhighexpressionofchemokines.Additonaly,usingJacalin-AgroseaffinitychromatographytoextracttheIgA1inIgANpatientserumandhealthypeople’s,thenrespectivelyincubatedwithHMCfor24hours,andthendetectedoftwogroupsofCCL20mRNAexpressionlevelbyRT-PCR.Furthermore,weusedthemethodofELISAtodetectserumchemokineexpressionlevelinthetwogroupsofIgANandhealthypeople.2、UsingtranswellchemokinesexperimentandflowcytometryanalysistoanalyzetheexpressionlevelofthechemotaxisofCCL20cellsanditsreceptorinwhatkindofcells.3、Usingdyeingintracellularfactorexperimentsandcytokineexpressionspectrum+experimenttodetecttherelationshipbetweenCCR6cellsandTh17cells.4、ApplicationofimmunohistochemistryandimmunofluorescencetechniquetorespectivelydetecttheexpressionofCCL20,TcellsandTh17cellsinthekidneysofIgANpatients,otherkidneydiseasetissueandtissueadjacenttocarcinoma.Results：1、ThechemokineofCCL20expressionincreasedafterweincubatedHMCwithIgANpatientsserum.Inaddition,boththetwogroupsofserumIgA1incubationwithHMC,andsinglydetectedtheserumofIgANpatientsandhealthycontrols,theresultsweretheexpressionofCCL20levelsinpatientswithIgANgroupwassignificantlyhigherthanhealthycontrolgroup.III 英文摘要趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用2、ChemokinesCCL20waspriorityforchemotaxisperipheralbloodTcell(matureTcells),anditsreceptorCCR6expressionlevelandtheaveragefluorescenceintensitywerehigherinmatureTcellsthannaïveTcells.+3、CCR6TcellswrermainlyTh17cellswhichsecretionofIL-17,andtheseTh17cellssecretedalargenumberofinflammatorycytokinestocausekidneydamageorfurtherdamage.4、Usingimmunohistochemicalmethod,wecandetectedCCL20inpatientswithIgANkidneyorganization,whilenotincontrolgroup;Usingimmunofluorescencemethod,we+++canalsodetectedCD3CCR6IL-17cells,butnotinthecontrolgroup.Conclusion：+Insummary,highexpressionofCCL20inIgANcauseCCR6Tcells(mainlyTh17cells)highexpressionlevel,andthenTh17cellssecretedlotsofinflammatoryfactorsandcytokinescausekidneyfurtherdamage.Thus,blockCCL20/CCR6couldbecomeanewtherapeuticmethodforIgAN.Keywords:IgAN;CCL20/CCR6;Th17/IL-17;pathogenesisWrittenby:XiaopanZhangSupervisedby:GuoyuanLuIV 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用目录前言··························································································1第一部分：材料与方法·····································································3第二部分：结果············································································17第三部分：讨论············································································31结论························································································35参考文献·····················································································36综述························································································42硕士期间完成论文·········································································54名词缩写表··················································································55致谢························································································56 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用前言前言IgA肾病（IgAN）是1968年由法国学者Berger首先描述和命名的，又称为Berger[1]病。其特征是肾活检免疫病理显示IgA或以IgA为主的免疫球蛋白及补体成分在肾小球系膜区呈弥漫性颗粒状或团块状沉积，有时伴有毛细血管襻沉积而引起一系列临床及病理改变。而IgA肾病也是我国常见的一种慢性肾小球肾炎，约占原发性肾小球[2-3]肾炎的45％。IgA肾病可发生于任何年龄，以儿童和青年人最常见。根据病理表现和特征，IgAN有多种病理学分类方法，其中包括Lee氏分类、Hass分型及牛津分类等，这些分类方法都是指导IgAN治疗和预后的重要依据。据报道约20%-30%的[4]IgAN病人在10-20年内将不可避免的发展为终末期肾脏病。由于对IgAN的发病机制和治疗仍然存在众多疑惑，有关IgAN的基础与临床研究仍是世界各国同行非常关注的焦点。当前，IgAN的研究热点主要集中在免疫机制方面。本文就IgAN肾小球系膜区沉积异常IgA1复合物而引起肾脏进一步损伤的机制方面做进一步探讨。[5,6]IgAN诊断的组织学特征是异常糖基化的IgA1复合物的沉积在肾小球系膜区，[7]这也表明肾小球系膜细胞是损伤的第一目标。除此之外，肾小球系膜细胞还可以释放促炎症因子和促纤维化因子进一步引起炎症反应而损伤肾脏，其中包括IL-1β、IL-6、[6-10]IL-8、MCP-1、TNF-α等等。另外，还有报道指出异常糖基化的IgA1还可以引[11-13]起肾小球系膜细胞的异常增生和凋亡。这一系列的免疫炎症因子和细胞的异常可促使IgAN进一步发展甚至恶化。细胞因子和趋化因子也是引起炎症的重要原因，趋化因子是众多趋化细胞因子的[14]一部分,其在病理条件下可以募集炎症细胞到病变部位。此外，趋化因子在特定的[15-17]微环境下还可以参与肾脏慢性炎症的形成。还有报道指出趋化因子及其相应受体[18]还参与肾脏疾病的产生与发展。近几年，越来越多的学者热衷于研究趋化因子CCL20，曾被成为肝脏活化调节趋化因子（liver-andactivation-regulatedchemokine，LARC）、巨噬细胞炎症蛋白3α（macrophageinflammatoryprotein-3α，MIP-3α）和Exodus-1。CCL20的唯一受体也参与多种疾病的发生和发展，如肿瘤、类风湿关节炎、[19-22]肺炎球菌性脑膜炎和肾脏炎症相关疾病等。之前有研究显示CCL20/CCR6通过一系列的炎症细胞表达到各个组织上，其中包括成熟效应/记忆T细胞、B细胞和树1 前言趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用[23,24]突状细胞。另外还有研究表明在某些炎症刺激条件下CCR6的mRNA水平在T[25]细胞的表达中上调。肾脏组织中的淋巴细胞主要来源于血液。研究已经证实在慢性肾小管间质损害中，淋巴细胞募集是最为重要的特征。实验证明，淋巴细胞培养液中存在促进成纤维细胞[26]增殖和胶原合成的因子。T细胞合成和分泌重要的促进纤维产生的细胞因子。幼稚T细胞活化后一部分可成为辅助T细胞，再根据各个亚群所分泌的细胞因子及其效应+功能再将辅助T细胞（CD4Tcells）分为四个主要的亚群，即Th1细胞、Th2细胞、调节T细胞(Tregs)和Th17细胞。最早发现的Th1细胞主要合成分泌IFN-γ、IL-2，并参与细胞免疫反应和迟发型超敏反应；Th2细胞合成IL-4、IL-5、IL-6和IL-13，并辅助B细胞分化成抗体分泌细胞；调节T细胞具有免疫调节功能，调节免疫耐受[63,64]和保护机体免受炎症损伤；而新发现的Thl7细胞通过分泌大量的细胞因子发挥效应,如IL-17（为主）、IL-6、IL-21、IL-22、IL-23和TNF-α，募集中性粒细胞和[44]巨噬细胞到炎症部位通过大量的细胞因子引起大规模的组织炎症反应。还有研究表明,细胞因子在促进Th17细胞分化中也发挥了重要作用，另一方面，活化的Th17细[48,49]胞进一步促进了细胞因子的分泌,导致炎症和疾病的发生和发展。尽管是辅助T细胞的新成员，但越来越多的研究表明Th17细胞是参与自身免疫性疾病、慢性炎症疾病甚至癌症的发生发展的重要因素，其中包括类风湿关节炎、炎[22-23,27-29]症性肠病、肾小球肾炎和大肠癌等。还有报道指出CCL20受体CCR6选择[31,32]性地表达在Th17细胞上。此外，Th17细胞之所以发挥多种效应功能主要是通过[32,27]其产生的IL-17作为炎症相关疾病的一个调节介质并引起一系列的免疫炎症反应。肾脏，作为免疫作用的靶器官之一，其病理损伤过程也有Th17细胞和CCL20免疫反[28,52]应参与。但是，在IgAN中Th17细胞与趋化因子CCL20的效应作用及潜在的关系尚不是十分明确。本研究重点就趋化因子CCL20及其受体CCR6在IgAN的免疫机制方面究竟是否与Th17细胞有潜在的关系以及如何相互作用做一详细探讨。当然，明确IgAN的发病机制的最终目的是为了更好地指导该病的防预、临床治疗及改善预后。2 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第一部分：材料与方法第一部分：材料与方法1.1、实验材料1.1.1、实验标本收集与预处理1.1.1.1、IgA肾病患者及对照组外周血标本：两组外周血均随机收集于苏州大学附属第一医院。其中IgAN患者是经肾活检证实，共61例，其中男33例，女28例，平均年龄为（34±5.6）岁；对照组为健康体检者，共218例，其中男105例，女113例，平均年龄为（46±7.2）岁。用含有EDTA的抗凝管收集的外周血5ml，经离心机离心（4℃3400rpmx5min）后，小心收集上层血清吸到无菌EP管中保存，血清标本均保存-80℃超低温冰箱待用。1.1.1.2、IgA肾病患者及对照组肾脏病理切片标本：二者均收集于2013年8月到2014年5月。IgAN患者是经肾活检证实，由第二军医大学附属长征医院肾脏病理室提供制备好的病理标本。对照组肾癌周组织和肾病综合征、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病，其中癌周组织是指距肾癌组织5cm以上，病理证实均为透明细胞癌，由苏州大学附属第一医院病理科提供；其它肾病组织也是经过病理证实并由第二军医大学附属长征医院肾脏病理室提供。具体标本资料见表1.1，所有标本均保存于-80℃超低温冰箱待用。表1.1病理切片标本资料Table1.1PathologicalSpecimensInformation总计(n=)年龄男/女血肌酐尿红细胞岁M:Fmg/dlRBC/HPFIgA肾病4633±10.821:2571±12.163±163.3肾癌病人(癌旁组织)1649±15.710:675±15.218±24.1肾病综合征1237±14.34:782±22.925±33.6狼疮性肾炎2250:2123.559.5糖尿病肾病1391:0617数据表示为均值±标准差；RBC/HPF:每高倍镜视野的尿红细胞个数。1.1.2、细胞系：3 第一部分：材料与方法趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用HMC细胞系购自上海博慧斯公司。1.1.3、细胞培养相关试剂及材料：细胞培养基RPMI1640、DMEM、L-谷氨酰（L-Glutamine）氨购自上海化学试剂公司；双抗（氨卞青霉素钠、硫酸链霉素）购自上海第四制药厂；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；0.25%胰酶溶液+0.02%EDTA溶液购自吉诺公司；1.8ml冻存管（外旋）、移液管、15ml离心管购自Nunc公司；细胞培养板、细胞培养瓶购自COSTAR公司；DMSO购自Sigma公司；排枪购自Eppendorf公司；透析袋购自上海百赛生物技术有限公司；亲和层析柱购自Biocoma公司；0.22um混合纤维素微孔滤膜购自millipore公司；流式管、含有EDTA抗凝的收集管购自BD公司；分选磁力架分离柱购自Miltenyi公司；分离柱购自Thermo公司；固定破膜剂、佛波酯（PMA）、离子霉素（Ionomycin）、Brefeldin-A(BFA)购自eBioscience公司。1.1.4、分子生物学试剂：-TotalRNA提取试剂、逆转录酶M-MLV（RNAaseH）购自宝生物工程（大连）有限公司；OligodT购自Invitrogen公司；dNTP和Taq酶购自TaKaRa公司；FastStartUniversalSYBRGreenMaster（Rox）购自罗氏公司；IgA1bindingprotein(Jacalin/Agrose)购自InvivoGen公司；蜜二糖购自上海研域生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Sigma公司；ELISA相关抗体及重组蛋白购自R&D公司，余其他ELISA相关试剂购自Biosciencegs公司；淋巴细胞分离液购自Cedarlanelabs公司；葡聚糖（分子量为200000）购自南京都莱生物技术有限公司；重组蛋白rhCCL20购自R&D公司。1.1.5、实验有关抗体：APC-anti-CCR6抗体、FITC-anti-CCR6抗体、Percp-anti-CD11b抗体、FITC-anti-CD19抗体、PE-anti-CD3抗体、PE-anti-CD11c抗体、FITC-anti-CD14抗体、FITC-anti-CD3抗体、biotin-anti-CD3抗体、PE-anti-CD44抗体、biotin-anti-CD3抗体、purified-anti-CD3抗体、purified-anti-CD28抗体、PE-anti-IL-4抗体、PE-anti-IL-17抗体、APC-anti-IFN-r抗体，以上抗体均购自Biolegend公司；MicroBeads购自Miltenyi公司；CCL20抗体购自R&D公司；anti-IgA1抗体购自abcam公司。1.1.6、常用实验试剂及耗材：无水乙醇、二甲苯、甲醇、柠檬酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、丙4 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第一部分：材料与方法三醇、冰醋酸、过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司；DAPI购自台湾生工有限公司青岛分公司；脱脂奶粉购自BD公司；牛血清白蛋白（BSA）购自美国罗氏公司；苏木精购自上海伯奥生物科技有限公司；中性树脂封片剂购自上海标本模型厂；烧杯购自上海禾汽玻璃仪器有限公司；载玻片、盖玻片购自江苏世泰实验器材有限公司；免疫组化笔、DAB试剂盒购自上海基因科技有限公司；免疫组化湿盒、抗原修复盒、切片盒购自常州飞勒斯仪器有限公司；染色缸购自海门市蓝天实验仪器有限公司。1.1.7、主要实验仪器：超净工作台（Esco）；CO2培养箱（Thermo）；正置/倒置显微镜、正置/倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜（Nikon）；数码凝胶图像处理系统（Tanon）；TGL-16B台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；小型冷冻离心机、冷冻高速离心机（Eppendorf）；液氮罐（Thermo）；-80℃超低温冰箱（Harris,America）；多功能荧光酶标仪（synergyH4HybridreaderBio-TEK）；恒温振荡器（太仓市华美生化仪器厂）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；pH计(MettlerToledo)；实时定量PCR仪（realplex,Eppendorf）；PCR仪（eppendorf）)；迷你离心机、干式恒温器、TransferenceDecoloringshaker（TS-8）、Orbitalshaker(TS-1)、Vortex(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；水浴锅、隔水式电热恒温培养箱（精宏）；恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；旋转切片机（LEICA公司）；冷冻台、全自动组织脱水包埋机、生物组织摊片机、生物组织烤片机（益迪医疗设备厂）；电热恒温鼓风干燥机（上海森信实验仪器有限公司）。1.1.8、流式细胞仪：TMBDCalibur、BDFACSCantoII、BDFACSAriaIII。1.1.9、常用溶液的配制方法：红细胞裂解液(ACK1L）碳酸氢钾1.001g、氯化铵8.024g、EDTA0.01mM；考马斯亮蓝染液（1L）：R-2501g、甲醇450ml、ddH2O450ml、冰醋酸100ml;脱色液(1L)：500ml甲醇、400mlddH2O、100ml冰醋酸；蛋白纯化平衡液：10mM的Na3PO4,150mM的NaCl，PH7.4；蛋白纯化洗脱液：用PBS稀释蜜二糖至0.1M，PH7.4；蛋白纯化再生液：乙醇与PBS体积比为1：4，PH7.4;磷酸盐缓冲液（PBS1L）：氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.4g、磷酸二5 第一部分：材料与方法趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用氢钾0.27g；1.1.10、实验相关引物：表1.2实时定量PCR引物Table1.2PrimersusedforReal-timePCRGeneSEQUENCE（5’-3’）F5’GCGAATCAGAAGCAGCAAGC3’CCL20R5’GGATTTGCGCACACAGACAA3’F5’CGCGTGCTAATGGTGGAAA3’TGF-βR5’CGCTTCTCGGAGCTCTGATG3’F5’GGGGCTGTCAGTCATCATCT3’CCR6R5’AACATCAGCAGCTCCCACCT3’F5’AGTGCACCTACTTCAAGTTCT3’IL-2R5’AATGTGAGCATCCTGGTGAG3’F5’CAGCCTCACAGAGCAGAAG3’IL-4R5’CTTCTCATGGTGGCTGTAGA3’F5’TCTGAGGATTCCTGTTCCTG3’IL-5R5’GAATTGGTTTACTCTCCGTCT3’F5’GAGTAACATGTGTGAAAGCAG3’IL-6R5’GCTTGTTCCTCACTACTCTC3’F5’CTGAGAGTGATTGAGAGTGG3’IL-8R5’CAACCCTCTGCACCCAGTT3’F5’CTCAGATGACCAATACCACC3’IL-9R5’GACTCTTCAGAAATGTCAGCG3’F5’CCAGTCTGAGAACAGCTGC3’IL-10R5’GGATCATCTCAGACAAGGCT3’F5’GGCGAGGTTCTAAGCCATTC3’IL-12R5’CAGCAGGTGAAACGTCCAGA3’F5’GATGGTCAACCTGAACATCC3’IL-17R5’CGTTGATGCAGCCCAAGTG3’F5’GCCACGGCACAGTCATTGAAA3’IL-21R5’ACATGAAGGGCATGTTAGTCT3’F5’ATCTAAGAGAAGAGGGAGATG3’IL-23P19R5’ATCCGATCCTAGCAGCTTCT3’F5’GACAAGCCTGTAGCCCATG3’TNF-αR5’TACAGGCCCTCTGATGGCA3’F5’GCAGAGCCAAATTGTCTCCT3’IFN-γR5’GCGTTGGACATTCAAGTCAG3’F5’AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3’HumanGAPDHR5’AGGGGCCATCCACAGTCTTC3’6 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第一部分：材料与方法1.2、实验方法1.2.1、细胞水平相关实验方法：1.2.1.1、HMC传代及冻存：培养和传代：将新购买的第3代HMC细胞置于37℃，5%CO2的条件下培养于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/mL链霉素及2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中。当细胞长到~90%满时，吸掉培养基，先用PBS清洗细胞，再加入0.5-1ml胰酶。将培养瓶置入37℃培养箱，放置3分钟左右，使细胞消化完全。加入4ml的完全培养基终止胰酶的消化。将细胞悬浮液转入离心管，离心细胞4℃1200rpmx5min，离心结束后弃上清。用完全培养基悬浮细胞，1:3至1:4的比例将细胞分到新的培养瓶中。冻存：当细胞长到~90%满时，吸掉培养基，先用PBS清洗细胞，再加入0.5-1ml胰酶。将培养瓶置入37℃培养箱，放置3分钟左右，使细胞消化完全。加入4ml的完全培养基终止胰酶的消化。将细胞悬浮液转入离心管，离心细胞4℃1200rpm×5min，离心结束后弃上清。用含有10%DMSO的血清悬浮细胞团，然后以1:2-1:3的比例将细胞分到冻存管中。将冻存管放入缓慢冻存盒，置入-80℃冰箱过夜，第二天转放入液氮中。1.2.1.2、HMC与IgA1孵育：培养瓶中HMC细胞长到~90%满时，吸掉培养基，先用PBS清洗细胞，再加入0.5-1ml胰酶。将培养瓶置入37℃培养箱，放置3分钟左右，使细胞消化完全。加入4ml的完全培养基终止胰酶的消化。将细胞悬浮液转入离心管，离心细胞4℃1200rpm×5min，离心结束后弃上清。然后用1mlDMEM培养基重悬细胞，然后取510ul细胞重悬液到计数板并置于正置显微镜下观察计数。最后按2X10/孔铺到48孔板中，总液体500ul/孔。然后将提取的健康人及IgA肾病患者的IgA1（见下文）按100ug/ml加到48孔板中，每组至少3个孔，混匀后将48孔板放于37℃培养箱孵育24小时。1.2.1.3、外周血细胞分离:PBMC+N1）先将淋巴细胞分离液、PBS等试剂在超净台紫外线下灭菌30分钟。2）用含有EDTA抗凝的收集管收集健康人外周血5ml，与PBS1：1等体积混合放在15ml离心管中混匀。然后此混合液与6%葡聚糖再按4：1的体积比混合，混匀后7 第一部分：材料与方法趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用37°C静置40min。上述液体会分两层，上层为白细胞血清，下层为红细胞及其碎片。3）在一个新的15ml离心管中加入淋巴细胞分离液，然后用吸管缓慢吸取第2步中的上层液体至此离心管的分离液上，二者形成均一液面，使上层液与淋巴细胞分离液的体积比为3：2，室温下（20-25°C)离心400gX30min,其中ACC为1,DEC为0。4）离心结束后，液体将分5层，从上到下依次为：血浆、PBMC、分离液、粒细胞层、红细胞及碎片。5）缓慢分离PBMC层和/或粒细胞层到新的15ml离心管中，用PBS洗2-3次（第一次PBS体积应大于细胞沉淀体积的1.5倍）。如果红细胞较多，可适当用ACK裂解红细胞后在洗。6）最后用无血清的1640培养基将细胞重悬，取少许细胞悬液做台盼蓝排斥实验6（活细胞>90%），并在显微镜下计数并稀释成3X10/ml待用。1.2.1.4、趋化实验1）将transwell底部小室加600ul无血清的1640培养基，并在底部小室中加CCL20重组蛋白分别按0，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml分别混匀。2）取100ul上述分离的细胞悬液小心的加到transwell上层小室，最后于37°C细胞培养箱分别置1，2，3，4，8，12，24小时使细胞趋化。3）根据抗体说明书所推荐的稀释比例，将趋化到底部小室的细胞收集并分别染流式抗体。然后在流式细胞仪中分析。1.2.1.5、免疫磁珠法分离T细胞1）按上述方法分离的PBMC用biotin-anti-CD3抗体4°C避光染色30min，中间每隔5min摇晃一次，以免细胞成团。2）用PBS洗2-3次。3）用MicroBeads染PBMC，混匀后置4°C避光染色15-20分钟。4）PBS洗2-3次。5）将分离柱安装如磁场中，加入2mlPBS，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。6）将PBMC细胞悬液加入分离柱，自然流尽。然后2mlPBS加入分离柱，自然流尽，洗柱一次。7）从磁场中迅速取下分离柱，插到15ml离心管口上，加入1-2mlPBS,用针芯用力推尽液体，冲出阳性结合的细胞（CD3+T细胞），用含血清的1640培养基洗一次，8 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第一部分：材料与方法待用。1.2.1.6、T细胞活化1）在无菌的PBS中加purified-anti-CD3抗体，使其终浓度为5ug/ml，混匀后将其加到48孔板中。液体全部覆盖孔底，置于4°C过夜。2）吸出孔中液体，并用PBS缓慢清洗各孔，并将PBS吸出。3）将分离的T细胞悬液加入purified-anti-CD28抗体，其终浓度为3ug/ml，混匀6后按1X10细胞/孔加到各48孔板中。4）在37°C细胞培养箱中培养3天。1.2.1.7、流式细胞步骤：1）将已活化的T细胞收集，其中一部分用PBS洗后重悬用于流式检测；另一部分加500ul/孔的Trizol用于RNA抽提。2）根据抗体说明书所推荐的稀释比例，用FITC-anti-CD3抗体、PE-anti-CD44抗体、APC-anti-CCR6抗体分别染活化的和未活化的T细胞，并做阴性管及单染管于4°C避光放置30min。3）PBS洗3次。4）用500ulPBS重悬并置于流式管待测。1.2.1.8、胞内因子染色：1）分别加BFAPMAIonomycin至活化第3天的T细胞各孔中，小心混匀后继续放在培养箱培养。2）孵育4小时后收上述细胞，用PBS洗后重悬，分别标记为阴性管、单染管及实验管。（注意实验管留2份，因IL-4及IL-17均为PE通道）。3）以流式抗体说明书上所推荐的比例为参考，先染表面抗体，于4°C避光放置30min。4）PBS洗3次。5）用固定破膜剂4°C避光固定破膜30-60min。6）用1*washbuffer（用ddH2O稀释）洗细胞2次。7）再染胞内抗体,并同时染APC及PE的单染管。用1*washbuffer稀释相应抗体。4°C避光染色90min。8）用1*washbuffer洗细胞2次，并用300ulPBS重悬细胞于流式管中待测。9 第一部分：材料与方法趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用1.2.1.9、细胞因子表达谱：1）收集已活化的T细胞，用PBS洗后重悬。2）以流式抗体说明书上所推荐的比例为参考，染流式抗体CD3、CCR6，4°C避光染色30min。3）PBS洗2-3次，并置于15ml离心管待分选。+++-4）分别圈出CD3CCR6及CD3CCR6的细胞群，并于BDFACSAriaIII开始分选。5）将分选的细胞离心后，去掉上层PBS，并用800ulTrizol重悬。6）然后按照下文所述方法提取总RNA并逆转成cDNA，最后用RT-PCR检测各分子的mRNA表达水平。1.2.2、蛋白水平相关实验方法：1.2.2.1血清IgA1的提取：IgAN-IgA1的提取：1）随机取收集的10个IgA肾病患者的血清各取500ul，按照1：1的比例用平衡液稀释，并放于透析袋内。2）然后将此透析袋放在含有平衡液的烧杯中，将此烧杯置于4°C的转速器上缓慢旋转，每过1-2小时要更换一次烧杯中的平衡液，至少换3次，透析时间不少于12小时。3）在纯化柱上加1mlJacalin-Agarose，在重力作用下或控制流速为0.5-1ml/min流动。然后用至少5ml的平衡液平衡纯化柱。4）用0.22um过滤器过滤上述透析的血清样品，然后将此样品上柱4°C孵育2小时左右。然后在重力作用下使液体流出，而IgA1则留在含有Jacalin-Agarose的纯化柱上。5）用至少20ml平衡液洗柱，然后用10ml的洗脱液洗柱，并收集洗脱液，此洗脱液中就含有IgA。6）反复用至少10ml的再生液洗柱3次，最后1次留2ml再生液于纯化柱内，以便纯化柱和凝胶再使用。IgA1的浓缩：7）将上述已获得的含有IgA1的液体放入干净的透析袋中，将透析袋的两端夹闭，然后置于装有丙三醇的烧杯中，透析3-4小时；然后将透析袋中的IgA1浓缩液经10 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第一部分：材料与方法0.22um过滤器过滤到无菌的EP管中。8）最后提取的IgA1用BCA和SDS-PAGE的方法检测其浓度和纯度，分别标记后保存于-20°C待用。HC-IgA1提取方法同上，二者需用不同的纯化柱。1.2.2.2、BCA法测蛋白浓度1）标准品的制备：取9个15ml离心管，按照下表标记后分别加入试剂，充分混匀，并置于4°C保存。表1.3BCA标准品的配制Table1.3PreparationofthestandardforBCA液体组成去离子水（ml）蛋白标准溶液(ml)蛋白标准溶液终浓度(ug/ml)孔号A4.50.5ml蛋白原液200B8.02.0mlA40C4.04.0mlB20D4.04.0mlC10E4.04.0mlD5F4.04.0mlE2.5G4.83.2mlF1H4.04.0mlG0.5I8.000=blank2）BCA工作液的配制：根据样品及标准品的数量，每孔200ul的工作液，BCA试剂按A:B:C=25:24:1的体积比配制适量BCA工作液，充分混匀；3）将上述标准品按200ul/孔逐次加到酶标版中，至少有2个复孔；4）将待测样品按1：200；1：400；1：800的比例稀释，各稀释液至少2个复孔，每孔加200ul的样品分别加到酶标版各孔中。5）标准品及样品各孔中分别加入200ulBCA工作液；密封后把酶标板放在振荡器上轻轻振荡30秒，37℃放置30分钟-2小时。6）在562nm下比色测定。以标准曲线I号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；7）以蛋白浓度（ug/ml）为纵坐标，吸光值为横坐标，绘出标准曲线；根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即计算得相应的蛋白浓度然后乘以稀释倍数，各相应蛋白取其均值，即为该蛋白的浓度（ug/ml）.11 第一部分：材料与方法趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用1.2.2.3、SDS-PAGE：1）SDS-PAGE电泳：按常规配制10%的分离胶，5%的浓缩胶，将样品于沸水中煮10min，电泳起始电压80V，待样品进入分离胶后调整电压为120V。根据蛋白marker分子量位置控制电泳时间。2）在SDS-PAGE至完成约1小时。停止电泳，然后根据蛋白位置把胶切割下来，放在含有考马斯亮蓝染色液的盒子里染色并在摇床上以适当速度摇匀常温染色至少2小时。3）然后将染色液回收，用脱色液进行脱色，直至可以观察到条带为止。4）最后将胶置于白板上，凝胶成像仪进行白光拍摄成像。1.2.3、核酸水平相关实验方法：1.2.3.1、总RNA抽提：总RNA的提取：1）向48孔板中加入500ul/孔的Trizol，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。2）将内含细胞的裂解液移至离心管，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。3）室温静置5分钟。4）向上述的裂解液中按200μl/mlTrizol加入氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒。待溶液充分乳化后，再室温静置5分钟。5）12000g、4℃离心15分钟。6）从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中。7）向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30℃下静置10分钟。8）12000g、4℃离心10分钟，RNA会沉淀在管底。RNA的清洗9）小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g、4℃离心5分钟后小心弃去乙醇。RNA的溶解10）室温干燥沉淀2-5分钟，加入适量的RNAase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待沉淀完全溶解后于-80℃保存。12 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第一部分：材料与方法1.2.3.2、cDNA的制备：1）在Microtube中配制下列模板RNA/引物混合液，总体积6μl。试剂使用量OligodTPrimer（50μM）TotalRNA1ng-1μgTotalRNA的使用量一般为1ng-1μg。2）70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。试剂使用量上述变性后反应液6μl5×M-MLVBuffer2μldNTPMixture（各10mM）0.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.25μlRTaseM-MLV（RNaseH）（200U/μl）0.25μl～1μlRNasefreedH2Oupto10μl当起始模板RNA量＞500ng时，RTaseM-MLV（RNaseH¯）的使用量应＞0.25μl。5）42℃保温1小时。以RandomPrimers作为反转录引物时应先进行30℃，10分钟反应，然后再在42℃条件保温1小时。6）70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-StrandcDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用l～5μl。1.2.3.3、RT-PCR在Microtube管中加入以下反应体系：试剂使用量cDNA1μl3’引物0.5μl5’引物0.5μl2*SYB12μl13 第一部分：材料与方法趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用RNasefreedH2Oupto20μl混匀后快速离心一次，然后置于Eppendorf-RTPCR仪器中，根据需要设置程序。然后取RT-PCR产物8μl加5×LoadingBuffer2μl2%琼脂糖凝胶电泳120V100mA30min溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象观察条带是否单一呈现。1.2.4、ELISA实验方法：实验前准备：1）实验前一天先用ddH2O稀释10XCoatingbuffer成1X后,再把包被抗体(CCL20Ab:MAB360)稀释到5ug/ml,包被96孔板，4°C过夜；2）将待测标本（血清）从-80℃冰箱取出，室温下解冻；3）标准品稀释：取出标准品（rhCCL20:360-MP），稀释浓度为500pg/ml，然后分别稀释到6个EP管中，依次做倍比稀释，浓度依次为0250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8125pg/ml及0pg/ml待用；ELISA过程：1）将已包被好抗体的ELISA96孔板取出后，用排枪吸尽液体，然后用PBST洗涤96孔板，3X300ul，每次用吸水纸尽可能吸净孔中的液体。2）每孔加200ul1XELISADiluent溶液，室温封闭1小时。3）用PBST洗3X300ul,每次用吸水纸尽可能吸净孔中的液体。4）在标准组中加100ul/孔的1XELISADiluent，在实验组中加100ul/孔的待测样品（血清）。各孔分别记录好，时间最好控制在30分钟以内。5）盖上相应的封闭膜，在摇床上以适当的速度旋转室温孵育2小时。6）去掉封闭膜，弃去各组溶液，用PBST洗3X300ul,每次用吸水纸尽可能吸净孔中的液体。7）在各组中分别都加100ul检测抗体（CCL20Ab:BAF360），盖上相应的封闭膜，在摇床上以适当的速度旋转室温孵育1小时。8）重复步骤6。9）在各组中分别都加100ul/孔的HRP溶液，盖上相应的封闭膜，在摇床上以适当的速度旋转室温孵育30分钟。10）去掉封闭膜，弃去各组溶液，用PBST洗5X300ul,每次用吸水纸尽可能吸净孔中的液体。14 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第一部分：材料与方法11）在各组中分别都加100ul/孔的TMB底物显色液，盖上相应的封闭膜，在摇床上以适当的速度旋转室温孵育5-20分钟，此过程注意避光。12）在以上各组中分别加100ul的终止溶液，在5分钟内在酶标仪上测得波长为450nm的吸光度值(即OD值)。13）计算：根据标准品浓度及其对应的OD值作出标准曲线。以OD值为横坐标，以标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线：根据样品OD值可在标准曲线上算出对应的CCL20浓度值。1.2.5、病理切片相关实验方法：1.2.5.1、免疫组化:1）脱蜡和水化：脱蜡前应将已制备好的组织切片在65℃恒温箱中烘烤30分钟。a组织切片置于二甲苯中浸泡，3X10分钟.b无水乙醇中浸泡5分钟c95%乙醇中浸泡5分钟d85%乙醇中浸泡5分钟e75%乙醇中浸泡5分钟f50%乙醇中浸泡5分钟gddH2O中浸泡5分钟2）抗原修复：将pH6.0的10mM柠檬酸钠缓冲溶液放在容器内，然后置于水浴锅中加热至95°C-100°C，然后将将放在金属染色架上的玻片放在盛有柠檬酸钠缓冲溶液的容器内，加热10-15分钟。取出容器，在室温下自然冷却20-30分钟。3）PBS洗3X5分钟。4）抗原卒灭：3%H2O2(80%甲醇)滴加在组织上，避光室温静置10分钟。5）PBS洗3X5分钟。6）画圈：把切片周围的液体尽可能擦干，然后用免疫组化笔将组织圈起。7）封闭：滴加5%BSA或5%脱脂奶粉封闭组织，室温60分钟，甩去多余液体。8）一抗孵育：滴加一抗50μl,放在湿盒中4℃过夜。9）复温：37℃复温45分钟。10）PBS洗3X5分钟。15 第一部分：材料与方法趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用11）二抗孵育：滴加一抗50μl,放在湿盒中室温30分钟。12）PBS洗3X5分钟。13）显色：DAB显色5-10分钟，在显微镜下控制染色程度。14）PBS洗3X5分钟。15）复染：苏木精复染2分钟。16）自来水冲洗5分钟。17）分化：盐酸酒精分化30秒。18）自来水冲洗5分钟。19）返蓝：返蓝液返蓝5分钟。20）自来水冲洗5分钟。21）脱水、透明、封片、镜检。1.2.5.2、免疫荧光:1）脱蜡和水化：免疫组化步骤。2）通透：0.3%TritonX-100室温通透20分钟。3）PBS洗3X5分钟。4-9）：同免疫组化2-7）步骤。10）抗体孵育：根据抗体说明书所推荐的稀释比例稀释，滴抗50μl荧光抗体，避光在湿盒中4℃过夜。11）：复温：37℃复温45分钟。12）PBS洗3X5分钟。13）染核：滴加50μlDAPI，避光室温10分钟。14）PBS洗3X5分钟。15）封片、镜检。1.3、统计学分析方法：用GraphPadPrism5软件作图并处理实验数据，两样本均数的比较采用t检验，*P<0.05为显著差异。16 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第二部分：结果第二部分：结果一、CCL20在IgA肾病患者体内的表达水平（一）、初筛IgAN患者高表达的趋化因子我们在体外分别用IgAN患者以及健康人的血清刺激肾小球系膜细胞，然后通过大量的RT-PCR实验从众多CC及CXC家族的趋化因子中筛选出在患者体内高表达的分子。经过大批量的实验，最后汇总结果如下表（表2.1）所示：表2.1实时定量PCR筛选出高表达的趋化因子Table2.1ScreenChemkinesofhighexpressionlevelbyReal-timePCR从上表中可以看出，通过RT-PCR最终筛出CCL20和CXCL8的mRNA表达水平较正常组高。（二）、IgAN-IgA1与HMC孵育后CCL20的表达水平为了验证IgAN-IgA1与HMC孵育后，CCL20的表达水平是否也是升高的。我们就从IgAN患者以及健康人（HC）的血清中提取出IgA1蛋白，然后分别刺激肾小球系膜细胞，24小时后提取细胞RNA并逆转成cDNA最后通过RT-PCR检测两组17 第二部分：结果趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用CCL20的表达水平（图2.1A）。另外在同样时间段同样浓度的IgA1刺激HMC条件下，比较TGF-β的表达水平高。（图2.1B）。AB图2.1IgAN-IgA1刺激HMC后CCL20的表达水平。从图2.1可以看出:A图中，IgAN-IgA1组的CCL20表达水平明显高于HC-IgA1组；而在B组中两者之间的差别没有统计学意义。表明IgAN-IgA1刺激HMC后，CCL20的表达水平明显升高。（三）、CCL20在IgAN患者血清中的表达水平从蛋白水平来检测趋化因子CCL20的表达在IgAN患者血清是否也较高。运用ELISA方法我们分别检测了CCL20在HC和IgAN（图2.2A）以及不同程度的IgAN（图2.2B）的表达水平。AB图2.2CCL20在IgAN患者及不同类型IgAN患者血清中的表达水平。如上图所示：图2.2A的结果表明CCL20在IgAN患者血清组的表达水平也明显较健康对照组高；而从图2.2B中可以看出CCL20在HassII型IgAN患者的表达最高。18 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第二部分：结果以上结果表明：HMC在异常IgAN-IgA1的刺激下，可以促使肾小球系膜细胞分泌高水平的CCL20。二、CCL20优先趋化的细胞及CCR6+细胞在活化的T细胞中表达水平（一）、趋化实验通过趋化实验检测在正常情况下CCL20趋化哪种或哪几种外周血免疫细胞。从图2.3A-D中我们看到白细胞迁移的数量随着培养基中加入重组蛋白CCL20（rh-CCL20）的浓度的改变而改变，而rh-CCL20的最佳浓度为100ng/ml。且在同样条件下，加入100ng/ml的rh-CCL20组中B细胞和中性粒细胞的比例与空白对照组无+++明显差别（该图已省略）；而CD3T细胞和CCR6CD3T细胞在加入rh-CCL20组中的比例明显较空白组高（图2.3E-F），因此，我们可以认为在外周血免疫细胞中，CCL20主要（优先）趋化T细胞。ABCD19 第二部分：结果趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用EF图2.3趋化实验结果图2.3A-D在transwell小室底部加入的rh-CCL20的浓度依次为0、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml。图E-F分别是在transwell底部加入100ng/ml的rh-CCL20与空白对照组中趋化的CD3+、CD3+CCR6+细胞的比例。（二）、CCR6在活化T细胞上的表达在病理条件下，大多数的外周血T细胞在某些病原体的刺激下会大量活化。为了+验证CCR6是否在活化的T细胞中表达升高，我们从健康人外周血细胞分离出CD3T淋巴细胞，然后将细胞分为未活化组（control/notactive）和活化组（CD3+CD28/active），在后者中加入anti-CD3抗体(5ug/ml)和anti-CD28抗体(3ug/ml)将T细胞活化3天。然后将两组细胞染上anti-CD3、anti-CD44及anti-CCR6抗体进行流式细胞检测，结果如下图。A（all）20 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第二部分：结果B（up）C（down）DE21 第二部分：结果趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用FG图2.4活化的T细胞上CCR6的表达及其荧光强度图2.4A-C分别代表两组细胞中的所有细胞、抗体活化的大T细胞群及自身活化的小T细胞群；D-G是两组细胞中的三个细胞群之间的统计学比较。首先组间比较，从图中可以看出：虽然整体CD3+CD28/active组的+++CD3CD44CCR6细胞所占比例较control/notactive组低（图2.4D），但两组的平均+++荧光强度基本一致（图2.4E），这说明CD3+CD28/active组的CD3CD44CCR6的荧光强度较强。+++其次组内比较，从图2.4F-G可以看出，在两组中，无论是CD3CD44CCR6细+胞比例还是荧光强度都是前者明显高于后者。这说明：外部活化后的T细胞的CCR6的阳性率及荧光强度都明显增高。+++以上结果表明：在外部条件刺激的情况下，CD3CD44CCR6的比例及平均荧光强度都明显升高。（三）、CCR6在活化T细胞上的mRNA表达水平为了验证上述结果，我们再从上述两组细胞中分别提取RNA，通过实时定量PCR检测CCR6的mRNA表达水平（图2.5）。22 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第二部分：结果图2.5CCR6在活化T细胞上的mRNA表达水平结果显示：在活化T细胞组中的CCR6的mRNA表达水平明显高于未活化T细胞组。因此，作为CCL20唯一受体的CCR6在活化的T细胞上表达明显上调。三、IgAN患者的肾脏中检测CCL20及其受体CCR6（一）、免疫组化检测IgAN患者肾脏中CCL20的表达为了确认CCL20是否也在IgAN患者肾脏组织中表达，我们分别用IgAN患者肾脏病理切片与肾病综合征患者的病理组织做了免疫组化实验。从下图我们可以看出CCL20在前者的病理切片中表达而在后者几乎不表达。AB23 第二部分：结果趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用CD图2.6免疫组化结果图2.6A示IgAN患者IgA1的表达，B为其对照组；图C为IgAN患者CCL20的表达，B为其对照组。（二）、免疫荧光检测IgAN患者肾脏中CCR6的表达以前的研究显示,IgAN患者外周T细胞在抗原刺激后活化,被一些炎症因子和趋化因子趋化到肾脏组织并参与免疫炎症反应。同样，为了确认在IgAN患者体内是否+也存在有T细胞，尤其是CCR6T细胞，应用免疫荧光技术的方法在病理切片染++anti-CD3抗体和anti-CCR6抗体。正如下图所示，我们可以看出CD3CCR6细胞在+IgAN患者的病理切片中表达，相反，而在对照组中几乎不表达。这也说明了CCR6T细胞的确存在于IgAN患者肾脏组织中。AB24 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第二部分：结果CDEFGH图2.7免疫荧光结果图2.7A-D分别为IgAN患者组DAPI、FITC（anti-CD3抗体）、APC（anti-CCR6抗体）、Merge；E-F为对照组DAPI、FITC（anti-CD3抗体）、APC（anti-CCR6抗体）、Merge。25 第二部分：结果趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用四、在IgA肾病患者中，CCR6+T细胞主要是Th17细胞（一）、胞内因子染色+为了探究上述IgAN肾脏组织中的CD3T细胞究竟是哪类细胞，我们将活化的++++-CD3T细胞分为CD3CCR6和CD3CCR6两组，然后分别染anti-IL-4抗体、anti-IFN-γ抗体及anti-IL-17抗体进行胞内因子染色实验。这两组同时染上相应的抗体，然后进行流式细胞检测。+++-在下图中我们可以看到在CD3CCR6组中，IFN-γIL-4(Th1细胞)and-++-+IFN-γIL-17(Th17细胞)的比例明显高于CD3CCR6-组。相反，IFN-γIL-4(Th2细+++-胞)在CD3CCR6组的比例与CD3CCR6组相比明显较低。++结果表明：CD3CCR6的细胞主要是Th1细胞和Th17细胞。A26 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第二部分：结果BCD图2.8胞内因子染色结果图2.8A为胞内因子染色的流式分析图，B-D为Th1细胞、Th2细胞及Th17细胞+++-在CD3CCR6和CD3CCR6两组细胞群中所占比例。（二）、细胞因子表达谱我们进一步做了细胞因子表达谱实验来验证上述结果，用RT-PCR来检测由这三种细胞所分泌的细胞因子的表达水平。从图2.9中我们可以看到TNF-α、IFN-γ和IL-6、+++-IL-10、IL-17、IL-21、IL-23在CD3CCR6组的mRNA表达水平明显高于CD3CCR6组。前者主要是由Th1细胞分泌的细胞因子,而后者主要是Th17细胞分泌的。相反，+-主要由Th2细胞分泌的IL-2、IL-4、IL-5在CD3CCR6组明显较高。这个结果和胞内因子染色的结果是一致的。但是还有一点必须要提出的是，在4次重复实验中,只有IL-17的表达水平始终+++-在CD3CCR6组织显著地高于CD3CCR6组，而其他趋化因子并非都是如此。因此，++这些发现表明,CD3CCR6表达在Th1和Th17细胞,但主要Th17细胞。27 第二部分：结果趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用图2.9细胞因子表达谱实验结果（三）、免疫荧光验证为了在体内验证上述结果,我们又做了三个分子（CD3、IL-17和CCR6）免疫荧+++光共定位实验。结果表明,CD3IL-17CCR6细胞在IgAN患者病理切片中确实存在,而对照组则否。AB28 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第二部分：结果CDEFGH29 第二部分：结果趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用IJ图2.10免疫荧光结果图2.10A-E分别为IgAN患者组DAPI、FITC（anti-CD3抗体）、APC（anti-CCR6抗体）、PE（anti-IL-17抗体）、Merge；F-J为对照组DAPI、FITC（anti-CD3抗体）、APC（anti-CCR6抗体）、PE（anti-IL-17抗体）、Merge。综上所述,由异常糖基化的IgA1刺激肾小球系膜细胞分泌的趋化因子CCL20趋化Th17细胞到达IgAN肾脏组织，而Th17细胞通过分泌大量的炎症因子造成肾脏进一步损伤。所以，我们相信,本研究提供一个更全面的了解IgAN患者肾脏损伤机制的途径。30 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第三部分：讨论第三部分：讨论IgAN作为全球最常见的一种慢性肾小球肾炎，其发病机制到目前为止还不是十分明了，但越来越多的学者聚焦于IgAN的基础及临床方面研究。一些研究已证实某[5-6,45-47]些遗传因素也与IgAN的发展有关；还有一些研究也明确了异常糖基化的IgA[11-12,43]或IgA免疫复合物沉积作为一个重要的始动因素参与IgAN的发展相关，证实IgAN患者体内的糖基化缺陷的IgA1可诱发自身抗体，并易被肾小球系膜细胞所捕获导致相应细胞的异常增生和凋亡进一步损伤肾脏。近几年越来越多的人对免疫炎症[5-6,9,41]因子方面感兴趣，如CXCL1、MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8。IL-17，作为一个新的促炎因子，在多种疾病（前文已提到）中被广泛研究，但是有关IgAN在此方面的研究较少。在本文中，我们首次证实了无论是肾小球系膜细胞孵育从血清中分离的IgA1还是单测血清，都会发现IgAN患者组的趋化因子CCL20表达水平明显高于健康对照组。通过趋化实验，我们发现CCL20优先趋化T细胞。更重要的是我们的研究发现Th17和Th1细胞都表达CCR6，并且主要是前者。此外，我们还在IgAN患者肾脏+++病理切片中发现CD3IL-17CCR6细胞及CCL20，这些结果表明了在IgAN中CCL20/CCR6与Th17/IL-17确实在肾脏损伤的过程中起到了重要作用。CCL20是趋化因子家族中的重要成员，属于CC亚族，人CCL20是通过生物信息搜索DNA数据库和自动测序技术首次被发现的第一代趋化因子，其基因在染色体[24,25]2q33-37上，包括4个外显子和3个内含子。CCL20可在前炎症因子的刺激下其表达明显上调。一般来说，趋化因子需要通过与受体结合才能发挥效应，多数趋化因子与受体之间并非一一对应关系，而是存在交叉现象，但CCL20与其受体CCR6之间具有相对的特异性，二者是目前发现的唯一对应关系，CCL20与受体CCR6相结合二者结合后可介导相应的免疫应答。[19-22,40]WilliamsIR和其他学者研究发现CCL20在炎症条件下可以被诱导产生。[13,41-43]此外，KimMJ等人证实从IgAN患者血清中分离的IgA1可以活化肾小球系膜细胞并诱导系膜细胞异常增生和凋亡，并且还可以分泌大量的促炎症因子和炎症调节因子。一些研究显示,这些介质在肾脏病的发生和进展中扮演了重要角色。但是到目31 第三部分：讨论趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用前为止，很少有学者就CCL20与IgAN的关系以及CCL20在IgAN发展中究竟起到何种作用以及做出深入的研究。通过本文的研究，我们发现从IgAN患者血清中的异常IgA1可以刺激肾小球系膜细胞产生CCL20，更为重要的是我们还发现CCL20是促进IgAN发生发展的一个重要因素。[30]辅助T细胞通过分泌细胞因子在调节多种细胞的免疫功能方面具有重要作用。+如前所述，根据各个亚群所分泌的细胞因子及其效应功能可以将辅助T细胞（CD4Tcells）分为四个主要的亚群，即Th1细胞、Th2细胞、调节T细胞(Tregs)和Th17细胞。而Th1细胞主要合成分泌IFN-γ、IL-2；Th2细胞合成IL-4、IL-5、IL-6和IL-13；而Thl7细胞主要合成IL-17。近几年，由活化辅助T细胞（主要是Th17细胞）产生的IL-17被认为是一个重[26,33,44]要的促炎细胞因子。许多学者发现这种分泌IL-17的Th17细胞也存在于肾脏[33,34][33-36]炎症中，并且在肾脏疾病的免疫应答方面Th17细胞起着重要的作用。另外，越来越多的研究证明在一些疾病中趋化因子受体CCR6表达也在Th17细胞表面上[31-32,37-39]++。这些研究让我们假定在IgAN患者体内这些CD3CCR6细胞(图2.7)也可能是产生IL-17的Th17细胞。所以，我们进一步用胞内因子染色实验和细胞因子表++达谱实验验证，结果显示CD3CCR6表达在Th1细胞和Th17细胞上，但主要是Th17细胞。尽管Th17也分泌IL-21、IL-22和IL-6，但更主要的是产生大量的IL-17。研究发现,参与Th17细胞的合成和分化包括多种因素：IL-6可以上调IL-21的表达，然后IL-6和IL-21上调IL-23受体，最后IL-23上调Th17细胞并影响其功能导致其致病。IL-6和IL-23单独或联合作用诱导Th17细胞产生大量的IL-17。此外，IL-23不仅在体内诱导Th17细胞产生，分化和维持生长的过程中起着重要作用，还可以在体外提[50-51]高Th17细胞活化，增生和生存时间并促使IL-17的大量产生。这与我们的细胞因子表达谱实验结果基本一致，我们发现细胞因子IL-6、IL-10、IL-21、IL-23和+IL-17在CCR6T细胞组表达水平明显升高，而这些CCR6+T细胞主要是Th17细胞。[52-54]NistalaK等人认为在正常情况下Th17细胞和Treg细胞在促炎和抑炎方面保持动态平衡。Th17细胞通过分泌像IL-17等炎症因子诱导机体产生免疫应答和促炎反应，而Treg细胞通过胞内转录因子Foxp3提高机体的免疫耐受能力,并保护宿主[28]免受炎性损伤。一旦这种平衡被打破，将会导致疾病发生。最近，有研究者通过建32 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用第三部分：讨论立IgAN小鼠以及α链球菌感染后的IgAN小鼠模型，实验表明这两组小鼠的肾脏Treg细胞较正常对照组降低，但Th17细胞较正常对照组增加。这说明这种免疫失衡的确存在IgAN小鼠体内。但是至于这种免疫失衡是否在存在IgAN病人体内以及这是否也是导致IgAN进展的一个重要原因，目前还不是十分明确。此外，有研究指出Th17细胞和Th1细胞相互协调共同应答免疫炎症反应，一[62][29]起调节炎症的发生和发展。UlfPanzer等人在新月体形肾小球肾炎小鼠模型体内也证实了该现象：Th17细胞介导肾脏损伤免疫反应的早期阶段，而Th1细胞是肾脏[61]疾病免疫反应后期阶段的重要介质。最近，HünemörderS在实验性自身免疫性肾小球肾炎(EAG)模型实验中也发现Th1和Th17细胞是促进肾脏新月体形成以及进展成坏死性/新月体形肾小球肾炎的关键因素。我们的结果与上述的研究结果基本一致，通过胞内因子染色和细胞因子表达谱实验结果发现IgAN患者IFN-γ(Th1)和IL-17+(Th17)细胞中的表达都较高，尤其是CCR6T细胞。但与上述研究有区别的是我们发现IL-17(Th17)比例明显高于IFN-γ(Th1)比例，这就提示了在IgAN过程中Th17细胞可能起到更重要的作用。一般来说,趋化因子和趋化因子受体是调节T细胞的激活和迁移的关键因素。在肾脏炎症中，这些分子的重要性通过病人资料分析和实验模型的研究一直被人们所关[56,60]注。而我们的研究也聚焦于趋化因子配体CCL20及其受体CCR6上，检测这对因子是否可能在IgAN的T细胞免疫反应中发挥作用。结果显示CCR6主要表达在Th17细胞上，并且还发现IL-17以及Th17细胞相关的细胞因子IL-21、IL-23和IL-6+-的mRNA表达水平在CCR6T细胞上明显高于CCR6细胞的表达水平。因此，我们可以假设认为IgAN患者肾小球系膜细胞产生并分泌到血清中的CCL20可以趋化迁移外周血Th17细胞到肾脏组织中去。正如所假设的那样，我们IgAN肾病病理标本++中我们发现了CCR6IL-17T细胞，这也证实了CCL20/CCR6轴在人肾脏Th17细胞浸润方面的特殊意义。当然，我们的实验设计中也存在一定的局限性：首先，我们不能排除其他的趋化因子或受体(如IL-8)也可能参与这个过程。其次，由于实验对象的限制，我们没有进行有关抑制和（或）阻断CCL20/CCR6轴和Th17/IL-17轴以减少（降低）免疫应答反应的实验。因此，还有待于我们进一步建立相关动物模型以及研究这些分子间的相互调节机制以获得更精确和可靠的实验证据。这也是我们进一步的研究方向之一。33 第三部分：讨论趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用综上所述，本研究初步证实了CCL20/CCR6和Th17/IL-17轴在IgAN发病机制中的作用和相互关系。我们研究显示从IgAN病人中分离的异常IgA1可以刺激肾小+球系膜细胞分泌趋化因子CCL20，而CCL20可以趋化CCR6T细胞，尤其是Th17细胞到损伤的肾脏组织。此外，这些Th17细胞分泌大量的促炎症因子和细胞因子，尤其是IL-17。这些因子在肾脏固有细胞如肾小球系膜细胞表面起到重要作用，其中包括诱导一系列炎症反应，导致IgAN进一步发展和恶化。因此，我们的研究在IgAN发病机制方面提供了一个新的重要的线索，即通过靶向拮抗和（或阻断）CCL20/CCR6和Th17/IL-17在防止IgAN的恶化甚至治疗方面提供一种潜在的方法。34 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用结论结论在IgAN患者血清、IgAN患者血清刺激肾小球系膜细胞、IgAN-IgA1刺激肾小球系膜细胞的情况下，CCL20的表达水平均较正常对照组高。在外周血免疫细胞中，CCL20优先趋化T细胞；CCR6在活化的T细胞上表达明显上调。CD3+CCR6+细胞表达在Th1和Th17细胞,但主要Th17细胞。CCL20及CD3+IL-17+CCR6+细胞在IgAN患者病理切片中确实存在。综上所述,我们认为IgAN患者肾脏损伤的机制之一为:异常糖基化的IgA1刺激肾小球系膜细胞分泌的趋化因子CCL20通过募集Th17细胞到并肾脏分泌大量炎症因子造成肾脏进一步的损伤。35 参考文献趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用参考文献[1]BergerJ,HinglaisN.IntercapillarydepositsofIgA-IgG[J].Journald'UrologieetdeNephrologie,1968,74(9):694.[2]LiLS,LiuZH.EpidemiologicdataofrenaldiseasesfromasingleunitinChina:analysisbasedon13,519renalbiopsies[J].Kidneyinternational,2004,66(3):920-923.[3]LemleyKV,LafayetteRA,DerbyG,etal.PredictionofearlyprogressioninrecentlydiagnosedIgAnephropathy[J].NephrologyDialysisTransplantation,2008,23(1):213-222.[4]StrippoliGFM,MaioneA,SchenaFP,etal.IgAnephropathy:adiseaseinsearchofalarge-scaleclinicaltrialtoreliablyinformpractice[J].AmericanJournalofKidneyDiseases,2009,53(1):5-8.[5]ZhuL,ZhangQ,ShiS,etal.SynergisticEffectofMesangialCell-InducedCXCL1andTGF-beta1inPromotingPodocyteLossinIgANephropathy[J].PloSone,2013,8(8):e73425.[6]DuqueN,Gomez-GuerreroC,EgidoJ.InteractionofIgAwithFcalphareceptorsofhumanmesangialcellsactivatestranscriptionfactornuclearfactor-kappaBandinducesexpressionandsynthesisofmonocytechemoattractantprotein-1,IL-8,andIFN-inducibleprotein10[J].TheJournalofImmunology,1997,159(7):3474-3482[7]LaiKN,TangSCW,GuhJY,etal.PolymericIgA1frompatientswithIgAnephropathyupregulatestransforminggrowthfactor-βsynthesisandsignaltransductioninhumanmesangialcellsviatherenin-angiotensinsystem[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrology,2003,14(12):3127-3137.[8]LeungJCK,TangSCW,ChanLYY,etal.PolymericIgAincreasesthesynthesisofmacrophagemigrationinhibitoryfactorbyhumanmesangialcellsinIgAnephropathy[J].NephrologyDialysisTransplantation,2003,18(1):36-45.[9]LeungJCK,TangSCW,ChanLYY,etal.SynthesisofTNF-αbymesangialcellsculturedwithpolymericanionicIgA—roleofMAPKandNF-κB[J].NephrologyDialysisTransplantation,2008,23(1):72-81.[10]TamKY,LeungJCK,ChanLYY,etal.MacromolecularIgA1takenfrompatients36 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综述趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用综述IgA肾病发病机制的研究新进展张小攀综述卢国元审阅【摘要】IgA肾病（IgAN）是全球最常见的一种导致慢性肾脏损伤的原发性肾小球肾炎。IgAN是一种由遗传、免疫、环境等多因素共同作用而形成的疾病，通过对IgAN发病机制的研究进而为该疾病的治疗提供新的线索。【关键词】IgA肾病发病机制IgA1IgA肾病（IgAN）是1968年由法国学者Berger首先描述和命名的，又称为Berger[1]病。其特征是肾活检免疫病理显示IgA或以IgA为主的免疫球蛋白及补体成分在肾小球系膜区呈弥漫性颗粒状或团块状沉积，有时伴有毛细血管襻沉积而引起一系列临床及病理改变。而IgA肾病也是我国常见的一种慢性肾小球肾炎，约占原发性肾小球[2,3]肾炎的45％。IgA肾病可发生于任何年龄，以儿童和青年人最常见。IgAN患者的临床表现多样化，从单纯血尿、蛋白尿到肾病综合征及伴有高血压、肾功能不全等。几乎所有患者均有血尿，其中绝大多数表现为无症状持续镜下血尿，40％有反复发作[4]性肉眼血尿。而病理组织改变如肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化、炎症细胞浸润，肾小球和间质细胞增殖活动性均与疾病的进展有关。以前的观点认为IgAN预后良好，现已明确该疾病呈进展性，最终20%-40%的患者在20年内发展为终末期肾[5,14]病（end-stagerenaldisease,ERSD）。但截止到目前，医学界对于IgA肾病的病因和发病机制的认识和研究还不是十分明确，本文就最近有关IgA肾病的发病机制研究作一综述。一、免疫病理机制:1、IgA1分子的特性在正常人血清中IgA的含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的10%～20％。IgA是由粘膜和免疫器官分泌的，大多数IgA是由粘膜表面产生而直接释放，其中只42 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用综述有一小部分进入血清中。血清IgA是由骨髓产生，90%以单体的形式存在，这也是循环中IgA的主要形式。IgA有IgA1和IgA2两个亚类。IgA1主要存在于血清中，约占血清中IgA的85%，α1链分子量为56kD；IgA2主要存在于外分泌液中，少部分以血清型IgA存在，约占血清中IgA的15%，α2链缺乏铰链区，分子量为52kD。血清中的IgA除单体形式外还有由J链共价相连的二聚体或三聚体以及多聚体形式。IgA1分子在重链恒定区1（CH1）和恒定区2（CH2）结构域之间比IgA2分子多一个可转动的铰链区，该区是一较短但含高度重复序列的多个氨基酸肽段，富含脯氨酸残基，5个丝氨酸和4个苏氨酸残基，后两种残基可作为O-半乳糖基化的位点，在9个位点中只有5~6个与聚糖相连。O-半乳糖链以丝氨酸和（或）苏氨酸连接N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)为基本结构。这个结构再经过半乳糖（Gal）以β1,3键与GalNAc连接，构成Gal-β1,3GalNAc而被延长，在此基础上，唾液酸（SialicAcid）以α2,3[6,7]键和（或）α2,6键与其结合形成更长的糖链。因此IgA1分子中可以出现不同的O-半乳糖链，来改变IgA1的空间构象以及携带电荷情况，进一步影响IgA1分子的大小与其他蛋白质的作用。铰链区O-半乳糖基化在保护铰链区免受蛋白水解酶消化[7]及维持分子的空间结构中起重要作用。2、异常糖基化IgA1目前认为IgA1分子的糖基化异常可能是IgA肾病发生发展的关键因素。IgA1是循环免疫复合物中唯一由O-糖基化和N-糖基化位点的免疫球蛋白。O-型糖基化是指糖基与肽链上的丝氨酸或苏氨酸残基相连；N-型糖基化是指糖基与肽链上的天冬酰胺[8]残基相连。有研究证明IgAN患者血清IgA1分子存在O-型糖基化异常,其表现为α2,6[9]唾液酸与β1,3半乳糖缺陷。Renfrow等指出IgAl结构异常主要表现在其铰链区核心β1,3半乳糖基转移酶的活性下降所致O糖链末端半乳糖缺失，从而引起其O-型糖[10]基化异常。而近年Suzuki等研究表明IgAN患者血清中β1,3半乳糖基转移酶的活性明显降低，并且α2,6唾液酸转移酶的活性明显升高。这些酶活性的异常导致其结构的改变，从而使其更易于自身聚合转变成自身抗原，与IgG抗体共同形成抗原抗体[11,12]复合物，沉积在肾小球系膜。3、IgA1与肾小球系膜细胞曾有实验证实，异常糖基化的IgA1比正常的IgA1能更有效的与肾小球系膜细胞（MC）结合。分别从IgAN患者血清提取含有IgA1的免疫复合物与从健康人血清提43 综述趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用[13]取的IgA1后，观察二者与MC的结合能力时，发现前者作用更强。这就提示IgAN患者体内IgA1循环免疫复合物与MC通过更相结合。并且还发现异常糖基化的IgA1与细胞外基质的纤维粘复杂的途径连蛋白和IV型胶原蛋白有更强的亲和力，这种作用可能会协同促进IgA1循环免疫复合物在MC的沉积。近来有学者在体外实验证实从IgAN患者分离的IgA-IgG免疫复合物中所含的异常糖基化的IgA1可以刺激MC[14]的增殖。另一方面，虽然沉积在MC的IgA1只是一些小分子IgA或者为IgA片段，其致炎症作用比较弱。但IgAN患者血清中糖基化异常的IgA1的循环免疫复合物与MC结合后引起MC激活，MC在受到炎症损伤后可以产生并能表达许多炎症因子与炎症介质的受体。另外MC上的IgA1Fc受体使肾小球炎症进一步放大形成类似“瀑布样”的炎症级联放大反应是导致IgAN炎症损伤的关键，因此MC在此炎症损伤过程中扮演了很重要的角色。加之大量的炎症物质还可以影响肾小球血流量，造成细胞外基质(ECM)沉积，进而影响肾小球功能,导致肾损伤。4、炎症因子、细胞因子的影响IgAN的一个重要组织病理学特征是炎性细胞如多形核白细胞和巨噬细胞在间质和肾小球区的浸润。而巨噬细胞是细胞新月体的重要成分，同时巨噬细胞又分泌干扰素（TNF-α）、白介素6（IL-6）等细胞因子，可刺激MC的增值，促进中性粒细胞及巨噬细胞粘附和成纤维细胞分泌而导致肾纤维化。研究发现IgA免疫复合物不仅可以使MC增殖，还可以诱使细胞内Ca2+水平升[15,16]高，磷脂酶C1-r1激活，三磷酸肌醇和酪氨酸激酶生成增加。IgA沉积到MC后还可上调细胞外基质成分，转化生长因子β（TGF-β），肾素血管紧张素的分泌，同时系膜细胞分泌血小板活化因子（PAF），白介素（IL-1β），IL-6，IL-8,TNF-α，趋化因子干扰素诱导蛋白10（IP-10），巨噬细胞游走抑制因子（MIF）及单核细胞趋[17-21]化蛋白1（MCP-1）。就MCP-1而言，其属于趋化因子CC亚家族，正常肾组织[21][22]的含量较少。但Kim等在体外研究发现在IgAN患者中MCP-1的mRNA水平明显高于对照组，并且与IgA1的刺激水平呈剂量依赖性。还发现从IgAN患者所分离的IgA1刺激MC后，可通过脾脏酪氨酸激酶(SYK)促进炎症因子MCP-1的产生，还可以引起溶酶体和氧自由基的释放，直接参与肾脏的损伤。该细胞因子又以自分泌或旁分泌的方式作用于肾小球固有细胞，使系膜增殖和合成过量的细胞外基质，也是引起肾小球损伤的机制之一。44 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用综述[23-26]还有研究表明在IgAN中，某些趋化因子及其受体的mRNA表达水平是升高的，如CCL20与其受体CCR6、CXCL12与其受体CXCR4等，这些趋化因子的表达上调，可通过趋化外周的炎症细胞聚集到肾脏并分泌更多的炎症因子进而加重肾脏的炎症损伤程度。另外，还有关于血管紧张素（Ang）、神经肽Y（NPY）、T细胞受体(TCR)、子宫珠蛋白（UG）血管内皮生长因子等也与IgAN发生发展相关的研究。5、IgA1分子的清除[27Tomana]等用动物实验证明正常IgA及其他糖蛋白的代谢主要在肝脏中。肝细胞表面存在去唾液酸糖蛋白受体（ASG-PR），此受体是一种植物凝集素，能特异性识别并结合O-连接糖末端的半乳糖基，从而清除循环中的IgA1分子。IgA1分子通过ASG-PR在肝细胞内代谢并分泌至胆汁中排出。但IgAN患者由于糖基化异常IgA1分子的O-连接糖末端的半乳糖基缺失而使受体不能识别、摄取和清除。尽管半乳糖缺失后暴露的GalNAc也能识别，但因IgA1易于IgG结合形成复合物，从而一方面使肝细胞对IgA1和IgA1-IgG免疫复合物的清除受阻，另一方面又通过受体介导的方式沉积在肾脏，致使IgA1的水平增加，而且这种改变还使单体IgA1易于聚合为[11,28]pIgA1。再者，IgA1的清除还可以通过IgAFc受体（CD89）,此受体在单核细胞，中性粒细胞和嗜酸性细胞等均有表达，它可以与单体，多聚体IgA1和IgA2结合，介导IgA内吞和分解代谢。在IgAN患者中CD89的表达明显下调，同时IgA和CD89的结合力也比正常人低，从而大大影响IgA的清除，也可使血清中的IgA水平增加。同[29]时还有Launay等学者对转基因小鼠的研究发现，IgA与CD89形成CD89-IgA可溶性复合物，使IgA大量沉积在系膜区。提示CD89-IgA复合物可能是致病性大分子IgA。还有研究证实转铁蛋白受体（TfR/CD71）存在于MC上的IgA受体，在IgAN患者[30]中，CD71在MC过度表达，引起pIgA的沉积及蓄积，导致系膜清除障碍。另外，研究发现IgA受体还有,多聚免疫球蛋白受体（pIgR）,甘露糖结合蛋白（MR）等可以通过吞噬，粘膜屏障等方式清除病原体，毒素和有害糖蛋白，而在IgAN中这些IgA受体出现异常而导致糖基化异常的IgA分子结合和清除障碍。此外，并非所有系膜IgA沉积都会引起肾小球炎症,因为在正常情况下MC也是具有清除IgA的功能。故只有当IgA的沉积速率超过了它的清除能力和（或）沉积的[29]IgA影响了系膜细胞的清除能力时才可能诱发IgAN。45 综述趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用二、遗传机制1、相关易感基因[31]基因连锁分析研究：2000年Gharavi等将收集的经肾活检确诊的30个IgAN患者家系通过全基因组连锁分析后将IgAN易感基因定位于6q22—23。约有60％的患者家系与此位点连锁，并发现其遗传方式呈常染色体显性遗传伴不完全外显的方式。而一些患者似与3号染色体短臂（3p23~24）也相关，这也说明IgAN有一定的家族遗传性。而后还有一些研究发现染色体6p，4q26~31,17q12~22和2q36位点也可能与IgAN的发生有关，但该结论在不同人群中的可重复性欠佳。基因多态性研究：在澳大利亚和法国人中的研究最先报道了IgAN和HLABw35[32]相关，在日本人的研究中则报道IgAN患者与HLA—DR4显著相关；Yofioka等研究发现载脂蛋白E表型2（ApoE2）基因与IgAN的病理进展密切相关；Tanaka等[33]研究发现FcγRIIa-131R等位基因和FcγRIIIa-176V/V基因型都是IgA肾病发生发展的重要危险因素；另外还有学者报道IL-4与IFN-r的基因多态性与IgAN的进展有关[34[35]]。Stephen等研究发现DQB1的等位基因（DQB1*0301）频率增高和原发性IgAN发生相关；此外患者血管紧张素转换酶DD基因型与IgAN的进展明显相关，其被认为是降低患者存活率一个独立危险因素。2、IgA1分子糖基化有关的酶及其调控基因国外学者研究IgAN患者及其一级亲属的血清异常糖基化IgA1水平，和对照组相比发现IgAN患者及其亲属的血清异常糖基化IgA1水平均升高，所以认为异常糖[36]基化IgA1具有一定的家族聚集性和遗传性。故针对IgA1分子糖基化有关的酶及其调控基因的研究也受到很多专家学者的重视。而就IgA1分子铰链区β1,3半乳糖缺乏的研究而言主要集中在β1,3半乳糖转移酶基因（C1GALT1）及其分子伴侣Cosmc的编码基因（C1GALT1C1）上。研究发现C1GALT1基因多态性与IgAN的遗传易感性相关。结果显示IgAN患者外周血B淋巴细胞中参与O-糖基化合成核心C1GALT1的功能显著低于对照组，而且其伴侣蛋白Comsc基因的mRNA表达水平显著低于正[10,37][38]常对照和非IgAN患者。而Li的研究结果与其一致，都表明IgAN患者体内Cosmc的编码基因C1GALTC1的mRNA水平较正常人低。[39]而最近意大利学者Serino等通过基因芯片检测IgAN和健康人的外周血单个核细胞（PBMC）发现MiR-148b及其靶基因C1GALT1在IgAN中起到重要作用。并且46 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用综述体外研究发现miR-148b的上调与IgA1糖基化以及分泌异常糖基化IgA1水平直接相[40]关。Imai等在研究与诱导IgAN有关的mircro-RNA中发现，miR418b通过调节[41]C1β3GALT1的表达来影响IgA1。Tan等通过高通量测序技术来评估IgAN和正常肾脏组织全基因组miRNA表达,在与对照组比较中IgAN有11个上调基因和74个下调基因。总之，到目前为止，在IgAN中发现了很多与IgA1的分泌调节以及有关酶的相关调控基因，但通过基因来治疗IgAN尚有待进一步研究。三、其他因素1、感染因素从临床上看，IgA患者中有相当一部分病人是在粘膜感染后，尤其是呼吸道与消化道粘膜感染后发生肉眼或者镜下血尿，从而提示IgAN与粘膜免疫异常密切相关。研究发现IgAN的发病常与扁桃体反复发炎有关，此时人体血液中以IgA为主的免疫球蛋白含量增多。增多的IgA与相应的抗原结合后，按照上述方式形成免疫复合物并随着血液循环沉积到肾小球系膜区引发慢性肾小球炎性反应及其他肾脏组织损伤，肾小球通透性增加，患者呈血尿、蛋白尿等表现。但对中、重度IgAN病人肾脏组织的炎性反应加剧，不但可大量释放炎性因子，还可分泌合成其他肾毒性物质，不断损伤肾脏组织，形成恶性循环，最终导致肾脏组织纤维化。此时扁桃体炎症对疾病本身的发展起到推波助澜的作用。另外研究发现很多微生物的感染都可以诱发或加重IgAN，[42][43]如Fofi等报道发现结核杆菌感染是导致IgAN的一个重要原因；Kusano等第一次证实了腭扁桃体存在有球形幽门螺杆菌（HP）。通过HP与扁桃体的单个核细胞共培养后，IgAN组较正常对照组的淋巴细胞明显增殖，且IgA1水平明显升高。后来还有人采用免疫组织化学的方法证实IgAN组患者腭扁桃体Hp感染的阳性率较健康对照组显著增高。故认为HP可能是IgAN的致病性抗原之一。最近还有湘雅医院周巧玲专家发现溶血性链球菌也可通过CCL20对Th-17细胞[38]的反应来加重IgAN的肾脏损伤。还有些学者研究发现在原发性IgAN与伴有HBV感染的IgAN患者穿刺组织中发现，后者的C4d在系膜区较前者沉积的范围及程度[44,45]更甚，故认为IgAN的部分发病原因可能HBV-Ag有关。2、足细胞及肾小管越来越多的学者注意到IgAN发病及进展可能更取决于肾小球足细胞的损伤及程度，并且是决定病变进展及转归的关键因素。肾小球足细胞是肾小球基底膜的最外层47 综述趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用的滤过屏障，以前就有动物模型研究显示足细胞的数量减少可导致蛋白尿和肾小球硬[46]化，而足细胞损伤的程度也与IgAN肾小球硬化一致。Lemley等发现IgAN患者足细胞的缺失程度和病情进展有密切关系，足细胞数量减少程度和肾功能减退及肾小球[47]硬化明显相关，是病情加重的征兆。Macconi等证实IgAN系膜区增生及沉淀物的局部膨胀与足细胞数量的减少呈明显相关。而近来研究表明肾小球系膜细胞产生的CXCL1和TGF-β1二者协同作用是致使IgAN的足细胞功能异常、数量减少、基膜损[48]伤的一个重要因素。同时，也有很多研究表明各种肾小球肾炎包括IgAN在内的患者肾小管间隙有单核细胞等炎症细胞浸润，同时由于各种促纤维生长因子，蛋白水解酶以及由单核细胞激活的氧自由基的共同作用下可导致肾小管结构的破坏和细胞外基质的沉积，可导致肾小管损害和肾功能不全。3、其他因素一些临床表现如蛋白尿，高血压等不仅是IgAN过程中的表现，还是影响IgAN的进展和预后的重要因素。有研究表明，尿蛋白量和持续时间与IgAN的病程进展有[49,50][51]关，蛋白尿是促进IgAN进展以及影响预后的独立危险因素。另外还有学者通过回顾性分析得出高血压与肾小球性蛋白尿是ESRD进展的重要危险因素的结论，[46]认为持续检测血压，蛋白尿和肾功能可以较好地预测IgAN的进展。而Myllymaki[52]等观察报道血尿酸进行性升高与IgA肾病的组织病理学损伤指数密切相关，这也揭示了一个新的IgAN不良预后的危险因子。四、总结:综上所述，IgAN的发病机制非常复杂，是免疫、遗传、环境等多因素多环节共同作用的结果。其中IgAN发病机制的始动因素是异常糖基化的IgAl生成过多，而IgAN发生的中心环节是IgA免疫复合物形成。异常糖基化IgA1与MC上的受体结合，引起肾小球局部炎症因子以及细胞因子的活化，激活系膜细胞和补体系统，通过系膜细胞、足细胞和小管间质的相互作用，引起足细胞和肾小管损伤以及肾小球硬化，最终使肾功能受损发展成ESRD。尽管目前在基础和临床多方面做了很多研究，但其真正的发病机制尚未明确。IgAN的发病机制还需要进一步深入的探究，明确其发病机制是更好地指导疾病防预、临床治疗、改善预后的关键。48 趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用综述五、参考文献:1.BergerJ,HinglaisN.IntercapillarydepositsofIgA-IgG[J].Journald'UrologieetdeNephrologie,1968,74(9):694.2.LiLS,LiuZH.EpidemiologicdataofrenaldiseasesfromasingleunitinChina:analysisbasedon13,519renalbiopsies[J].Kidneyinternational,2004,66(3):920-923.3.LemleyKV,LafayetteRA,DerbyG,etal.PredictionofearlyprogressioninrecentlydiagnosedIgAnephropathy[J].NephrologyDialysisTransplantation,2008,23(1):213-222.4.deFIJTERJW,DAHAMR.PathogenesisofIgAnephropathy[J].Nephrology,1997,3(1):3-12.5.DonadioJV,GrandeJP.IgAnephropathy[J].NewEnglandJournalofMedicine,2002,347(10):738-748.6.IwasakiH,ZhangY,TachibanaK,etal.InitiationofO-GlycanSynthesisinIgA1HingeRegionIsDeterminedbyaSingleEnzyme,UDP-N-Acetyl-α-d-galactosamine:PolypeptideN-Acetylgalactosaminyltransferase2[J].JournalofBiologicalChemistry,2003,278(8):5613-5621.7.PutnamFW,LiuYS,LowTL.PrimarystructureofahumanIgA1immunoglobulin.IV.StreptococcalIgA1protease,digestion,FabandFcfragments,andthecompleteaminoacidsequenceofthealpha1heavychain[J].JournalofBiologicalChemistry,1979,254(8):2865-2874.8.XuLX,ZhaoMH.AberrantlyglycosylatedserumIgA1arecloselyassociatedwithpathologicphenotypesofIgAnephropathy[J].Kidneyinternational,2005,68(1):167-172.9.RenfrowMB,CooperHJ,TomanaM,etal.DeterminationofaberrantO-glycosylationintheIgA1hingeregionbyelectroncapturedissociationFouriertransform-ioncyclotronresonancemassspectrometry[J].JournalofBiologicalChemistry,2005,280(19):19136-19145.10.SuzukiH,MoldoveanuZ,HallS,etal.IgA1-secretingcelllinesfrompatientswithIgAnephropathyproduceaberrantlyglycosylatedIgA1[J].JournalofClinicalInvestigation,2008,118(2):629-639.11.SuzukiH,FanR,ZhangZ,etal.AberrantlyglycosylatedIgA1inIgAnephropathypatientsisrecognizedbyIgGantibodieswithrestrictedheterogeneity[J].TheJournal49 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趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用名词缩写表名词缩写表缩写全称IgAImmunoglobulinAIgANIgANephropathyESRDEndStageRenalDiseaseHMCHumanMesangialCellsILInterleukinThThelpercellsELISAEnzyme-LinkedImmunoSorbentAssayRPMIRoswellParkMemorialInstituteDMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumEDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcidDMSODimethylsulfoxideRT-PCRReverseTranscription-PolymeraseChainReactionSDSSodiumDodecylSulfatePAGEPolyacrylamideGelelectrophoresisPBSPhosphateBufferSolutionddH2ODouble-distilledwaterPBMCPeripheralBloodMononuclearCellsrh-CCL20RecombinantHumanpropteinHRPHorseradishperoxidaseTMB3,3’,5,5’-TetramethylbenzidinePMAPhorbolMyristateAcetateBSAAlbuminfrombovineserumBFABrefeldin-ATNF-αTumorNecrosisFactoralphaTGF-βTransformingGrowthFactorbetaIFN-γInterferonγGAPDHGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase55 致谢趋化因子CCL20与Th17细胞在IgA肾病发病机制中的相互作用致谢行文至此，我的这篇论文已接近尾声。岁月如流，三年的硕士生活在这个季节即将划上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始。三年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下，走得辛苦却也收获颇丰，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静，一种特别的感恩之情油然而生。衷心感谢我的导师卢国元教授的谆谆教导，让我懂得了如何成为一名真正的临床医生和科学工作者，让我学习了很多做人的道理，这将使我终生受益。同时也感谢您无微不至的照顾和亲切的陪伴让我没有虚度光阴，度过宝贵的三年时光。感谢生我亲爱的爸爸妈妈，一直鼓励我的亲朋好友，是您们，一如既往的支持我鼓励我，给我源源不断的动力继续前行。感谢实验老师张进平教授对我实验上的指导和实验员夏菲老师及研究院的其他老师对我实验上提供的便利，同时还要感谢实验室的其他的各位师兄弟师姐妹们给我的莫大帮助。正是由于你们的帮助才使我的毕业课题顺利进行，谢谢你们！！感谢乔青、沈蕾、李明、沙文刚、周玲主任以及胡坤、徐德宇、沈艳萍、杨静主治医师等人在临床学习过程中予以的指导和帮助，他们精湛的医术、渊博的知识与和善的性格永远是我学习的榜样！感谢傅威师姐、周丽君师姐、李媛师姐、张光彩同学、龙银华同学、卢慧娟同学以及孙洁琼师妹、许巍师弟、阎梦潇师妹等，感谢你们在我学习和生活上予以的帮助，谢谢！今后，无论是在学习还是工作中，我都会把这三年来所获得的帮助和知识化为前进的动力和经验，争取在新的环境和挑战中，不断迈向新台阶。2016年4月于苏州大学56 顏大学（专业学位）Ｈ＾ｌ苏州大学研究生院统一印制Ｉ■
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