狂犬病病毒G蛋白的原核表达和免疫原性分析

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分类号．：Ｓ８５２６５学校代码：１０７１２ＵＤＣ：６３６．０９研究生学号：２０１４ｔ）５０６幻丨密级：公开、？品灶衣林令枚夫学２０１７届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文狂犬病病毒Ｇ蛋白的原核表达和免疫原性分析学科专业预防兽医学研究方向兽医免疫学研究生王攀指导教师张改平院士完成时间２０１７年５月中国陕西杨凌 Classificationcode:S852.65Universitycode:10712UDC:636.09Postgraduatenumber:2014050657Confidentialitylevel:public___ThesisforMaster’sDegreeNorthwestA&FUniversityin2017PROKARYOTICEXPRESSIONANDIMMUNOGENICITYANALYSISOFRABIESGPROTEINMajor:PreventiveVeterinaryMedicineResearchfield:VeterinaryImmunologyNameofPostgraduate:WangPanAdviser:Prof.ZhangGaipingDateofsubmission:May,2017YanglingShaanxiChina 狂犬病病毒G蛋白的原核表达和免疫原性分析摘要狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（RabiesVirus,RABV）引起的，是世界上最致命的传染病之一，死亡率接近100%。狂犬病毒是狂犬病毒属（Lyssavirusgenus），弹状病毒科（Rhabdoviridaefamily）的一种单股负链RNA病毒，可引起人类，家畜及野生动物急性脑膜炎而导致死亡，并可在大多数哺乳动物中广泛传播。狂犬病主要是通过被狂犬病毒感染的动物的撕咬、抓挠受伤而传播。在中国，狂犬病的主要传播来源是被RABV感染的狗和猫等。当前，对于狂犬病感染或发病后的治疗方法尚未实现，因而及时接种狂犬病疫苗可在很大程度上有效防制狂犬病。目前我国动物用狂犬病疫苗主要是传统灭活疫苗和弱毒疫苗，弱毒疫苗存在返毒的危险，而灭活疫苗则存在灭活不彻底的风险。基因工程亚单位疫苗由于不含有强毒的感染性组分，所以不必进行灭活措施，是新型疫苗研究的重要发展方向。G（glycoprotein）蛋白是狂犬病毒的五种组成蛋白之一，由524个氨基酸组成，蛋白分子质量约为62KD。G蛋白是狂犬病毒中唯一糖基化的，以及唯一可诱导机体产生中和抗体的结构蛋白。因此，G蛋白既是狂犬病毒中最有效的保护性抗原，同时也是研究基因工程亚单位疫苗的首选抗原，是狂犬病基因工程亚单位疫苗研究的热点。本课题研究中，利用狂犬病病毒CTN-1V10株为模板，以生物工程合成的方法合成编码G蛋白的基因片段G。将该片段插入大肠杆菌pET-28a载体中，构建重组质粒，构建完成后，将重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）表达目的蛋白，SDS-PAGE电泳及Westernblot结果表明，重组蛋白在大肠杆菌系统中实现了大量可溶性表达，在此基础上，进一步对该蛋白的反应原性和免疫原性进行了研究与分析。首先以狂犬病病毒CTN-1V10株（Genebank：AEV43285）为模板，设计相应的特异性引物，以生物工程合成的方法合成编码G蛋白的基因片段G，片段大小为1884bp。PCR结果表明，合成的目的片段长度正确。随后经转化，连接等步骤将目的片段与大肠杆菌pET-28a载体构建重组质粒。然后对重组蛋白进行了诱导表达及其条件优化。将重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞JM109，经菌液PCR鉴定阳性的菌株命名为pET-G。提取重组成功的质粒，将质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，经菌液PCR，酶切，测序鉴定，三种鉴定均成功后，方可用于后续的蛋白表达试验中。分别从温度、诱导时间梯度、诱导剂三个方面入手，对G蛋白的诱导表达的条件进行逐步优化。SDS-PAGE电泳检测，以及Westernblot鉴定结果表明，在20°C，IPTG浓度为0.2mM，诱导时长为12h时，重组蛋白的可溶性表达量最高。且蛋白可与抗RABV单克隆抗体发生特异性反应，具有良好的反应原性。 接下来进行了重组蛋白的纯化条件摸索。利用Ni填料亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对重组G蛋白进行纯化，以获得相对纯度较高的目的蛋白，并检测蛋白活性，为后续实验做准备。最后进行了小鼠免疫试验及G蛋白的免疫原性分析。将30只6周龄的BALB/c小鼠按照免疫原的区别分为6组，分别为Trisbuffer组（NC），商品灭活苗免疫组（PC），G-BI-Tris组，G-BI-ISA组，G-BB-Tris组，G-BB-ISA组。其中BI，BB为免疫增强剂，ISA为佐剂。按照剪耳编号，剪尾，采血，背部皮下多点注射的顺序免疫小鼠，每只小鼠注射100μL。28天后进行二免，至56天为止，期间每周采血一次，获得血清后-40°C冻存备用。56天后取28天和56天的血清用狂犬病病毒中和抗体ELISA检测试剂盒进行抗体检测。检测结果表明除阴性对照组外，其余各组一免后均产生抗体，且直至二免后28天为止抗体量一直呈上升水平。这说明，本实验中的重组G蛋白不仅具有良好的反应原性，而且具有相应的的免疫原性，为制备狂犬病病毒基因工程亚单位疫苗奠定了实验基础。关键词：狂犬病病毒;G蛋白;蛋白可溶性表达;亚单位疫苗 PROKARYOTICEXPRESSIONANDIMMUNOGENICITYANALYSISOFRABIESGPROTEINABSTRACTRabiesisoneofthemostlethalinfectiousdiseasesintheworld,withamortalityapproaching100%.Rabiesiscausedbyrabiesvirus(RABV).Rabiesvirus(RABV)isthetypespeciesofthegenusLyssavirus,withintheRhabdoviridaefamily.TheRhabdoviridaearenegativesensesingle-strandedRNAviruseswithadistinctivebullet-shapestructure.RABVcancausesacuteencephalitisamonghuman,livestockandwildlifeinmammals.Andhumansaretypicallyexposedthroughananimalbiteorscratch.InfecteddogsandcatsarethemainvectoroftransmissionamongChina.Sofar,thereisnomethodoftreatmenttocurerabies.However,vaccinationishighlyeffectiveatpreventingthediseasewhenadministeredbeforeorshortlyafterexposuretovirus.RabiesvaccineinChinamostlyaretraditionalattenuatedvaccineandinactivatedvaccine.Butattenuatedvaccineexistspotentialsafetyhazardandmassvaccinationofinactivatedvaccineisoneofthemostcost-effectivewaystoproduct.Therefore,theresearchanddevelopmentofnewkindsofsafeandeffectivevaccinesisthetrendoffuture.Amongthem,thegeneticengineeringsubunitvaccinedoesnotcontainvirusinfectiouscomponentsmakingitspathogencityriskverylow,andthereisnoneedtobeinactivated,thus,thiskindofvaccineisavitaldevelopmentdirectionofvaccineresearch.Gprotein(glycoprotein)isastructuralproteinofrabiesvirus.MatureGproteincontains505aminoacidresidues,andthemolecularweightisabout62kD.Gproteinistheonlyproteinonthesurfaceofrabiesvirus.Meanwhile,itisalsotheonlyproteinwhichcanbemodifiedbyglycosylationandtheonlyonewhichcaninducethebodytoproducevirusneutralizingantibody(VNA).Therefore,GproteinisnotonlyoneofthemosteffectiveprotectiveantigensofRABV,butalsothefirstchoiceofantigensforresearchongeneticengineeringsubunitvaccine,thus,ithasanextensiveprospectinclinicalapplications.HereinGproteincodinggenessectionGwassuccessfullysynthesizedwithbiologicalengineeringsynthesismethod,usingtherabiesvirusCTN-1V10strainasatemplate.TherecombinantplasmidwasconstructedbycloningtheGgeneintopET-28avectortoconstructrecombinantplasmid,andthentherecombinantexpressionvectorwastransformedintoE.coliBL21（DE3） competentcellsforproteinexpression.SDS-PAGEelectrophoresisandWesternblotresultsshowthathighexpressionlevelofsolublerecombinantproteinwasachievedinE.colisystem.Onthebasisofthis,thereactionactivityandimmunogenicityoftheproteinwerestudiedandanalyzed.Atfirst,weconstructofrecombinantplasmids.HereinGproteincodinggenessectionGwassuccessfullysynthesizedwithbiologicalengineeringsynthesismethod,usingtherabiesvirusCTN-1V10strainasatemplate.AccordingtothesequenceofGgenepublishedinGenBank(AEV43285),primersweredesignedandsynthesized.PCRresultsshowedthatthesizeoftheobjectivegenefragmentwas1884bp.TherecombinantplasmidwasconstructedbycloningtheGgeneintoE.colipET-28avector,afterthatthisplasmidwasinsertedintoE.coliBL21(DE3)competentcells.Thenweinducedtoexpressionofrecombinantproteinandconditionsoptimization.TherecombinantplasmidwastransformedintoE.coliJM109competentcellsandthenidentifiedbyPCRverification，thepositivestrainwasnamedpET-G.AndplasmidswereextractedfrompET-Gpostivestrain.TheplasmidsweretransformedintoE.coliBL21(DE3)competentcellsforproteinexpression.TheexpressionconditionsofGproteinwereoptimizedinthreeaspects:temperature,inductiontimeandIPTGconcentration.Highestproteinexpressionlevelwasachievedwheninducedwith0.2mmol/LIPTGat20°Cfor12h.TheresultsofSDS-PAGEandWesternblotshowedthatRABVGproteinwasexpressedasasolublerecombinantprotein,anditcanberecognizedbyanti-RABVmonoclonalantibody.Furthermorewedotheexplorationofrecombinantproteinpurificationmethods.Inordertoobtainrelativelyhighpurityoftargetprotein,andprepareforproteinactivitydetectionandotherfollowingstudies,wehavescreeneddifferentmethodsofpurification,suchasNiaffinitychromatography,ionexchangechromatography,gelfiltrationchromatography.Atlast，wedothemiceimmunizationandtheimmunogenicityanalysisofGprotein.30female6weekoldBALB/cmiceweredividedinto6groupsaccordingtothedifferenttreatmentofimmunogen:Trisbuffergroup(NC),commodityinactivatedvaccinegroup(PC),G-BI-Trisgroup,G-BI-ISAgroup,G-BB-Trisgroup,G-BB-ISAgroup.TheBI,BBareimmunopotentiators,andtheISAisadjuvant.100μLofdifferentimmunogenwasinjectedsubcutaneouslyinbackforeachmouse.Secondaryimmunizationwasperformedonday28postprimaryimmunization.Bloodsampleswerecollectedonceaweektill56dayspostprimaryimmunization.ImmunizedserawerecollectedfortheexaminationbyusingrabiesneutralizingantibodyELISAdetectionkitforneutralizingantibodydetection.Testresults showthatexceptthenegativecontrolgroup,everygrouphasbeenprovokedneutralizingantibodies,andtheneutralizingantibodyresponsehaveboostedaftersecondaryimmunization(56d).TheseresultssuggestthattherecombinantproteinGmaintainsnotonlygoodreactionactivity,butalsocertainimmunogenicity.Therefore,thisresearchofGhaslaidthefoundationofrabiesvirusgeneticengineeringsubunitvaccinedevelopment.KEYWORDS:RABV,Gprotein;solubleproteinexpression,subunitvaccine 目录文献综述..................................................................................................................................13第一章狂犬病的相关研究进展...........................................................................................131.1狂犬病及其防控研究进展....................................................................................131.1.1狂犬病的特征及其流行态势....................................................................131.1.2.RABV的基本形态、构成和物理化学特性.............................................141.1.3RABV的复制过程.................................................................................171.1.4RABV的致病机制.....................................................................................181.1.5狂犬病的防控策略及其疫苗的研究进展................................................191.2大肠杆菌表达系统概述.........................................................................................211.2.1大肠杆菌表达系统的优势........................................................................211.2.2大肠杆菌表达载体的特点，分类，及选择.............................................21试验研究..................................................................................................................................23第二章G基因的合成与重组表达载体的构建....................................................................232.1实验材料................................................................................................................232.1.1主要试剂....................................................................................................232.1.2主要设备与仪器........................................................................................232.2实验方法及实验步骤.............................................................................................232.2.1目的基因G的引物设计...........................................................................232.2.2目的片段G的扩增...................................................................................242.2.3PCR产物的回收与纯化............................................................................242.2.4重组表达载体的构建.................................................................................242.2.5重组质粒的鉴定.........................................................................................262.3实验结果.................................................................................................................262.3.1G基因的扩增结果.....................................................................................262.3.2重组质粒的酶切鉴定结果........................................................................272.3.3重组表达载体构建结果.............................................................................272.3.4分析与讨论................................................................................................28第三章G蛋白的诱导表达与纯化........................................................................................193.1G蛋白的诱导表达与纯化..................................................................................193.1.1实验材料....................................................................................................193.1.2主要试剂3.1.3主要设备与仪器.........................................................................................213.2实验方法及实验步骤.............................................................................................213.2.1重组G蛋白的诱导表达及蛋白免疫印迹法的鉴定...............................21 3.2.2重组蛋白的诱导表达条件优化................................................................223.2.3Westernblot检测重组蛋白G的反应原性...............................................223.2.4Ni填料纯化目的蛋白试验........................................................................223.2.5离子交换层析填料的筛选........................................................................233.2.6离子交换层析法纯化目的蛋白试验........................................................243.2.7凝胶过滤层析法纯化目的蛋白................................................................253.3实验结果.................................................................................................................253.3.1重组蛋白G的诱导表达及可溶性分析结果............................................253.3.2重组蛋白G的诱导表达条件优化结果...................................................273.3.3Westernblot鉴定重组蛋白的反应原性....................................................283.3.4目的蛋白与Ni填料的结合试验结果......................................................283.3.5Ni填料纯化蛋白的试验结果....................................................................293.3.6离子交换层析填料的筛选结果................................................................303.3.7离子交换层析纯化目的蛋白的试验结果................................................333.3.8凝胶过滤层析法纯化目的蛋白的结果....................................................343.4分析与讨论.............................................................................................................35第四章疫苗试制及其免疫效果评价......................................................................................374.1实验材料与试剂....................................................................................................374.2主要设备与仪器.....................................................................................................374.3实验方法及实验步骤............................................................................................374.3.1免疫原的制备............................................................................................374.3.2免疫分组及免疫程序................................................................................374.3.3免疫血清的检测........................................................................................384.3.4免疫血清检测结果的统计学分析............................................................384.4实验结果................................................................................................................384.4.1血清ELISA试剂盒检测结果（OD450值）............................................384.5分析与讨论............................................................................................................39结论..........................................................................................................................................41参考文献..................................................................................................................................43缩略词......................................................................................................................................49附录..........................................................................................................................................51致谢..........................................................................................................................................55作者简介..................................................................................................................................57 文献综述第一章狂犬病的相关研究进展1.1狂犬病及其防控研究进展1.1.1狂犬病的特征及其流行态势狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabiesvirus,RABV）引起的，是最致命的传染病之一，死亡率接近100%(Fontanaetal.2015)。狂犬病是人类历史上最可怕的人兽均可患病的传染性疾病之一。它最早出现在古代中国和古代希腊的历史中，并且都有相关记载（Steele,J.H.&Fernandez,P.J.1991）。Rabies这个英文单词同样是源自于是希腊语当中的词汇，其含义为狂躁的，暴怒的。根据WHO的报导，RABV能感染世界上几乎所有的温血动物，然而人类感染RABV发病，致死等则多数归咎于犬类，其比例可以达到90%以上(Listed1992)。狂犬病的传播主要是通过被狂犬病毒感染的动物的撕咬、抓挠受伤而传播，在中国，狂犬病的主要传播来源是被RABV感染的狗和猫等(Davisetal.2013)。其他罕见的感染途径也有报道，例如存在大量蝙蝠的洞穴中的含狂犬病毒的气溶胶暴露感染以及实验室中狂犬病毒的暴露感染(Winkleretal.1973)。狂犬病可引起人类、家畜及野生动物急性脑膜炎而导致死亡(Lietal.2010)。它的典型临床症状主要是神经性症状，前期可能出现的临床症状多为怕水、惊风、惧光、抽搐、痉挛，惊恐，吞咽受限，呼吸困难等，所以又名恐水症。并且还会发生渐进性瘫痪。后期则反而会比较安静，甚至出现昏迷，生命体征衰退等症状。而这种沉郁性狂犬病的发生往往具有隐蔽性，容易导致误诊，甚至可能导致漏报(Zhuetal.2012)。狂犬病每年大约夺取59000人的生命(Hampsonetal.2015)，但是由于漏报等导致的实际死亡人数要远远超过这个数字，而这当中最多的则是亚洲和非洲的15岁以下少年儿童(Knobeletal.2005)，大部分的这些死亡事件发生在资源匮乏的国家，那里基础设施的缺乏，疫情不能及时发现和报道，缺乏暴露后预防措施（PEP），以及无处不在的家畜和野生动物宿主，使得彻底消灭狂犬病几乎不大可能。此外，尽管相比其他人类感染疾病是罕见的，如流感，但被患有狂犬病的动物咬后预后很差:目前还没有有效的治疗方法可以挽救出现临床症状的狂犬病患者的生命(Davisetal.2015)。使用暴露后预防措施（PEP）处理伤口，可以有效地预防狂犬病临床症状的发生(Bothetal.2012b)。因而及时接种相关的各类狂犬病疫苗可在很大程度上有效防制狂犬病(李露等.2014)。矛盾的是，狂犬病疫苗是在一个多世纪前就开发出来的，但绝大多数人类的感染病例都没有接种疫苗。因此，根据当前相对可靠的研究进展，我们需要在未来建立相应的针对性补救措施：包括一个更加协调的病毒分类法，加强分散的实验室监管，重点病原体的发现和分类，加强对犬类的风险评估，疫苗和相关生物制品的实际产量和需求关系等，人类的防制策略是将预防做到最大化，并且将不1 必要的预防措施减到最少，而且需要一个长期的，全球性的，切实可行的计划来支持狂犬病的预防，控制，消除的顺利进行(Rupprechtetal.2017)。1.1.2.RABV的基本形态、构成和物理化学特性RABV是狂犬病毒属（Lyssavirusgenus）、弹状病毒科（Rhabdoviridaefamily）的单股负链RNA病毒（LiXetal.2010），不同的狂犬病毒属病毒的祖先可能是来自于非洲，并且在数百万年的时间里与蝙蝠共同进化，所以后者能够成为RABV的最终宿主。由于其广泛的分布，充分的繁殖，使得RABV成为狂犬病毒属最成功的一种病毒(Rupprechtetal.2017)。目前已知14个狂犬病相关的狂犬病毒属病毒,其中包括Mokola病毒，欧洲蝙蝠狂犬病毒1型和2型，澳大利亚蝙蝠狂犬病毒(Dietzgenetal.2012)，这些狂犬病毒由于其在地域上受到的限制，造成人类狂犬病死亡人数较少，但当人类侵占它们特有的领地和栖息地则可能会出现更加显著的影响，我们当前所获取的大多数的关于这些病毒的知识来自与对蝙蝠生态学的研究(Marstonetal.2013)。弹状病毒的病毒粒子，与其他负链RNA病毒一样，是由一个高度稳定，构成复杂的基因组RNA和核蛋白组成的,包裹在一个来自宿主细胞膜的脂质囊膜当中(Dietzgen2012)，RABV粒子与大多数弹状病毒科病毒类似，整体呈子弹状，一头椭圆，一头较平，有时可能出现轻微内凹，有些病毒粒子的底部会有一尾状物。长约120～200nm，直径大约75nm，RABV表面有大约1072～1900个突起，每个突起长约8～10nm，由G蛋白组成，构成较规则，负染样品中出现六边形、蜂房样结构。病毒内部含有螺旋形的核衣壳，这些核衣壳由单股RNA及N、P、M、G、L五种结构蛋白组成，顺序为3'N-P-M-G-L-5'(Carnielietal.2010;Matsumotoetal.2011;McElhinneyetal.2011)，如下图所示，病毒粒子由双层的脂类外包膜、病毒遗传物质、核蛋白、转录大蛋白、病毒基质蛋白、磷蛋白以及糖蛋白这五种结构蛋白组成。图1-1狂犬病病毒粒子结构模式图（A）(Schnelletal.2009)和电镜图片(Xueetal.2014)（B）Figure1-1Schematicrepresentation(A)andelectronmicroscopy(B)oftherabiesvirion.RABV为典型的神经亲嗜性病毒，其中核蛋白封装了病毒RNA的基因组，形成了2 一个与核RNA相互紧紧盘绕的一个结合体，叫做核糖核蛋白（ribonucleoprotein,RNP），RNP被浓缩后，与L蛋白和P蛋白一起,形成了螺旋形核衣壳(NC)(Rahmehetal.2010)，P蛋白是一个聚合酶L的非催化型辅因子。M蛋白围绕着螺旋形核衣壳，形成NC和病毒囊膜之间的桥梁(Lenardetal.1990;Mebatsionetal.1999b)，G蛋白是一个三聚体结构，它与M蛋白在细胞质一侧相互作用，是唯一暴露在弹状病毒的囊膜表面的的蛋白质(Zakowskietal.1980)，RABV基因组的前端为一个先导区域，即3’端，它的长度比较固定，组成部分为58个核苷酸，在所有狂犬病毒属的病毒中，第1-9个核苷酸相同的。引导RNA（leaderRNA,leRNA）是在转录中最早产生的RNA，没有3’端的帽子和5’端的尾巴结构，而且不参与翻译。RABV基因组的末端是其5’端，这个末端不参与转录环节，约由70个核苷酸组成，该段序列是多变的，无论在长度和顺序上。RABV基因组3’末端序列和5’末端序列是反向互补的(Conzelmannetal.1994)。图1-2狂犬病病毒基因组示意图(Schnelletal.2009)Figure1-2.Schematicdiagramofrabiesvirusgenome.RABV病毒粒子中，糖和蛋白质类约占77%，含脂肪类物质约20%，核酸约占3%。这其中，糖类主要以糖蛋白，糖结合脂类为主，脂类则包含磷酸化酯、糖类和脂类结合物，以及极性脂肪。病毒粒子的外表面的膜是由糖类、脂质组成。病毒核酸的分子质量3为460-3500KDa，在Cscl中密度是1.66g/cm，沉降系数为45S。RABV耐热性差，56℃加热30min，60℃加热10min，或者100℃处理2min，均能使RABV失活。被感染的机体大脑内的病毒在25℃左右出现组织自身溶解现象，其中的RABV约在7天左右以后彻底失活，4℃冷藏条件下可存活14-21天，50%甘油保存、-30℃条件下若干年后仍可以有活性，病毒感染滴度水平相对较稳定，下降幅度甚至不会超过一个对数。RABV在pH7.2~8.0的环境内活性较为稳定，酸性条件下容易导致引起G蛋白解构失活(Gaudinetal.1993)，病毒在该环境下亦容易失活。同时，狂犬病毒对甲醛、醋酸、乙醚、三氯甲烷都敏感，可灭活病毒。当被犬、猫抓伤或咬伤后，立即使用碘、肥皂水、离子型和非离子型去污剂等处理伤口是暴露后预防的最有效的办法(殷相平2011)。3 1.1.2.1狂犬病病毒的主要结构蛋白RABV编码5种结构蛋白，由3’-5’段依次编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）、RNA依赖的RNA聚合酶（L）结构蛋白(Johnsonetal.2010)。RNP，P蛋白，L蛋白是是构成RABV病毒粒子的核心元件，与其同时L蛋白和P蛋白也是病毒复制，转录不可或缺的具有活性的蛋白。病毒核衣壳是由150个L蛋白、950个P蛋白，以及病毒RNA组耦合而成，是一个连续的约30-50个卷曲的螺旋结构，同时有转录，复制的功能，可以自主完成转录及复制(Itoetal.2001)。G蛋白是唯一的细胞受体的配体。许多弹状病毒表达更多的具有多样化的功能蛋白质，但是RABV基因组仅由以上五个部分组成(Dietzgenetal.2012)。图1-3狂犬病病毒结构蛋白示意图(Maramoroschetal.2009)Figure1-3.Schematicrepresentationofrabiesvirusstructuralprotein.其中，RABVG蛋白存在于病毒囊膜内外两侧，形成跨膜结构，在RABV表面形成一些纤突（spikes）(Coulonetal.1983;Delagneauetal.1981;Wunneretal.1984)，RABV的糖蛋白在病毒颗粒囊膜上，它是以同源的三聚体形式装配的，这其中囊括了病毒的主要抗原决定簇(Gaudinetal.1992)。G蛋白是装配RABV病毒表面的组成部分，它具有高度的免疫原性，并且可以触发中和抗体的产生(Perrinetal.1985)。研究表明，该蛋白质的抗原区域有8个抗原结合簇，这8个表位依次是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、a和G1(Nagarajaetal.2008)。其中，除VI和G1抗原结合簇外，其他抗原结合簇在RABV灭活后仍然可被检测到。G蛋白具有与细胞表面受体结合的功能，此外，RABV对于神经组织的嗜性也是由G蛋白决定的，其氮端是由19个氨基酸组成的一段多肽，发挥信4 号肽的作用，这一段多肽在病毒转录的过程中被切去。因此，成熟的G蛋白中不含该区域(Lentzetal.1982)。成熟的G蛋白含有524个氨基酸，其分子质量约为65kDa。G蛋白含3个病毒中和抗原决定簇，它们主要是在病毒吸附宿主细胞时发挥作用，通过与细胞表面受体的互作而加快RABV的吸附。G蛋白能激活特异性辅助性T细胞（helperTcells,Th）和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxiclymphocyte,CTL）。研究证实，G蛋白上存在T细胞线性和空间依赖性表位(Dietzscholdetal.2008)。研究表明，病毒第333位的精氨酸一旦被天冬酰胺、异亮氨酸、或谷氨酸等替代后，可导致病毒毒力显著降低(殷相平2011)。RABV的一个明显特征就是它的神经嗜性，有报道记录，在狂犬病毒G蛋白有可以与乙酰胆碱受体互作的区域，位于其蛋白序列的第109～203位，RABV由于和乙酰胆碱受体的互作而渗入神经系统从而使机体感染(Gastkaetal.1996;Lafayetal.1991)。G蛋白结构的稳定性在很大程度上取决于其所处环境的酸碱度，当环境PH值在某一条件下时，G蛋白结构可发生可逆性变化。当pH大于7时，G蛋白的状态接近天然状态，在此条件下，其天然构象可以和某些单抗或者膜识别受体结合，反之，则不能与之结合(Gaudinetal.1995)。RABV的结构蛋白本身对于RABV发病机制的作用远远超出了他们的自身的结构功能，例如，RABVP蛋白功能远不止作为一个聚合酶辅助因子，比如它还可以扰乱宿主干扰素(IFN)介导的抗病毒防御(Riederetal.2011)。因此，现如今大多数的备选重组疫苗，都是根据G蛋白利用不同的表达系统表达的产物(Korakaetal.2014)。综上可知，G蛋白可有效诱发机体的免疫反应，尤其是细胞免疫反应。这个特性是后续针对该蛋白质开展相关研究和新型亚单位疫苗研发的重要理论依据。1.1.3RABV的复制过程病毒粒子的G蛋白与宿主细胞受体互相作用,触发病毒的内吞作用(Blancetal.2005;Etessamietal.2000)。核内体催化的低pH值G蛋白介导的病毒囊膜和内体膜之间的融合，将核衣壳释放到细胞质(Blancetal.2005)。功能性的病毒聚合酶，是一个L蛋白和P蛋白的复合体，利用释放的RNP作为转录的复制周期的模板(Ivanovetal.2011)。弹状病毒mRNA的表达水平，以及它们编码的蛋白质，从基因组的3’端到5’端逐步循序减少。因此，N蛋白的表达量是最丰富的，其次是P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白。这种递减是由于分解的RNP的聚合酶在转录时发出了终止信号，从而需要聚合酶重新启动下游基因的转录(Banerjeeetal.1992;Finkeetal.2000)。病毒的N蛋白一旦开始产生，将作为病毒开始复制的一个临界值，而对于RABV，这个过程被认为是由M蛋白的水平来调控的(Finkeetal.2003;Liuetal.2004)。针对复制，病毒聚合酶采取了更先进的模式转换，它制造出了全长，正链RNA反基因组(Abrahametal.1976;Finkeetal.2003)。以此为媒介，然后作为模板制造出全长的负链基因组。最后，弹状病毒出芽机制起始于5 G蛋白插入宿主细胞膜(Mebatsionetal.1996;Okumuraetal.2011)。M蛋白在初期的核衣壳与胞质中G蛋白尾部相互作用,触发病毒从宿主细胞的膜上出芽(Mebatsionetal.1999a;Okumuraetal.2011)。1.1.4RABV的致病机制狂犬病主要通过被RABV感染动物的撕咬、抓挠受伤而感染。人类的暴露感染主要归咎于未经免疫的疯狗的抓咬，尤其是在发展中国家的农村地区(Hampsonetal.2008)。狂犬病是由RABV感染所致，RABV的特性即神经亲嗜性，首先在动物机体受到外伤后，它会经由周围神经感染机体，RABV通过轴突上行，逆向转运，进入背根神经节后进行复制，RABV在实验室培育的鼠神经细胞的轴浆内运输速度可达0.5-1毫米/小时。一旦RABV进入中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS），它通过脊髓移动到脑部的速度非常迅速，与此同时病毒增殖量也出现激增，最终导致病患几乎100%的死于急性脑炎(齐瑛琳2015)。研究者通常在实验室环境下用实验动物模拟RABV的感染，在模拟感染研究策略中，关键区别在于模拟感染的位点是中枢神经系统还是外周神经系统，直接模拟感染中枢神经系统通常是通过鼻内或颅内接种活毒的方式来进行，这种策略在概念上把RABV在中枢神经系统复制和传播与大多数天然感染的外周神经入侵机制区分开来。然而在大多数情况下，RABV的神经入侵，神经嗜性，神经致病性在体内都是相互有关联的，模拟天然RABV感染的实验动物模型通常使用肌内注射(Schnelletal.2005)。RABV从外周神经系统侵入机体，那么病毒必须进入中枢神经系统才能导致疾病的传播。然而，在哺乳动物中枢神经系统有几个解剖和生物化学障碍，将其与机体的其余部相互隔开。其中研究最广泛的天然防御屏障是血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)，神经血管上皮细胞是一种具有高度选择性渗透屏障，它构成了上皮细胞间紧密的结点。除了BBB之外，中枢神经系统还缺乏淋巴回流，MHC的表达量低，免疫抑制分子的水平上调，这些共同导致相对于身体的其他部位处于一种免疫隔离的状态(O’Donnelletal.2010)。这个概念早先被称作免疫特权，现在已经被修正，因为在中枢神经系统可以发生免疫反应。因此从技术上讲，大脑并不享有该特权。反之，免疫反应的本质的细节，即来自掌控诱导CNS抗病毒反应的信号产生的过程，是从根本上不同于那些外周器官的。有几种机制可以使病毒克服限制神经入侵的障碍。对于RABV，沿着轴突逆行运输到外周神经系统是入侵的主要机制，也是α疱疹病毒等病毒的一个感染路径(Beareretal.2000;Fredericksen2014;TalKramer2013)，这条路径允许病毒绕过BBB，这将限制血源性的感染途径。病毒的这条路径的相关机制则是通过嗅觉受体来实现的，它是唯一的直接暴露于外部环境的CNS细胞，因此我们推测它可能与CNS的感染相关(Johnson1998)。通过鼻内感染在RABV的研究中被广泛应用,假使有足够浓度的神经感染性病毒气溶胶的话，蝙蝠寄居的洞穴里也可能通过空气传播，这种情况在自然环境中并不多见(Johnson6 1998)。最常见的CNS病毒机制是一个血源性的路径，病毒颗粒通过穿透BBB的神经血管上皮或CNS渗透性的淋巴细胞、单核细胞(O’Donnelletal.2010)而感染机体。虽然在实验室已经证明了银毛蝙蝠RABV(SHBRV)是从外周神经到大脑是通过血液传播的，但这一现象并不被认为是RABV的天然感染途径，因为在犬中并未观察到该路径的传播(Preussetal.2009)。在自然感染过程中，RABV通常首先感染神经肌肉节点（nervousmusclejunction，NMJ）。对此最早的证据是，当研究RABV蛋白质相互作用时发现的乙酰胆碱（nAchR），使得乙酰胆碱成为第一个已知的RABV细胞受体(限制中枢神经系统的受体是后来发现的)(Lentzetal.1982)。乙酰胆碱广泛分布在外周神经系统，位于突触后膜的NMJ上(Schnelletal.2010)。乙酰胆碱与RABV的相互作用很快就通过免疫荧光法和电子显微镜证实了，实验显示了互作部位的确是神经肌肉节点(Burrageetal.1985)。后续报道证实，乙酰胆碱其实存在于突触后运动终板,而且并不参与感觉神经元的信号传输(Ugolini2011)。在感染后期,RABV是通过运动神经感染还是通过感觉神经通路感染，这之间的区别变得无关紧要，在病毒侵染的中枢神经和器官以及运动和感觉神经元内，RABV均能被检测到(Ugolini2011)。1.1.5狂犬病的防控策略及其疫苗的研究进展根据前文所述，由于狂犬病发病后出现的不可逆转的急性致死性脑炎，以及近乎100%的死亡率，说明该病目前无法在临床发病后治愈，因而导致全球范围内，尤其是亚非等发展中国家每年数万人的死亡。WHO推荐的PEP法是目前推广比较多的一种预防法。所谓PEP法分为两种，即暴露前预防法（pre-exposureprophylactic，PEP）和暴露后预防法（post-exposureprophylactic，PEP）。并且推荐使用暴露后预防法迅速处理患者，可有效阻止临床症状的发生(Bothetal.2012a)。PEP包括三个步骤：迅速的清理伤口，注射狂犬病疫苗以及接种狂犬病免疫球蛋白，如人免疫球蛋白，马免疫球蛋白(Lietal.2015)。人类和动物的抗狂犬病病毒疫苗的可行性及有效控制，是根据大量的野生动物的免疫程序，通常是家养食肉动物的强制性免疫程序而实施的。对于人来说，尤其是去未控制流行地区的旅行者以及可能暴露于病毒感染动物的从业人员，暴露前免疫是推荐做法。尽管市售疫苗有一定的效果，但仍属于疫苗中较昂贵的一类，并且免疫效果相对较差，因为要获得免疫保护需要用高剂量抗原数次接种。通常需要三倍剂量来保护性免疫，加强免疫对于确保获得长期的免疫保护是必须的(Korakaetal.2014)。因此，尽管PEP法可以保护疫苗接受者免于狂犬病临床症状的发作和死亡，但疫苗需正确接种。（即在暴露后24-48小时以内）(WHO.2010)。按照狂犬病疫苗的属性，分为传统疫苗：如灭活苗，弱毒苗，新型疫苗：如基因工程亚单位疫苗。自从巴斯德于1884年发明了第一代脑组织灭活苗之后，狂犬病疫苗已经发展了一百多年，国内外的动物用狂犬疫苗也发展了数代。从早期的神经组织灭活苗，7 到后来的鸡胚弱化减毒苗，细胞培养灭活苗，细胞减毒苗，反向遗传工程苗，DNA苗，活载体疫苗，以及新型的基因工程亚单位疫苗等(殷相平2011)。神经组织灭活疫苗是有羊的脑组织或神经组织经石碳酸等将组织灭活后所制备而成的，实践证明该疫苗对于犬类是有效的，但因其接种后会引起的严重的神经系统副作用，如今已基本停止生产该疫苗(俞永新2009)。用来制备减毒活疫苗的弱毒株主要有Flury株、EAR株、SAD株。由于疫苗中所含的弱化的活毒能够免疫接种之后，在被接种动物体内复制、装配，因而小剂量接种即可获得相应的免疫保护，所以成本相对于灭活苗较低，而且该疫苗可以通过口服免疫(Blacketal.1980;Schumacheretal.1993)。但弱毒苗的安全隐患十分之大，其病毒很有可能在机体内返毒，从而引发够更严重的后果(Eshetal.1982;Whetstoneetal.1984)，所以当前主流疫苗仍然是灭活苗。此外，弱毒苗禁止用于幼年动物、猫以及带毒的动物。鸡胚弱化减毒疫苗是指利用RABV感染的鸡胚而制备的疫苗，主要使用Flury、Kelev这两株毒株来生产这种疫苗。该疫苗通常用肌内注射免疫犬、猫和牛，免疫期为一年(Meslinetal.1996)。此外，根据中华人民共和国农业部最新公告，自2017年7月1日起，将停止狂犬病活疫苗（包括多联活疫苗）的生产。利用反向遗传技术制备的狂犬病减毒活疫苗，反向遗传技术首先是利用分子克隆手段制得动物机体全基因组序列，然后对目的片段进行加工，改造，按照机体原本的基因组序列，构建经过修饰的基因组，从而达到改造机体的目的，以此平台反向遗传技术为基础，研究动物基因的的结构与功能，同时可以研究修饰基因对生物体的表现型和性状的改变。反向遗传弱毒苗的优点在于成本低，操作简便，缺点同样是使动物机体存在返毒的危险。因为修饰过的病毒在进入动物体内以后，假如动物本身体内带有RABV，可能导致街毒与经改造病毒的重组，可能使经改造的基因得到恢复，从而重新获得原有的毒力(殷相平2011)。弱毒苗和重组苗比较适合暴露前预防，灭活疫苗则适合暴露后治疗但免疫保护期相对较短，需加强免疫(扈荣良2012)。基因工程亚单位疫苗(subunitvaccine),又称重组亚单位疫苗（recombinatsubunitvaccine），是基于近些年的基因工程和生物技术的研究进展，将某些特定病毒的目的基因片段克隆，然后重组到相应的表达载体中，制备相应的重组质粒，并将其导入特定的所需细胞培养，使目的蛋白大量表达，可将佐剂加入优化表达后的目的蛋白，经乳化设备乳化，制得相应的疫苗。由于此类疫苗只含有病毒的某种或某几种特定抗原，不含其他遗传物质，理论上可以使动物获得保护性免疫。且不含有病毒的感染性组分，无需灭活，致病性风险低，安全性很高(殷相平2011)。基因工程亚单位疫苗是未来研究的主要方向和趋势。本文研究的G蛋白既是狂犬病毒中最有效的保护性抗原，也是研究基因工程亚单位疫苗的首选抗原，具有广泛的研究前景。8 1.2大肠杆菌表达系统概述1.2.1大肠杆菌表达系统的优势为了探究G蛋白的相关特性，本研究首先拟采用大肠杆菌表达系统对狂犬病病毒G蛋白进行优化表达。大肠杆菌是最早应用于蛋白发酵的工程菌，它的具有遗传性质研究透彻、容易增殖改进、转化效率较高、生长繁殖速度快、价廉质优，可以快速、大规模地生产目的蛋白等优点(Nucetal.2006)，而且其表达外源基因的产量也远高于其它基因表达系统，其表达的目的蛋白量甚至能大于细菌本体总蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统(Dongetal.2008)。通常当蛋白相对分子质量不大于100kDa，蛋白翻译后的修饰作用不影响构象和生物活性时，大肠杆菌表达系统是首选表达系统(苏鹏etal.2017)。1.2.2大肠杆菌表达载体的特点，分类，及选择表达载体是蛋白表达系统中最为关键的部件，一个良好的表达载体，首先应该其表达蛋白的量要高，然后遗传稳定性要好，而且要可以匹配多种目的基因片段。表达载体主要包括启动子、开放阅读框（ORF）、复制起点、终止子以及抗性标签等部分组成(Nucetal.2006;许崇利等.2010)。pGE表达载体、pQE表达载体、pET表达载体是应用最为普遍的三个系列，其中应用最多的当属高效表达载体是pET表达系统。pET系统是在大肠杆菌各类表达系统中表达外源蛋白效率最高、蛋白产量最大、表达速率最快的载体。它是利用与其相适配的启动子、以及能高效转录某种特定基因的外源RNA聚合酶，一起构建的T7RNA聚合酶/启动子系统，可以相应的由各类基因表达各类所需的蛋白(Dongetal.2008)。在实验中可能遇到表达的蛋白形成包涵体或者不易溶的物质，此时可以改变大肠杆菌的生长温度，可把温度降至30℃以下，20℃以上，或者减少培养基养分。这时，蛋白的转录和翻译活动减弱，目的蛋白的构想会发生折叠，溶解性即可提高(苏鹏等.2017)。当用BL21（DE3）表达菌株诱导表达目的蛋白的时候，蛋白表达量的多少和细胞的代谢产物的量能通过IPTG的浓度进行调节(Lebendikeretal.2014)。诱导时机的选择也同样重要，细通常选择OD600值为0.6（对数期）时加入诱导剂，此时细菌活力好，易于大量表达蛋白。提前加诱导剂，菌体量不够，蛋白表达量偏低；若加入太晚，细菌处于衰退期，对于表达量也有影响。加入诱导剂后的诱导时长，是跟随所选的表达载体或启动子的不同而有所差别。对启动子Ptac和Plac，大约2-3h，PR、PL、Ptrp、Ptrc需要诱导的时间则比较长。所以，要结合目的蛋白的性质及所选择载体的特性，摸索、优化诱导方案。从而达到提高蛋白的表达量的效果(解庭波2008)。大肠杆菌表达系统通过相应的表达载体来表达外源基因，常用的的表达载体有：融合载体、共表达载体、分泌载体等(Arnauetal.2006)。融合表达载体可以导入辅助基因序列，与目的基因构成融合后再进行表达，可以提高蛋白的生物学活性和产出效率，促进形成蛋白间的二硫键，防止目的蛋白被蛋白酶消化，同时有利于目的蛋白的分离和纯9 化(Choietal.2004)。由于外源蛋白表达后在E.Coli细胞内易被酶分解，也为了保证外源蛋白质能够形成正确构象，以便于蛋白提纯，所以在这个关键步骤上，我们需要使用分泌性表达载体，这同时可以缓解宿主的细胞代谢消耗，对蛋白在细胞外正确修饰、折叠，使其具有相应的生物学活性(Georgiouetal.2005)。大多数非原核表达的蛋白产物表达的产物是不具有真正的生物学活性的，而是需要以多聚体/复合物的形式才能发挥生物学效应，那么共表达载体则成为实现这一功能的关键一环，在后期蛋白质构象的正确形成和外排过程中，同样也起着很重要的作用(祁浩等.2016)。综上所述，大肠杆菌表达系统首先作为一个当前应用最为广泛的表达系统的蛋白质表达系统，具有多方面的优势，例如表达量相对较高，操作简易，价格低廉等优点；同时其作为一个原核表达系统也存在着许多先天的不足和缺憾，比如表达的蛋白可溶性时常不理想，出现包涵体，纯化步骤过于繁琐等，且原核表达系统翻译后修饰，加工系统不健全，因此在某种程度上可能导致所表达的蛋白生物学活性较低等。然而，对于一个新型基因工程亚单位疫苗的研发，采用大肠杆菌表达系统进行初步试验，依然不失为一个可行的备选方案。10 试验研究第二章G基因的合成与重组表达载体的构建本章内容是为后期G蛋白的可溶性表达及其表达条件优化准备材料的研究，通过构建RABVG蛋白重组表达载体pET-G，从而为优化重组蛋白的可溶性表达创造条件。2.1实验材料大肠杆菌pET-28a表达载体由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供；克隆菌（Escherichiacoli）JM109购自北京天根公司；表达菌E.coliBL21(DE3)从TAKARA公司购买。2.1.1主要试剂DNA聚合酶PrimeSTARMax（PrimeSTARMaxDNAPolymerase）、DL2000DNAMarker、T4DNA连接酶（T4DNAligase）、ExTaq酶、均购自大连宝生物公司；DNA限制性内切酶NdeI、XholI购自NEB（NewEnglandBiolabs,Inc.）公司，小量质粒提取试剂盒购自Axygen公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司；His单克隆抗体购TM自proteintech；小量质粒提取试剂盒为Axygen公司产品；琼脂糖（agrose）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体购自美国西格玛（Sigma）公司；IPTG购自INALCO公司；AEC显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胰蛋白胨购自Sigma公司、酵母抽提物购自OXOID公司；卡那霉素（Kanamycin）购自ThermoFisher公司。2.1.2主要设备与仪器高速冷冻离心机（日本HITACHI）；台式高速冷冻离心机（美国Sigma）；超速离心机（美国Thermo）；超低温保存冰箱（美国Revco）；超声波破碎仪（美国SONICS&MATERIALS）；双人单边超净工作台（苏州净化设备有限公司）；恒温培养箱（日本SANYO）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验仪器有限公司）；冰箱（德国SIEMENS）；凝胶成像系统（法国VILBERLOURMAT）；恒温循环水槽（北京长流科学仪器公司）；可调移液器（德国EPPENDORF）；高速PCR仪（德国AnalytikJena）；立式单门双层恒温振荡器（美国精骐）；小型高通量电泳槽（美国Bio-Rad）；电子天平（梅特勒-托利多（上海）公司）。2.2实验方法及实验步骤2.2.1目的基因G的引物设计根据Genebank中公布的狂犬病病毒CTN-1V10株的G蛋白基因序列（AEV43285），按照大肠杆菌密码子偏爱性及mRNA结构等信息优化RABV病毒结构蛋白G蛋白的基11 因，设计表达用引物（表2-1），在引物中引入NdeⅠ和XholⅠ酶切位点，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。表2-1G基因的PCR扩增引物Tab.2-1PCRamplificationprimerofGgene.引物名称酶切位点引物序列（5’—3’）G-FNdeⅠataCATATGAAATTTCCGATTTATACCATG-RXholⅠtatCTCGAGTTATTGCTGAACAGCATCCA注：下划线为酶切位点。2.2.2目的片段G的扩增以生工合成的含有G目的基因片段的重组质粒pUC57-G为模板，通过PCR获取大量的目的片段，以备后续实验所需。设20µL反应体系如下：表2-2G基因的PCR扩增反应体系Tab2-2PCRamplificationreactionsystemofGgene.反应物体积模板（pUC57-G）1µL上游引物G-F1µL下游引物G-R1µLExTaqase10µLddw7µL总量20µL混匀后适度离心，随后进行扩增。程序设定为：95℃预变性180s，一个loop；94℃变性，30s；56℃退火，30s；72℃延伸，90s；共29个loop；72℃充分延伸，10min。反应结束后，取PCR产物8µL用1%的琼脂糖凝胶（含500µg/L溴化乙锭（EB））电泳鉴定，将鉴定正确的扩增产物进行回收提纯。2.2.3PCR产物的回收与纯化应用TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒（UniversalDNAPurificationKit）对PCR产物进行回收与纯化。操作步骤见附录1。2.2.4重组表达载体的构建2.2.4.1双酶切空载体及目的片段将提纯回收的PCR产物和pET-28a载体分别片NdeⅠ和XholⅠ进行双酶切。酶切体系如下：12 表2-3双酶切反应体系Tab.2-3Doubleenzymereactionsystem.反应物体积pET-28a质粒或PCR产物60µL（5µg）NdeⅠ2.5µLXholⅠ2.5µLCutSmartBuffer8µLddw7µL总量80µL反应体系构建完毕后，于37℃条件下水浴，DNA与内切酶反应时间一般为15min（NEB说明书）~2h，放入65℃水浴锅内15min使酶失活。将酶切产物进行PCR，然后将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行核酸电泳，产物按照2.2.3纯化回收，经鉴定正确后作为目的片段备用。2.2.4.2双酶切产物的连接将双酶切产物回收纯化后的pET-28a载体与G目的基因片段，用TakaraT4DNA连接酶进行连接。将反应体系内容物充分混合，制冷水浴锅中反应，16℃水浴，4-12h进行连接。连接体系如下：表2-4连接反应体系Tab.2-4Ligationreactionsystem.反应物体积pET-28a5µLG5µLT4DNA连接酶1µLT4DNAligasebuffer1µLddw/2.2.4.3转化（1）将JM109感受态细胞从超低温冰箱迅速转移至冰上，融化后加入12µL连接产物，轻弹管壁将二者混匀。冰浴30min；（2）取出后42℃水浴锅中热击90s转移至冰浴，此过程严格控制时间；（3）冰浴2min后加入500µLLB培养基，37℃摇床横置震荡45min；（4）4000rpm/min离心5min后，弃500µL上清，100µL迅速重悬菌体，均匀13 涂在37℃预热的Kan抗性LB平板上，37℃培养箱倒置培养8-16h。2.2.5重组质粒的鉴定用针头或牙签从固体LB平板上挑取单菌落，接种于含Kan的LB液体培养液中，37℃垂直震荡培养。微量菌液作为PCR模板进行鉴定（方法同2.2.2），剩余菌液提取质粒用以双酶切鉴定（方法同2.2.4.1），鉴定为阳性的菌株，送上海生工公司进行测序。三者同时鉴定为阳性的可溶性重组质粒命名为pET-G，可用于后续的蛋白表达实验中，亦可用50%甘油-20℃保护冻存。2.3实验结果2.3.1G基因的扩增结果图2-1目的基因PCR结果和阳性重组质粒菌液PCR鉴定结果Figure2-1.PCRresultsandpositiverecombinantplasmidgenebacteriumfluidPCRidentificationresultsA.目的基因的扩增结果M.DL2000DNAMarker;泳道1-2：目的片段条带；其中目的片段大小约为1884bp。B.重组质粒菌液PCR鉴定阳性结果M.DL2000DNAMarker;泳道1-2：目的片段条带；其中目的片段大小约为1884bp。图2-1的用PCR产物进行核酸电泳的结果表明，在2000bp附近出现特异性条带，说明合成的目的片段与预期相符（1884bp），且阳性菌液中也含有相同大小的片段，因此可提取质粒，进行进一步的酶切鉴定。14 2.3.2重组质粒的酶切鉴定结果图2-2重组质粒的酶切鉴定结果Figure2-2.restrictionenzymedigestionresultsofrecombinantplasmidM：DL2000DNAMarker；泳道1-4：分别为重组质粒，NdeI单酶切重组质粒，XholI单酶切重组质粒；NdeI和XholI双酶切重组质粒。酶切鉴定结果表明，无论使用单酶切，双酶切，均符合预期效果，分别使用NdeI，XholI单酶切酶切重组质粒，从一个酶切位点酶切开环状DNA，故获得一条较大的条带；使用NdeI，XholI双酶切获得两条条带，其中一条与目的条带大小相符。可送往测序。2.3.3重组表达载体构建结果通过菌液PCCR，酶切鉴定，以及生工公司测序，可以表明重组质粒pET-G构建成功，其中G表示目的基因的插入位置，XholI，NdeI表示两个相应的酶切位点。该重组质粒为卡那霉素抗性。重组质粒示意图如下：图2-3重组质粒pETE-G示意图Figure2-3.RecombinantplasmidpET-Gschematicdiagraam.15 2.3.4分析与讨论G蛋白是RABV的五种结构蛋白中唯一可以刺激动物机体产生保护性中和抗体的蛋白，它由524个氨基酸组成，按照其蛋白编码的原始基因序列，根据大肠杆菌密码子偏好性及mRNA结构等信息优化RABV病毒G蛋白的基因序列，优化后的序列长度为1884bp。pET系统是在大肠杆菌各类表达系统中表达外源蛋白效率最高、蛋白产量最大、表达速率最快的载体。其利用相对应的启动子，高效转录外源RNA聚合酶，构建的T7RNA聚合酶/启动子系统，可以表达各类蛋白(Dongetal.2008)。pET-28a载体自身含有组氨酸（His）标签，便于对重组表达的蛋白进行亲和纯化，如使用Ni填料纯化蛋白等。16 第三章G蛋白的诱导表达与纯化本章首先通过SDS-PAGE和Western-blot方法对在大肠杆菌中表达的目的蛋白G进行检测和鉴定，然后就蛋白的诱导表达的条件进行探索和优化，最终确定一个相对最优的诱导表达条件，从而获得相对高含量的可溶性目的蛋白的表达量。在此基础上，为获取较高纯度的免疫原，提高免疫效率，对已诱导表达的可溶性蛋白上清溶液进行纯化方法的摸索，选择相对纯度较高的含目的蛋白上清液作为免疫原，为下一步的动物试验做准备。3.1G蛋白的诱导表达与纯化3.1.1实验材料大肠杆菌pET-28a表达载体由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供；重组TM质粒为前述实验中构建；His单克隆抗体购自proteintech；狂犬病病毒鼠源单抗（anti-mousemAb）购自美国Abcam公司；小量质粒提取试剂盒为Axygen公司产品；琼脂糖（agrose）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体购自美国西格玛（Sigma）公司；IPTG购自INALCO公司；AEC显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胰蛋白胨（tryptone）购自Sigma公司、酵母提取物（YeastExtract）购自OXOID公司；卡那霉素（Kanamycin）购自ThermoFisher公司。镍填料购自美国GE公司；离子交换填料购自美国Bio-Rad公司。3.1.2.主要试剂的配制（1）卡那霉素（Kanamycin）母液：用电子天平称取1.5gKan粉末置于50mL小瓶中；加入10mL去离子水摇匀后加超纯水到15mL，用0.22μm滤器抽滤；适当分成若干份分装，-20℃冻存。（2）LB液体培养基：称取10gTryptone，5gYeastExtract，10gNaCl于1L烧杯中；加入800mL去离子水，充分搅拌溶解；然后再加水定容至1L；高温高压灭菌，随后使用或置于4℃冰箱保存。（3）LB固体培养基：称取10gTryptone，5gYeastExtract，10gNaCl和15gAgar于1L烧杯中；加入800mL去离子水充分搅拌后，高压灭菌加入卡那抗性抗生素，使终浓度为1mg/ml；倒板后4℃保存。（4）PBS缓冲液:分别称量8.5gNaCl，3.352gNa2HPO4·12H2O，0.286gNaH2PO4·2H2O使用去离子水充分溶解，然后再定容至1000mL。（5）IPTG（100mmol/L）：称量1.2gIPTG置于50mL离心管中；加入40mL超纯水充分摇匀，随后加双蒸水至50mL；0.22μm滤器过滤后小份，分装备用，-20℃保存。17 （6）蛋白胶的配制a.12%分离胶的配制表3-112%分离胶配方Tab.3-1Thecomponentofthe12%separationgel.分离胶各成分用量超纯水3.3mL30%acrylamide4.0mL1.5MTris-Hcl（pH8.8）2.5mL10%APS100μL10%SDS100μLTEMED4μLTOTALVOLUME10mLb.12%浓缩胶的配制表3-212%浓缩胶配方Tab.3-2Thecomponentofthe12%spacergel.浓缩胶各成分用量超纯水1.4mL30%acrylamide0.33mL1.0MTris-Hcl（pH6.8）0.25mL10%APS20μL10%SDS20μLTEMED2μLTOTALVOLUME2mL（8）5×SDS-PAGEloadingbuffer的配制（上样缓冲液）：配制10mL的的上样缓冲液，称取相应试剂于10mL的离心管中：加去超纯水溶解，然后定容至10mL；1000μL/份分装，使用前每份加入50μL的β-巯基乙醇。表3-35×SDS-PAGEloadingbuffer配方Tab.3-3Thecomponentofthe5×SDS-PAGEloadingbuffer.组分用量1.0MTris·Hcl（pH=6.8）2.5mLSDS1.0g溴酚蓝（Bromophenolblue）50mgglycerol5.0mL（9）5×Runningbuffer（电泳缓冲液的配制）称取Tris15.1g，SDS5.0g，甘氨酸18 94.0g加入800mL超纯水，充分搅拌混匀后，再加水至1L。（10）考马斯亮蓝染色液：1g考马斯亮兰（R-250）；加入250mL的异丙醇充分搅拌直至完全溶解；随后取100mL的冰醋酸；加入搅拌均匀直至溶解；最后加入650mL的双蒸水水搅拌使之完全溶解；应先用滤纸过滤后再使用。（11）脱色液：用吸管吸取100mL醋酸；50mL乙醇，850mL去离子水，置于2L烧杯中，使用磁力搅拌器完全摇匀后备用。3.1.3主要设备与仪器高速冷冻离心机（日本HITACHI）；台式高速冷冻离心机（美国Sigma）；超速离心机（美国Thermo）；超低温保存冰箱（美国Revco）；超声波破碎仪（美国SONICS&MATERIALS）；双人单边超净工作台（苏州净化设备有限公司）；恒温培养箱（日本SANYO）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验仪器有限公司）；冰箱（德国SIEMENS）；凝胶成像系统（法国VILBERLOURMAT）；恒温循环水槽（北京长流科学仪器公司）；可调移液器（德国EPPENDORF）；高速PCR仪（德国AnalytikJena）；立式双门双层恒温振荡器（美国精骐）；小型高通量电泳槽（美国Bio-Rad）；电子天平（梅特勒-托利多（上海）公司）；蛋白纯化系统购自美国伯乐。3.2实验方法及实验步骤3.2.1重组G蛋白的诱导表达及蛋白免疫印迹法的鉴定（1）从前期试验结果中挑选出生工测序符合预期的pET-G重组质粒，以1:1000接种于含有100μg/mLKan的LB液体培养基中，于小摇床中37℃，220rpm培养过夜。（2）第二天以1：100将此菌液再接种于含有100g/mLKan的100mLLB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD450值约为0.6时加入诱导剂IPTG使诱导菌液终浓度为1.0mmol/L，然后继续诱导12h。（3）收集菌液，10000rpm离心10min，倒去上层液体培养基。（4）加入10mlPBSbuffer重悬瓶底菌体沉淀。将重悬过后的菌体用超声破碎仪进行超声破碎，φ2变幅杆，30%功率，工作3s，间歇5s，工作时间20min。（5）超声破碎完毕后，将内容物分别装进相应的离心管中，12000rpm离心10min，将上清和菌体破碎沉淀分开。取上清液48μL，加入12μL5×SDS-PAGEloadingbuffer，沉淀中加入等量的PBSbuffer吹打混匀，然后也加入12μL5×SDS-PAGE上样缓冲液，上述两份样品经100℃水浴8min后，12000rpm离心2min，20μL上样已配好的12%的聚丙烯酰胺凝胶，电泳进行SDS-PAGE检测。（6）电泳结束后取出凝胶，将分离胶转移到用甲醇和转膜缓冲液浸泡好的硝酸纤维膜上（NC膜），用半干转膜仪设定15V，1h然后用蛋白免疫印迹法对试验结果进行鉴定。（7）转膜结束后，及时取出膜，用PBST简单冲洗后，将膜放入事先配制好的含19 5%脱脂奶粉的脱脂奶中，4℃冷藏室置放，封闭过夜。（8）取出封闭过夜的膜，用PBST冲洗干净，然后加一抗，即含His标签的单抗，一抗按照1:5000的比例稀释，加入后放置于37℃CO2培养箱温育1h，然后用PBST洗膜三次，每次5min；二抗加入1:1000稀释的羊抗鼠二抗，37℃孵育45min，PBST洗膜3次，每次5min，双蒸水洗净后再用AEC显色试剂盒进行显色（显色方法按照试剂盒说明书进行操作，详见附录）。3.2.2重组蛋白的诱导表达条件优化（1）取pET-G阳性菌液加入含Kan的液体LB培养基中，置于37℃，220rpm摇床中培养至OD600为0.6时在菌液中加入诱导剂IPTG，开始诱导表达。（2）针对待表达蛋白的反应温度，诱导时长，诱导剂IPTG浓度进行摸索，对表达条件进行探索，寻求最优条件。（3）在诱导时长试验中，分别选择4h、8h、12h、16h、20h时间点收集菌液（在IPTG终浓度为1.0mmol/L，温度37℃条件下筛选）；（4）在IPTG浓度摸索试验中，分别选择0.1-1.0mmol/L共十个浓度梯度（在37℃，20h条件下筛选）；（5）诱导温度的摸索实验分别选择15℃，20℃，25℃，37℃四个温度梯度（于IPTG终浓度为0.2mmol/L，20h条件下筛选）；（6）随后收集菌液，表达产物分别用SDS-PAGE鉴定，以确定重组蛋白的最佳诱导条件。（7）在选择出相对优化的反应条件后，可进行下一步的Westernblot鉴定重组蛋白G的反应原性，进而确定表达的重组蛋白的正确性。3.2.3Westernblot检测重组蛋白G的反应原性（1）将含有目的蛋白的SDS-PAGE胶转移至硝酸纤维膜（NC膜）上，5%脱脂奶封闭至4℃过夜；（2）洗膜后加入1:2500稀释的狂犬病病毒鼠源单抗（anti-mousemAb）为一抗，37℃孵育1h，洗膜3次；再加入1:5000稀释的羊抗鼠二抗，37℃孵育45min，PBST洗膜三次；（3）双蒸水洗净后用AEC试剂盒显色，观察蛋白质的显色状况。3.2.4Ni填料纯化目的蛋白试验3.2.4.1不同pH缓冲液条件下目的蛋白与Ni填料的结合试验由于本实验所采用的大肠杆菌重组表达载体pET-28a自带6×His标签，所以首先考虑采取Ni柱亲和纯化来获取较纯的可溶性G蛋白。纯化之前首先进行了目的蛋白与Ni填料用不同pH条件下缓冲液重悬后的结合情况（即模拟挂柱情况）来判断某一pH条件的缓冲液是否适合作为纯化所用之buffer。试验方法如下：20 （1）选取经优化后条件诱导表达的含G重组蛋白的菌液，高速离心后的菌体分别用pH6.0，pH7.0，pH8.0的PBbuffer，pH7.0，pH8.0，pH9.0的Tris-clbuffer重悬，经超声破碎后取蛋白上清液；（2）将用不同pH的buffer重悬的蛋白上清液分别加入1.5mLEP管中作为原液与Ni填料充分混合（考虑蛋白总量与填料最大载量关系，本试验均各取30μL填料与300μL经超声破碎的蛋白上清液结合）反应后弃去多余液体；（3）用含高浓度咪唑（1MImidazole）的上述六种buffer分别作为Elutionbuffer洗涤EP管中剩余Ni填料，取样后做SDS-PAGE检测并观察实验结果，该试验胶板每孔上样量为20μL；（4）通过凝胶成像系统对SDS-PAGE结果进行分析，判断并选择合适的pH条件下的buffer作为Ni填料纯化蛋白试验的备选缓冲液。3.2.4.2Ni填料纯化蛋白实验纯化方法如下：（1）取1mL自装填空柱一个，将柱子垂直固定于5mL离心管架子上，5mL注射器针头接在其下口处，在下方放置小烧杯或平皿用于盛接流出液体；（2）向柱子中加入适量镍填料（根据要纯化蛋白的量及填料质量控制填料的量），用10倍柱床体积1×Bindingbuffer平衡镍柱，滴加缓冲液要缓慢多方位滴加，使柱床上表面尽量呈平面；（3）将超声破碎处理后的蛋白溶液与等体积的1×Bindingbuffer混合，在镍柱上循环3-5遍，用2倍柱床体积1×Bindingbuffer继续淋洗，收集过柱后的蛋白液。用微量分光光度计测过柱前后蛋白液浓度；用1×Washbuffer淋洗柱子，每次加1mL，分别用1.5mL离心管收集洗脱液并做好标记，用微量紫外分光光度计测每管蛋白浓度，直至蛋白浓度降至0.005mg/mL以下时停止；（4）依次用Elutionbuffer、含不同梯度浓度咪唑的buffer溶液按照步骤（4）淋洗柱子并测含量；（5）用10倍柱床体积PBS淋洗柱床，最后加20%乙醇封装柱子（乙醇量以盖住柱床为准）。3.2.5离子交换层析填料的筛选在3.2.4的基础上，我们尝试离子交换层析的方法来纯化目的蛋白。根据ProtParamtool推测出目的蛋白的等电点（pI）约为7.8。为进一步优化，摸索G蛋白纯化的相关条件，首先对以下几种离子交换填料进行筛选，选出结合性较好的填料用来纯化目的蛋白。21 1.BIO-RAD:Macro-PrepHighSSupport；2.BIO-RAD:Macro-PrepCMSupport；3.BIO-RAD:NuviaTMQAnionExchangeMedia；4.BIO-RAD:UNOsphereTMQAnionExchangeMedia其中1，2为阳离子交换填料；3，4为阴离子交换填料。后续实验结果中为叙述简便将该四种填料简写为填料1，2，3，4。考虑蛋白的变性范围，缓冲液的pH值选择在6.5-9.5的范围内。3.2.5.1阳离子交换填料（填料1,2）筛选方法（1）针对目的蛋白等电点和阳离子交换填料1,2配置不同pH，不同盐离子浓度的缓冲液来分别备用；（2）分别配制20mM的pH6.0的PBbuffer，pH6.5的PBbuffer，20mM的pH7.0的PBbuffer，重悬超声破碎后的含目的蛋白上清液，此为原液，加填料1和填料2与原液充分混合使填料与蛋白充分结合（考虑蛋白总量与填料最大载量关系，本试验均各取30μL填料与300μL经超声破碎的蛋白上清液结合），随后用含1MNacl的该PBbuffer高盐洗脱蛋白，这三步分别取样10μL进行SDS-PAGE检测，即相当于原液，流出液，洗脱液。通过原液与洗脱液的检验结果来间接判断目的蛋白与填料的结合状况（即所谓挂柱情况），通过洗脱条带（洗脱量）判断目的蛋白与填料结合的牢固程度，判断该填料结合的目的蛋白是否容易洗脱，若高盐buffer仍不易洗脱，说明该填料不适宜用于纯化蛋白。（3）分别配制50mM的pH6.0的PBbuffer，50mM的pH6.5的PBbuffer，50mM的pH7.0的PBbuffer，重悬超声破碎后的含目的蛋白上清液，以此为原液，加填料1和填料2与原液充分混合使填料与蛋白充分结合，随后用含1MNacl的该PBbuffer高盐洗脱蛋白，这三步分别取样10μL进行SDS-PAGE检测并观察结果。3.2.5.2阴离子交换填料（填料3,4）筛选方法（1）分别配制20mM的pH8.5的Tris-clbuffer，50mM的pH8.5的Tris-clbuffer，20mM的pH9.5的Tris-clbuffer，重悬超声破碎后的含目的蛋白上清液，此为原液，加填料3和填料4与原液充分混合使填料与蛋白充分结合，随后用含1MNacl的该Tris-clbuffer高盐洗脱蛋白，这三步分别取样10μL进行SDS-PAGE检测并观察结果；（2）分别配制20mM的pH8.5的含20mMNacl的Tris-clbuffer，20mM的pH9.5的含20mMNacl的Tris-clbuffer，重悬超声破碎后的含目的蛋白上清液，以此为原液，加填料3和填料4与原液充分混合使填料与蛋白充分结合，随后用含1MNacl的该Tris-clbuffer高盐洗脱蛋白，这三步分别取样10μL进行SDS-PAGE检测并观察结果。3.2.6离子交换层析法纯化目的蛋白试验通过3.2.5的系列试验，可以发现在不同条件下阴离子填料3和填料4与目的蛋白22 的结合效果均要明显优于阳离子填料。所以这部分我们选择阴离子填料3，4来作为离子交换层析法纯化蛋白的备选填料，进行以下试验：（1）取GE公司1mL空离子交换柱一支，将柱子垂直固定于5mL离心管架子上，在下方放置小烧杯或平皿用于盛接流出液体；（2）分别向柱子中加入适量装填1mL填料3和填料4；（根据要纯化蛋白的量及填料质量控制填料的量），首先用10倍柱床体积的超纯水洗净填料中的残存乙醇，再用10倍柱床体积1×Bindingbuffer（该试验中为20mM的pH8.5的Tris-clbuffer）平衡柱体，滴加缓冲液要缓慢多方位滴加，使柱床上表面尽量呈平面；（3）将超声破碎处理后的蛋白溶液与等体积的1×Bindingbuffer混合，在离子交换柱上循环3-5遍，用2倍柱床体积1×Bindingbuffer继续淋洗，收集过柱后的蛋白液。用微量分光光度计测过柱前后蛋白液浓度；（4）用1×Washbuffer（本试验中是含100mMNacl的pH8.5的Tris-clbuffer）淋洗柱子，每次加1mL，分别用1.5mL离心管收集洗脱液并做好标记，用微量紫外分光光度计测每管蛋白浓度，直至蛋白浓度降至0.005mg/mL以下时停止；（5）用两个浓度梯度的Elutionbuffer（本实验中是含250mMNacl，500mMNacl，1MNacl的pH8.5的Tris-clbuffer）溶液按照步骤（4）淋洗柱子并测含量；（6）用10倍柱床体积PBS及超纯水淋洗柱床，最后加20%乙醇封装柱子（乙醇量以盖住柱床为准）；（7）分别选取各个步骤中液体作为样品进行SDS-PAGE检测（蛋白胶每孔上样20μL），通过凝胶成像系统对检测结果进行分析，观察并分析试验结果。3.2.7凝胶过滤层析法纯化目的蛋白为了获取相对理想的纯化结果，我们尽可能在现有条件下进行多种纯化方法的尝试，本试验采用美国Bio-Rad蛋白纯化系统及GE公司的superdex200PG凝胶过滤层析柱对目的蛋白进行纯化。试验方法如下：（1）选取含20mMTris和100mMNacl的pH7.0的缓冲液作为B液，A液为超纯水；（2）按照仪器自带程序设置纯化流程，出峰后手动开始收集流出液；（3）将收集的流出液取样进行SDS-PAGE检测，通过凝胶成像系统观察并分析试验结果。3.3实验结果3.3.1重组蛋白G的诱导表达及可溶性分析结果SDS-PAGE结果（图3-1）表明，经IPTG诱导后，分子质量约为65kDa的蛋白质大量表达，且大部分以可溶性形式存在，大小与G重组蛋白的理论分子质量相符。表明目的蛋白G能够在大肠杆菌中表达，且大部分以可溶性形式存在。23 Westernblot结果（图3-2）显示，65kDa处条带能够与His单抗特异性结合。进一步表明，G重组蛋白成功表达。图3-1重组蛋白G的SDS–PAGE分析Figure3-1.SDS-PAGEanalysisresultofrecombinantproteinG.M：蛋白质Marker；泳道1、2：分别为pET–G在20℃未诱导时的超声上清、沉淀；泳道3、4：分别为pET–G在20℃诱导表达时的超声上清、沉淀。其中目的蛋白条带大小约为65kDa。图3-2重组蛋白G的Westernblot分析Figure3-2.ThewesternblotanalysisresultsofrecombinantproteinG.M：蛋白质Marker；泳道1、2：分别为pET–G在20℃未诱导时的超声上清、沉淀；泳道3、4：分别为pET-G在20℃诱导表达时的超声上清、沉淀。其中目的蛋白条带大小约为65kDaD。24 3.3.2重组蛋白G的诱导表达条件优化结果图3-3pET–G经不同时间的诱导表达的结果Figure3-3.TheresultofpET-Ginducedbydifferenttime.M：蛋白质Marker；泳道1-5分别为经4、8、12、16、20、24h诱导表达的pET–G。其中目的蛋白条带大小约为65kDa。图3-3显示，诱导12h和16h时，目的蛋白表达量并无太大差异，16h以后，无关蛋白质表达量开始增加，故选择12h作为诱导时长。通过对IPTG诱导浓度进行优化发现，当IPTG浓度为0.1mmol/L时，目的蛋白表达量较低，明显低于0.2mmol/LIPTG时的诱导表达量。图3-4pET-G经不同IPTG浓度诱导表达的结果Figure3-4.TheresultsofpET-GinducedbydifferentIPTGconcentration.M：蛋白质Marker；泳道1：未诱导菌液；泳道2-11：分别为用终浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mmol/L的IPTG诱导表达的G重组蛋白。其中目的蛋白条带大小约为65kDa。当IPTG浓度高于0.2mmol/L时，目的蛋白表达量并无显著提高（图3-4）。因此，选择0.2mmol/L的IPTG终浓度作为IPTG浓度诱导。25 图3-5pET-G在不同温度条件下诱导表达的情况Figure3-5.TheresultofpET-Ginducedunderdifferenttemperatureeconditions.M：蛋白质Marker；泳道1：未诱导菌液上清；泳道2-5：分别为在15、20、25、37℃时表达的G重组蛋白；其中目的蛋白条带大小约为65kDa。通过对诱导表达温度进行优化发现，在37℃诱导时，上清中重组蛋白含量不高，随着温度逐渐降低，沉淀中的目的蛋白逐渐减少，可溶性蛋白表达量逐渐升高。当温度降至15℃时，目的蛋白表达量较20℃时低。因此，选择20℃作为诱导温度（图3-5）。3.3.3Westernblot鉴定重组蛋白的反应原性从图3-6可以看出，在65kDa处出现相应的特异条带，与预期的G重组蛋白大小一致。可见，表达的G重组蛋白能被抗RABV单克隆抗体所识别，具有良好的反应原性。图3-6重组蛋白G的反应原性分析Figure3-6.TheimmunoreactivityanalysisofrecombinantproteinG.M：蛋白质Marker；泳道1：pET–G在20℃诱导表达时的超声上清；泳道2：pET–G在20℃诱导表达时的超声沉淀；其中目的蛋白条带大小约为65kDa。3.3.4目的蛋白与Ni填料的结合试验按照3.2.4.1的操作步骤，经不同pH缓冲液条件重悬后超声破碎的菌体，经离心后26 取上清液分别与适量的Ni填料充分混匀，以期使目的蛋白与Ni填料充分结合，使用高浓度咪唑（1MImidazole）洗脱，收集洗脱液，以20μL上样量进行SDS-PAGE检测，结果如下图所示（其中目的蛋白条带约65kDa）。图3-7不同pH缓冲液条件下目的蛋白与Ni填料的结合试验Figure3-7.SDS-PAGEresultofthebindingtestbetweentargetproteinandnickelfillerindifferentpHcondition.M：蛋白Maker；泳道1-3：分别为pH6.0，pH7.0，pH8.0的PBbuffer条件下洗脱的目的蛋白条带；泳道4-6：分别为pH7.0，pH8.0，pH9.0的Tris-clbuffer条件下洗脱的目的蛋白条带；其中目的蛋白条带大小约为65kDa。由图3-7的SDS-PAGE结果可以看出目的蛋白Tris-clbuffer在各个pH条件下的结合效果均优于PBbuffer，而且在pH7.0时，Tris-clbuffer条件下Ni填料结合的杂蛋白较少，目的蛋白较多，故选择pH7.0的Tris-clbuffer作为该试验的biindingbuffere。3.3.5Ni填料纯化蛋白的试验结果图3-8Ni填料纯化蛋白的试验结果Figure3-8.PreliminarytestresultsofNifillerpurifiedprotein.M：蛋白Maker；泳道1-6：分别为pH7.0的Tris-clbuffer重悬超声破碎后的原液，上样后的蛋白流出液，含100mM咪唑的pH7.0的Tris-clbuffer洗脱液，含250mM咪唑的pH7.0的Tris-clbuffer27 洗脱液，含500mM的pH7.0的Tris-clbuffer洗脱液，含1M咪唑的pH7.0的Tris-clbuffer洗脱液。其中目的蛋白条带约为65kDa。按照3.2.4.2的操作步骤，以20µL上样量进行SDS-PAGE检测，如图3-8所示SDS-PAGE检测结果可以看出，在逐步提高洗脱液中咪唑浓度的同时，杂蛋白逐渐洗脱，但目的蛋白也有不同程度的损失。相比较而言，在100mM咪唑浓度洗脱和250mM咪唑浓度洗脱时，100mM洗脱的目的蛋白量要明显高于后续浓度的洗脱液。3.3.6离子交换层析填料的筛选结果按照3.2.5的操作步骤，对阳离子交换填料1，2和阴离子交换填料3，4进行筛选，各步骤收集液以10μL上样量进行SDS-PAGE检测，结果如下图（图3-9—3-14）所示。检测结果表明，使用不同pH条件下的Tris-clbuffer及阴离子填料3，4与目的蛋白的结合效果普遍均优于使用PBbuffer及阳离子填料1，2的效果。图3-9阳离子填料1,2的筛选结果Figure3-9.Selectedresultsofcation-exchangepacking1&2bySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-5：分别为20mMpH6.0的PBbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料1混合后的流出液，与填料1混合后洗脱液，与填料2混合后的流出液,与填料2混合后的洗脱液；泳道7-11：20mMpH6.5的PBbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料1混合后的流出液，与填料1混合后洗脱液，与填料2混合后的流出液,与填料2混合后的洗脱液。其中目的蛋白条带约为65kDa。28 图3-10阳离子填料1,2的筛选结果Figure3-10.Selectedresultsofcation-exchangepacking1&2bySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-5：分别为20mMpH7.0的PBbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料1混合后的流出液，与填料1混合后洗脱液，与填料2混合后的流出液,与填料2混合后的洗脱液；泳道7-11：50mMpH6.0的PBbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料1混合后的流出液，与填料1混合后洗脱液，与填料2混合后的流出液,与填料2混合后的洗脱液。其中目的蛋白条带约为65kDa。图3-11阳离子填料1,2的筛选结果Figure3-11.Selectedresultsofcation-exchangepacking1&2bySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-5：分别为50mMpH6.5的PBbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料1混合后的流出液，与填料1混合后洗脱液，与填料2混合后的流出液,与填料2混合后的洗脱液；其中目的蛋白条带约为65kDa。29 图3-12阳离子填料1,2的筛选结果Figure3-12.Selectedresultsofcation-exchangepacking1&2bySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-5：分别为50mMpH7.0的PBbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料1混合后的流出液，与填料1混合后洗脱液，与填料2混合后的流出液,与填料2混合后的洗脱液；其中目的蛋白条带约为65kDa。图3-13阴离子填料3,4的筛选结果Figure3-13.Selectedresultsofanion-exchangepacking3&4bySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-5：分别为20mMpH8.5的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料3混合后的流出液，与填料3混合后洗脱液，与填料4混合后的流出液,与填料4混合后的洗脱液；泳道6-10：分别为500mMpH8.5的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料3混合后的流出液，与填料3混合后洗脱液，与填料4混合后的流出液,与填料4混合后的洗脱液；泳道11-13：分别为20mMpH9.5的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料3混合后的流出液，与填料3混合后洗脱液。其中目的蛋白条带大小约为65kDa。30 图3-14阴离子填料3,4的筛选结果Figure3-14.Selectedresultsofanion-exchangepacking3&4bySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-3：分别为20mMpH9.5的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料4混合后的流出液，与填料4混合后洗脱液；泳道4-8：分别为200mMpH8.5的Tris-cl加20mMNaclbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料3混合后的流出液，与填料3混合后洗脱液，与填料4混合后的流出液，与填料4混合后的洗脱液；泳道9-13：分别为20mMpH9.5加20mMNacl的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料3混合后的流出液，与填料3混合后洗脱液；20mMpH9.5加20mMNacl的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，与填料4混合后的流出液，与填料4混合后洗脱液。其中目的蛋白条带大小约为65kDa。3.3.7离子交换层析纯化目的蛋白的试验结果图3-15离子交换层析法纯化目的蛋白的试验结果Figure3-15.TestresultsofionexchangechromatographypurificationoftargetproteinbySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-6：分别为20mMpH8.5的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，过含填料3的自装填柱的蛋白流出液，含100mMNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液，含250mMNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液，含500mMNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液,含1MNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液。其中目的蛋白条带大小约为65kDa。31 图3-16离子交换层析法纯化目的蛋白的试验结果Figure3-16.TestresultsofionexchangechromatographypurificationoftargetproteinbySDS-PAGE.M：蛋白Maker；泳道1-6：分别为20mMpH8.5的Tris-clbuffer重悬超声破碎蛋白原液，过含填料4的自装填柱的蛋白流出液，含100mMNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液，含250mMNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液，含500mMNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液,含1MNacl的20mMpH8.5的Tris-clbuffer的洗脱液。其中目的蛋白条带大小约为65kDa。由图3-15和图3-16的SDS-PAGE结果可以看出，3和4两种阴离子填料纯化蛋白的结果相似，其中含250mMNacl的洗脱液较含100mMNacl的杂蛋白量有所减少，但目的蛋白洗脱量亦明显减少。3.3.8凝胶过滤层析法纯化目的蛋白的结果按照3.2.7所述，参照纯化仪器计算机系统（BioLogicDuoFlow™ChromatographySystem）出峰的时间，开始收集蛋白洗脱液，随后以20μL上样量进行SDS-PAGE检测，检测结果如下图。选取泳道2（峰顶）的蛋白洗脱液作为动物试验的免疫原。图3-17凝胶过滤层析系统工作示意图Figure3-17.SchematicdiagramsofBioLogicDuoFlow™ChromatographySystem.32 图3-18凝胶过滤层析法纯化目的蛋白的结果Figure3-18.Thegelfiltrationchromatographypurificationresultoftargetprotein.M：蛋白Marker；泳道1：蛋白原液；泳道2：即图3-17中峰顶的收集液，目的蛋白大小约为65kDa。由图3-18可见，经凝胶过滤层析纯化的蛋白收集液（泳道2）相对于蛋白上清原液（泳道1）杂蛋白过滤较多，且目的蛋白条带含量相对于之前几种方法较高，加之该方法操作步骤简便，故选用该方法纯化的蛋白作为后续实验试制疫苗的免疫原。3.4分析与讨论由于大肠杆菌表达载体pET-28a自身带有6×His标签，此外，有研究结果表明，带有His标签的融合蛋白在进行SDS–PAGE分析时会出现分子质量比实际值偏大的情况，这种情况可能是由于His融合标签中的His为碱性氨基酸，含较多的正电荷，导致目的重组蛋白在电泳过程中速度降低（唐威华等2010）。在本研究中，SDS-PAGE电泳结果表明，重组G蛋白分子质量比理论值略大，试验结果符合预期。本实验中的重组G蛋白具有较好的水溶性。通过优化表达条件，重组蛋白可溶性表达效果较好，且该重组蛋白与RABV单克隆抗体有良好的反应原性。此外，通过不同的筛选和蛋白纯化方法的尝试，对G重组蛋白的纯化进行了摸索，首先通过Ni填料结合试验和阴阳离子填料的筛选试验，分别选出了较合适的与Ni填料的结合缓冲液以及相应结合目的蛋白较好的两种阴离子填料3,4。然而在Ni填料和离子填料装柱后试验发现目的蛋白的结合量和洗脱量均有下降。目的蛋白对于Ni柱的结合率低有可能是由于目的蛋白在折叠过程中构象不正确导致His标签在表达过程中折叠时不在蛋白分子表面而导致。在离子交换层析法纯化蛋白时，与天然G蛋白的构象差异也可能是导致目的蛋白结合率低的一个原因，离子强度和pH仍需要进一步摸索。凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)法纯化，即分子筛法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。其优点在于凝胶颗粒不带电荷，操33 作条件宽松，对分离成分的物理化学性质的保持性较好。通过对SDS-PAGE结果分析表明，同等条件下，分子筛纯化的蛋白中，目的蛋白含量是最高的，因此经综合比较纯化效果和目的蛋白含量及步骤简繁后，我们选择经凝胶过滤层析的蛋白收集液作为免疫原，即后续动物免疫试验的备选材料。34 第四章疫苗的试制及其免疫效果评价本章目的是基于前期的试验基础上，尝试以重组G蛋白为免疫原试制狂犬病基因工程亚单位疫苗，经小鼠免疫试验后，利用商品化狂犬病病毒中和抗体ELISA检测试剂盒对免疫血清进行检测，通过血清抗体水平从而评估免疫效果。4.1实验材料与试剂免疫原（取自经凝胶过滤层析的含重组蛋白G的流出收集液）；6周龄Balb/C雌性小鼠30只，购于河南省实验动物中心；待检血清取自该批小鼠。PBSbuffer；法国SEPPIC公司MONTANIDE™ISA71RVG油包水佐剂；pH7.0Tris-cl缓冲液；免疫增强剂BI,BB为河南省动物免疫学重点实验室自备；商品犬用狂犬病灭活苗购自法国维克公司；商品用狂犬病病毒中和抗体ELISA检测试剂盒购自深圳绿诗源生物有限公司。4.2主要设备与仪器蛋白纯化系统购自美国伯乐公司，superdex200PG凝胶过滤层析柱购自美国GE公司；匀浆机购自德国IKA公司；移液器购自德国Eppendorf公司；小型离心机购自伯乐公司。4.3实验方法及实验步骤4.3.1免疫原的制备（1）选取经凝胶过滤层析的蛋白收集液3mL，先分为两组各1.5mL，分别与60μLBI,180μLBB，置冰水混合物中，4℃反应过夜。（2）次日将两组再分为各0.75mL的两组，分别再各加2.2mLTris-clbuffer和2.2mLISA71RVG佐剂混匀后将ISA组用匀浆机乳化5min。用以作为免疫小鼠的备选免疫原。（3）Tris-clbuffer和商品疫苗作为阴性对照和阳性对照免疫小鼠。4.3.2免疫分组及免疫程序4.3.2.1免疫分组本次动物试验按照每组5只小鼠，按照免疫原的差别分为以下六组：（1）Tris-clbuffer组：即阴性对照组（NegativeControl，NC）；（2）商品灭活苗免疫组：即阳性对照组（PositiveControl，PC）；（3）G-BI-Tris免疫组：即目的蛋白G加免疫增强剂BI不加佐剂组；（4）G-BI-ISA免疫组：即目的蛋白G加免疫增强剂BI并且加ISA佐剂组；（5）G-BB-Tris免疫组：即目的蛋白G加免疫增强剂BB不加佐剂组；（6）G-BB-ISA免疫组：即目的蛋白G加免疫增强剂BB并且加ISA佐剂组。35 4.3.2.2免疫程序（1）一免对各组小鼠按照剪耳编号，剪尾采血，背部皮下多点注射的顺序免疫小鼠。每只小鼠按照组别分别注射100μL的不同的免疫原。（2）一免后每7天剪尾采血一次，每次用10μL移液器采血10μL并加入含190μLPBSbuffer的PCR管中与之充分混匀，留作制备血清后冻存；（3）一免后28天首先按照步骤（2）所述操作对各组小鼠进行剪尾采血，然后用相同免疫原按照步骤（1）所述方法对各组小鼠进行二免；（4）二免后同样按照前述方法每7天采血一次，至二免后第28天（总第56天）为止，采血后离心制备血清-40℃冻存备用或待检；4.3.3免疫血清的检测除去免疫初期第六组（G-BB-ISA组）淘汰二只以外，其余小鼠生长状况良好。取一免后28天和二免后28天所采的小鼠血液制备待检血清，用商品用狂犬病病毒中和抗体ELISA检测试剂盒对待检血清进行检测，该试剂盒中反应孔采用灭活的狂犬病病毒进行包被，故通过测定其OD450值对免疫效果进行分析。免疫后待检血清的ELISA检测步骤如下：（1）将待检血清用PBST按1:500稀释后（原始制备血清是原血稀释20倍，即原制备血清再稀释25倍）分两组加入56个反应孔（共存活28只小鼠）中，每孔100μL；（2）用封口膜封板后放入37℃CO2温箱孵育1小时；（3）PBST洗板6次；（4）按1:5000稀释后加入羊抗鼠二抗，另取4孔分别只加入二抗和酶结合物（为验证包被的灭活病毒是否与二抗结合以及与酶结合物的反应情况，酶结合物为试剂盒中自带对照）；（5）用封口膜封板后放入37℃CO2温箱孵育30min；（6）PBST洗板6次；（7）加显色液避光显色5min，每孔加100μL；（8）加终止液50μL，立即进行下一步操作；（9）用多功能酶标仪测定其OD450值。4.3.4免疫血清检测结果的统计学分析根据4.3.3测得的待检血清的OD450值，使用SPSS软件对各组数据进行分析（Student'sttest）。4.4实验结果4.4.1血清ELISA试剂盒检测结果（OD450值）将酶标仪检测结果（OD450）绘制成柱状图，以便进行进一步分析。图示如下。36 图4-1ELISA试剂盒检测血清抗体水平Figure4-1.DetectionofserumantibodylevelsbyELISAtestkit.图4-1中，字母b的含义为相对于a差异极显著（p<0.0001，****）。由图4-1可见，除阴性对照组（Tris组）外，其余各组在0-56d的血清抗体水平均在持续上升。与阴性对照组比较56d时各组血清抗体水平可得，抗体水平差异均极显著。37 4.5分析与讨论首次免疫56天后即二免28天后六组小鼠存活28只，只有G+BB+ISA组在免疫后一周内死亡两只，剖检未见明显器官病变，推测死亡原因可能是死于免疫后的应激反应。其余存活小鼠生长状态良好。总的小鼠存活率为93.33%，除去对照组（Tris-cl组和商品灭活苗组）外，仅考虑使用以含目的蛋白为免疫原免疫的各组小鼠，其存活率则为90%，由于商品狂犬病病毒中和抗体ELISA检测试剂盒所测的是各组免疫血清与试剂盒中预包被的灭活病毒反应后的OD450值，从而利用该值间接反映待检血清中的抗体与病毒的特异性反应情况。由免疫后血清的OD450值可以看出，除阴性对照组外，其余各组在一免后均有不同程度的抗体反应产生，而二免过后抗体水平继续呈上升水平。通过SPSS软件对各组数据进行统计学分析（Ttest）后可得：各组分别与阴性对照组比较后，差异性均极显著（p<0.0001,****）。其中，商品灭活苗组（PC），G+BI+ISA组，G+BB+ISA组小鼠免疫血清所产生的抗体水平要高于G+BI+Tris组，G+BB+Tris组的抗体水平，说明添加佐剂的组所产生的抗体水平要高于仅添加免疫增强剂的组，仅添加免疫增强剂的两组抗体水平差异不大。然而从各组总的抗体水平来看，本试验中试制狂犬病亚单位疫苗所产生的抗体水平仍低于商品灭活苗。但本研究中所得到的实验结果为该类疫苗的后续研发，尤其是利用原核表达系统所表达的蛋白作为抗原的研究中，奠定了一定的实验基础。38 结论本研究成功构建了狂犬病病毒G蛋白与大肠杆菌表达载体pET-28a的重组表达载体，并实现了该重组蛋白的可溶性表达，蛋白经纯化后作为免疫原，与相应的佐剂试制疫苗对小鼠进行免疫，经商品化抗体检测试剂盒检测，结果表明小鼠经该试制疫苗免疫后产生了特异性抗体反应，这为后续新型基因工程亚单位疫苗的研发奠定了实验基础。39 参考文献扈荣良.2012.狂犬病免疫和疫苗研究进展[会议论文].北京：中国狂犬病年会.解庭波.2008.大肠杆菌表达系统的研究进展.长江大学学报c:自然科学版,5(3):77-82.李露,王化磊,赵国星,齐瑛琳,郑学星,冯娜,赵永坤,王铁成,李忠义,高玉伟.2014.3株我国狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的培养及生长特性.中国生物制品学杂志,27(5):612-616.齐瑛琳.2015.狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价[博士学位论文].长春:吉林大学.祁浩,刘新利.2016.大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展.安徽农业科学,44(17):4-6.苏鹏,龚国利.2017.优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展.生物技术通报,33(2):16-23.许崇利,杨梅,许崇波.2010.大肠杆菌表达系统的影响因素.中国动物检疫,27(8):66-68.殷相平.2011.动物狂犬病基因工程亚单位疫苗研究[博士学位论文].兰州:甘肃农业大学.俞永新.2009.狂犬病和狂犬病疫苗:中国医药科技出版社.Abraham,G.,Banerjee,A.K.1976.Sequentialtranscriptionofthegenesofvesicularstomatitisvirus.ProcNatlAcadSciUSA,73(5):1504-8.Arnau,J.,Lauritzen,C.,Petersen,G.E.,Pedersen,J.2006.Currentstrategiesfortheuseofaffinitytagsandtagremovalforthepurificationofrecombinantproteins.ProteinExprPurif,48(1):1-13.Banerjee,A.K.,Barik,S.1992.GeneexpressionofvesicularstomatitisvirusgenomeRNA.Virology,188(2):417-28.Bearer,E.L.,Breakefield,X.O.,Schuback,D.,Reese,T.S.,Lavail,J.H.2000.Retrogradeaxonaltransportofherpessimplexvirus:evidenceforasinglemechanismandarolefortegument.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,97(14):8146.Black,J.G.,Lawson,K.F.1980.Thesafetyandefficacyofimmunizingfoxes(Vulpesvulpes)usingbaitcontainingattenuatedrabiesvirusvaccine.CanadianJournalofComparativeMedicineRevueCanadienneDeMedecineComparee,44(2):169-76.Blanc,I.L.,Luyet,P.,V,Ferguson,C.,Emans,N.,Petiot,A.,Mayran,N.,Demaurex,N.,Faure,J.,Sadoul,R.2005.Endosome-to-cytosoltransportofviralnucleocapsids.NatureCellBiology,7(7):653-64.Both,L.,Banyard,A.C.,Van,D.C.,Horton,D.L.,Ma,J.K.,Fooks,A.R.2012a.Passiveimmunityinthepreventionofrabies.LancetInfectiousDiseases,12(5):397.Both,L.,Banyard,A.C.,vanDolleweerd,C.,Horton,D.L.,Ma,J.K.C.,Fooks,A.R.2012b.Passiveimmunityinthepreventionofrabies.TheLancetInfectiousDiseases,12(5):397-407.Burrage,T.G.,Tignor,G.H.,Smith,A.L.1985.Rabiesvirusbindingatneuromuscularjunctions.VirusRes,2(3):273-289.Carnieli,P.,Jr.,FahlWde,O.,Brandao,P.E.,OliveiraRde,N.,Macedo,C.I.,Durymanova,E.,Castilho,J.G.2010.ComparativeanalysisofrabiesvirusisolatesfromBraziliancanidsandbatsbasedontheG40 geneandG-Lintergenicregion.ArchVirol,155(6):941-8.Choi,J.H.,Lee,S.Y.2004.SecretoryandextracellularproductionofrecombinantproteinsusingEscherichiacoli.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,64(5):625-35.Conzelmann,K.K.,Schnell,M.1994.RescueofsyntheticgenomicRNAanalogsofrabiesvirusbyplasmid-encodedproteins.JVirol,68(2):713-9.Coulon,P.,Rollin,P.E.,Flamand,A.1983.Molecularbasisofrabiesvirusvirulence.II.IdentificationofasiteontheCVSglycoproteinassociatedwithvirulence.JournalofGeneralVirology,64Pt3(MAR):693-696.Davis,A.D.,Jarvis,J.A.,Pouliott,C.E.,Morgan,S.M.,Rudd,R.J.2013.Susceptibilityandpathogenesisoflittlebrownbats(Myotislucifugus)toheterologousandhomologousrabiesviruses.JVirol,87(16):9008-15.Davis,B.M.,Rall,G.F.,Schnell,M.J.2015.EverythingYouAlwaysWantedtoKnowAboutRabiesVirus(ButWereAfraidtoAsk).AnnuRevVirol,2(1):451-71.Delagneau,J.F.,Perrin,P.,Atanasiu,P.1981.Structureoftherabiesvirus:SpatialrelationshipsoftheproteinsG,M1,M2andN.AnnalesDeLinstitutPasteurVirologie,132(4):473-481.Dietzgen,R.G.2012.Morphology,genomeorganization,transcriptionandreplicationofrhabdoviruses.5-11.Dietzgen,R.G.,Kuzmin,I.V.2012.Taxonomyofrhabdoviruses.13-22.Dietzschold,B.,Li,J.,Faber,M.,Schnell,M.2008.Conceptsinthepathogenesisofrabies.FutureVirology,3(5):481.Dong,X.,Tang,B.,Li,J.,Xu,Q.,Fang,S.,Hua,Z.2008.Expressionandpurificationofintactandfunctionalsoybean(Glycinemax)seedferritincomplexinEscherichiacoli.JMicrobiolBiotechnol,18(2):299-307.Esh,J.B.,Cunningham,J.G.,Wiktor,T.J.1982.Vaccine-inducedrabiesinfourcats.JournaloftheAmericanVeterinaryMedicalAssociation,180(11):1336-1339.Etessami,R.,Conzelmann,K.K.,Fadai-Ghotbi,B.,Natelson,B.,Tsiang,H.,Ceccaldi,P.E.2000.SpreadandpathogeniccharacteristicsofaG-deficientrabiesvirusrecombinant:aninvitroandinvivostudy.JournalofGeneralVirology,81(Pt9):2147.Finke,S.,Cox,J.H.,Conzelmann,K.K.2000.DifferentialTranscriptionAttenuationofRabiesVirusGenesbyIntergenicRegions:GenerationofRecombinantVirusesOverexpressingthePolymeraseGene.JVirol,74(16):7261.Finke,S.,Mueller-Waldeck,R.,Conzelmann,K.K.2003.Rabiesvirusmatrixproteinregulatesthebalanceofvirustranscriptionandreplication.JournalofGeneralVirology,84(6):1613-1621.Fontana,D.,Kratje,R.,Etcheverrigaray,M.,Prieto,C.2015.Immunogenicvirus-likeparticlescontinuouslyexpressedinmammaliancellsasaveterinaryrabiesvaccinecandidate.Vaccine,41 33(35):4238-46.Fredericksen,B.L.2014.TheneuroimmuneresponsetoWestNilevirus.JournalofNeuroVirology,20(2):113-121.Gastka,M.,Horvath,J.,Lentz,T.L.1996.Rabiesvirusbindingtothenicotinicacetylcholinereceptoralphasubunitdemonstratedbyvirusoverlayproteinbindingassay.JournalofGeneralVirology,77(10):2437-2440.Gaudin,Y.,Ruigrok,R.W.,Knossow,M.,Flamand,A.1993.Low-pHconformationalchangesofrabiesvirusglycoproteinandtheirroleinmembranefusion.JVirol,67(3):1365-72.Gaudin,Y.,Ruigrok,R.W.,Tuffereau,C.,Knossow,M.,Flamand,A.1992.Rabiesvirusglycoproteinisatrimer.Virology,187(2):627-32.Gaudin,Y.,Tuffereau,C.,Durrer,P.,Flamand,A.,Ruigrok,R.W.1995.Biologicalfunctionofthelow-pH,fusion-inactiveconformationofrabiesvirusglycoprotein(G):Gistransportedinafusion-inactivestate-likeconformation.JVirol,69(9):5528-34.Georgiou,G.,Segatori,L.2005.Preparativeexpressionofsecretedproteinsinbacteria:statusreportandfutureprospects.CurrentOpinioninBiotechnology,16(5):538.Hampson,K.,Coudeville,L.,Lembo,T.,Sambo,M.,Kieffer,A.,Attlan,M.,Barrat,J.,Blanton,J.D.,Briggs,D.J.,Cleaveland,S.etal.2015.Estimatingtheglobalburdenofendemiccaninerabies.PLoSNeglTropDis,9(4):e0003709.Hampson,K.,Dobson,A.,Kaare,M.,Dushoff,J.,Magoto,M.,Sindoya,E.,Cleaveland,S.2008.Rabiesexposures,post-exposureprophylaxisanddeathsinaregionofendemiccaninerabies.PLoSNeglTropDis,2(11):e339.Ito,N.,Takayama,M.,Yamada,K.,Sugiyama,M.,Minamoto,N.2001.RescueofrabiesvirusfromclonedcDNAandidentificationofthepathogenicity-relatedgene:glycoproteingeneisassociatedwithvirulenceforadultmice.JVirol,75(19):9121-8.Ivanov,I.,Yabukarski,F.,Ruigrok,R.W.H.,Jamin,M.2011.Structuralinsightsintotherhabdovirustranscription/replicationcomplex.VirusRes,162(1-2):126.Johnson,N.,Cunningham,A.F.,Fooks,A.R.2010.Theimmuneresponsetorabiesvirusinfectionandvaccination.Vaccine,28(23):3896-901.Johnson,R.T.1998.Viralinfectionsofthenervoussystem.BirthDefectsOriginalArticle,7(1):56-63.Knobel,D.L.,Cleaveland,S.,Coleman,P.G.,Fevre,E.M.,Meltzer,M.I.,Miranda,M.E.,Shaw,A.,Zinsstag,J.,Meslin,F.X.2005.Re-evaluatingtheburdenofrabiesinAfricaandAsia.BullWorldHealthOrgan,83(5):360-8.Koraka,P.,Bosch,B.J.,Cox,M.,Chubet,R.,Amerongen,G.V.,Lövgren-Bengtsson,K.,Martina,B.E.E.,Roose,J.,Rottier,P.J.M.,Osterhaus,A.D.M.E.2014.Arecombinantrabiesvaccineexpressingthetrimericformoftheglycoproteinconfersenhancedimmunogenicityandprotectioninoutbredmice.42 Vaccine,32(36):4644-50.Lafay,F.,Coulon,P.,Astic,L.,Saucier,D.,Riche,D.,Holley,A.,Flamand,A.1991.SpreadoftheCVSstrainofrabiesvirusandoftheavirulentmutantAvO1alongtheolfactorypathwaysofthemouseafterintranasalinoculation.Virology,183(1):320-30.Lebendiker,M.,Danieli,T.2014.Productionofprone-to-aggregateproteins.FebsLetters,588(2):236.Lenard,J.,Vanderoef,R.1990.Localizationofthemembrane-associatedregionofvesicularstomatitisvirusMproteinattheNterminus,usingthehydrophobic,photoreactiveprobe125I-TID.JVirol,64(7):3486-91.Lentz,T.L.,Burrage,T.G.,Smith,A.L.,Crick,J.,Tignor,G.H.1982.IstheAcetylcholineReceptoraRabiesVirusReceptor?Science,215(4529):182-4.Li,X.,Luo,J.,Wang,S.,Shen,Y.,Qiu,Y.,Wang,X.,Deng,X.,Liu,X.,Bao,W.,Liu,P.etal.2010.Engineering,expression,andimmuno-characterizationofrecombinantproteincomprisingmulti-neutralizationsitesofrabiesvirusglycoprotein.ProteinExprPurif,70(2):179-83.Li,Z.,Cheng,Y.,Xi,H.,Gu,T.,Yuan,R.,Chen,X.,Jiang,C.,Kong,W.,Wu,Y.2015.AnovelvariableantibodyfragmentdimerizedbyleucinezipperswithenhancedneutralizingpotencyagainstrabiesvirusGproteincomparedtoitscorrespondingsingle-chainvariableantibodyfragment.MolImmunol,68(2PtA):168.Listed,N.1992.WHOExpertCommitteeonRabies:WorldHealthOrganTechRepSer:1-84.Liu,P.,Yang,J.,Wu,X.,Fu,Z.F.2004.Interactionsamongstrabiesvirusnucleoprotein,phosphoproteinandgenomicRNAinvirus-infectedandtransfectedcells.JournalofGeneralVirology,85(85):3725-3734.Maramorosch,K.,Shatkin,A.J.,Murphy,F.A.,Maramorosch,K.,Shatkin,A.J.,Murphy,F.A.2009.Advancesinvirusresearch.Volume73:AcademicPress:2262.Marston,D.A.,McElhinney,L.M.,Banyard,A.C.,Horton,D.L.,Nunez,A.,Koser,M.L.,Schnell,M.J.,Fooks,A.R.2013.Interspeciesproteinsubstitutiontoinvestigatetheroleofthelyssavirusglycoprotein.JGenVirol,94(Pt2):284-92.Matsumoto,T.,Ahmed,K.,Wimalaratne,O.,Yamada,K.,Nanayakkara,S.,Perera,D.,Karunanayake,D.,Nishizono,A.2011.Whole-genomeanalysisofahumanrabiesvirusfromSriLanka.ArchVirol,156(4):659-69.McElhinney,L.M.,Marston,D.A.,Freuling,C.M.,Cragg,W.,Stankov,S.,Lalosevic,D.,Lalosevic,V.,Muller,T.,Fooks,A.R.2011.MoleculardiversityandevolutionaryhistoryofrabiesvirusstrainscirculatingintheBalkans.JGenVirol,92(Pt9):2171-80.Mebatsion,T.,König,M.,Conzelmann,K.K.1996.BuddingofRabiesVirusParticlesintheAbsenceoftheSpikeGlycoprotein.Cell,84(6):941-951.Mebatsion,T.,Weiland,F.,Conzelmann,K.K.1999a.MatrixProteinofRabiesVirusIsResponsiblefor43 theAssemblyandBuddingofBullet-ShapedParticlesandInteractswiththeTransmembraneSpikeGlycoproteinG.JVirol,73(1):242.Mebatsion,T.,Weiland,F.,Conzelmann,K.K.1999b.Matrixproteinofrabiesvirusisresponsiblefortheassemblyandbuddingofbullet-shapedparticlesandinteractswiththetransmembranespikeglycoproteinG.JVirol,73(1):242-50.Meslin,F.X.,Kaplan,M.M.,Koprowski,H.1996.LaboratoryTechniquesinrabies/editedbyF.X.Meslin,M.M.Kaplan,H.Koprowski.GenevaWorldHealthOrganization.Nagaraja,T.,Madhusudana,S.,Desai,A.2008.Molecularcharacterizationofthefull-lengthgenomeofarabiesvirusisolatefromIndia.VirusGenes,36(3):449-59.Nuc,P.,Nuc,K.2006.[RecombinantproteinproductioninEscherichiacoli].PostepyBiochemii,52(4):448-456.O’Donnell,L.A.,Rall,G.F.2010.BlueMoonNeurovirology:TheMeritsofStudyingRareCNSDiseasesofViralOrigin.JournalofNeuroimmunePharmacology,5(3):443-455.Okumura,A.,Harty,R.N.2011.Rabiesvirusassemblyandbudding.AdvancesinVirusResearch,79(79):23-32.Perrin,P.,Thibodeau,L.,Sureau,P.1985.Rabiesimmunosome(subunitvaccine)structureandimmunogenicity.Pre-andpost-exposureprotectionstudies.Vaccine,3(4):325-332.Preuss,M.A.,Faber,M.L.,Tan,G.S.,Bette,M.,Dietzschold,B.,Weihe,E.,Schnell,M.J.2009.Intravenousinoculationofabat-associatedrabiesviruscauseslethalencephalopathyinmicethroughinvasionofthebrainvianeurosecretoryhypothalamicfibers.PlosPathogens,5(6):e1000485.Rahmeh,A.A.,Schenk,A.D.,Danek,E.I.,Kranzusch,P.J.,Liang,B.,Walz,T.,Whelan,S.P.2010.MoleculararchitectureofthevesicularstomatitisvirusRNApolymerase.ProcNatlAcadSciUSA,107(46):20075-80.Rieder,M.,Conzelmann,K.K.2011.Interferoninrabiesvirusinfection.AdvancesinVirusResearch,79(79):91.Rupprecht,C.,Kuzmin,I.,Meslin,F.2017.Lyssavirusesandrabies:currentconundrums,concerns,contradictionsandcontroversies.F1000Res,6184.Schnell,M.J.,Mcgettigan,J.P.,Wirblich,C.,Papaneri,A.2009.Thecellbiologyofrabiesvirus:usingstealthtoreachthebrain.NatureReviewsMicrobiology,8(1):51-61.Schnell,M.J.,McGettigan,J.P.,Wirblich,C.,Papaneri,A.2010.Thecellbiologyofrabiesvirus:usingstealthtoreachthebrain.NatRevMicrobiol,8(1):51-61.Schnell,M.J.,Tan,G.S.,Dietzschold,B.2005.Theapplicationofreversegeneticstechnologyinthestudyofrabiesvirus(RV)pathogenesisandforthedevelopmentofnovelRVvaccines.JournalofNeuroVirology,11(1):76-81.Schumacher,C.L.,Coulon,P.,Lafay,F.,Bénéjean,J.,Aubert,M.F.,Barrat,J.,Aubert,A.,Flamand,A.44 1993.SAG-2oralrabiesvaccine.OnderstepoortJournalofVeterinaryResearch,60(4):459.Steele,J.H.&Fernandez,P.J.(1991)Historyofrabiesandglobalaspects.In:TheNaturalHistoryofRabies.Ed:Baer,G.M.BocaRaton,FL,CRCPress,pp.415-425.TalKramer,L.W.E.2013.DirectionalSpreadofAlphaherpesvirusesintheNervousSystem.Viruses,5(2):678-707.Ugolini,G.2011.Rabiesvirusasatransneuronaltracerofneuronalconnections.AdvancesinVirusResearch,79165.Whetstone,C.A.,Bunn,T.O.,Emmons,R.W.,Wiktor,T.J.1984.Useofmonoclonalantibodiestoconfirmvaccine-inducedrabiesintendogs,twocats,andonefox.JournaloftheAmericanVeterinaryMedicalAssociation,185(3):285.WHO.Rabiesvaccines:WHOpositionpaper-recommendations.Vaccine,2010;28(44):7140-2.Winkler,W.G.,Fashinell,T.R.,Leffingwell,L.,Howard,P.,Conomy,P.1973.Airbornerabiestransmissioninalaboratoryworker.Jama,226(10):1219-21.Wunner,W.H.,Reagan,K.J.,Koprowski,H.1984.Characterizationofsaturablebindingsitesforrabiesvirus.JVirol,50(3):691-7.Xue,X.H.,Zheng,X.X.,Wang,H.L.,Ma,J.Z.,Li,L.,Gai,W.W.,Wang,T.C.,Yang,S.T.,Xia,X.Z.2014.AninactivatedrecombinantrabiesCVS-11virusexpressingtwocopiesoftheglycoproteinelicitsahigherlevelofneutralizingantibodiesandprovidesbetterprotectioninmice.VirusGenes,48(3):411-20.Zakowski,J.J.,Wagner,R.R.1980.Localizationofmembrane-associatedproteinsinvesicularstomatitisvirusbyuseofhydrophobicmembraneprobesandcross-linkingreagents.JVirol,36(1):93-102.Zhu,W.Y.,Liang,G.D.2012.CurrentstatusofcaninerabiesinChina.BiomedEnvironSci,25(5):602-5.45 缩略词英文缩写英文全称中文全称AEC3-amino-9-ethylcarbazole3-氨基-9-乙基咔唑BCAbicinchoninicacid二喹啉甲酸EBEthidiumbromide溴化乙锭ELISAEnzyme-LinkedImmunoSorbentAssay酶联免疫吸附测定法Hclhydrochloricacid盐酸IPTGIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷KanKanamycin卡那霉素kDaKilodalton千道尔顿LLiter升LBLuria-bertanimediumLB-培养基mAbMonoclonalantibody单克隆抗体ODOpticaldensity光密度PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphatebufferedsaline磷酸缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RABVRabiesVirus狂犬病病毒rpmRevolutionsperminute转速/分钟SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠NNNN'-四甲基氨基甲烷TEMEDNNNN'-tetramethylaminomethaneTrisTri(hydroxymethy)aminomet-hane三（羟甲基）氨基盐酸盐UUnit单位46 附录附录1TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒（UniversalDNAPurificationKit）使用说明书具体操作步骤如下：（1）PCR产物用1g/L琼脂糖凝胶在新配制的l×TAEBuffer中进行电泳；（2）在紫外灯下，尽可能快地从琼脂糖凝胶上将单一的目的基因条带切下（尽量切除多余部分），置于灭菌的1.5mLEP管中；（3）计算凝胶重量，按照DNA凝胶的密度都可以近似为1g/mL，换算出凝胶体积；（4）柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500µL平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，弃去收集管中的液体，重新把吸附柱放入收集管中；（需使用当天处理过的柱子）（5）向胶块中加入等体积的PCbuffer（如果琼脂糖凝胶重量为0.1g，则其体积可以视作100µL，需加入100µLPC溶液），50℃水浴放置大约10min，期间需不断温和翻转EP管，以确保凝胶充分融化。一次只能转移800µL以内凝胶熔液至柱子中，体积超出时可继续重复本过程至所有的溶液都经过柱子；（若胶块体积过大，可事先将胶块切碎）（6）将上述所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；（7）向吸附柱CB2中加入600µL漂洗液PW（使用前应确认已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；（8）重复操作步骤（7）；（9）将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，尽去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。（10）将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量（不少于30µL）的超纯水洗脱（超纯水可提前放入65-70℃水浴锅中预热），室温放置2min。12,000rpm（~13,400×g）离心2min，收集DNA溶液。（11）紫外分光光度计检测核酸含量，标注于EP管管体。可用于进行后续实验或-20℃贮存备用。47 附录2AEC底物显色试剂盒说明书规格：1ml、10ml内容成分：溶液A浓缩液（20×）1ml/10ml；溶液B浓缩液（20×）1ml/10ml；溶液C浓缩液（20×）1ml/10ml；保存条件：2-8℃避光保存，复检期至少1年。产品简介：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)是过氧化物酶(Peroxidase)的生色底物，在过氧化物酶的催化下，过氧化氢氧化AEC形成稳定的红色沉淀产物。该红色产物不溶于水，但溶于有机溶剂。该AEC底物显色试剂盒加入了增强显色试剂，敏感度大大提高。产品操作便捷，显色清晰，重复性好，适用于HRP系统的IHC和WesternBlot实验的酶促显色。使用说明：1．工作液配制：取850ul无菌双蒸水，依次加入50ul溶液A、50ul溶液B、50ul溶液C、混合均匀，即配成AEC工作液。如需要更大体积工作液，可按相应比例放大。此溶液必须现用现配，配好后避光保存，半小时内使用，过期后请将剩余的液体废弃。2.显色：1）蛋白质印迹膜显色：将配制好的工作液滴加在印迹膜上（或将印迹膜浸入AEC工作液中），显色时间一般为10-30min。显色完毕后，将膜浸入蒸馏水中，终止反应。2）组织切片染色：向组织切片上加入适量AEC工作液，确保能充分覆盖样品。室温孵育10-30min，避免光照，直至显色至预期深浅。可在显微镜下观察控制显色时间。显色后用蒸馏水洗涤即可终止显色反应。3）对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可对其进行其他染料复染。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。注意事项：1.由于AEC生成的颜色产物为脂溶性，因此用于IHC显色后不适合梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，须用水性封片剂封片。2.根据情况自行优化实验条件，调整显色时间，获得最佳显色效果。3.AEC有一定毒性，操作时请采取必要的防护措施。48 附录3BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书品牌：solarbio货号：PC0020保存条件：4℃产品内容：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫蓝色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。常用浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。操作说明：微孔酶标仪法1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。2.稀释标准品：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4，6，8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。3.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。4.各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。分光光度计法如没有酶标仪，可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。步骤如下：1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作49 液室温24小时内稳定。2.稀释标准品：取100微升BSA标准品用PBS稀释至1ml（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。3.取八支（或者更多）5ml离心管，标上号，按下表加入试剂。50 致谢回首三年的硕士研究生生涯，我从一个初出茅庐的大学生，逐步的迈入科学研究的门槛，开始像一个蹒跚学步的孩童一般，踮起脚尖试图窥探科学世界里的缤纷色彩。三年的时光如白驹过隙，匆匆流逝。在这三年里，我独自从家乡的中原腹地前往关中秦岭北麓的西北农林科技大学求学，在西农的一年时间里，历经秋冬春夏，领略了西北的自然美景和风土人情，同时也修完了十多门研究生课程，在专业知识上有了新的提升。美丽的西农以其优良的学习风气、严谨的科研氛围教我求学，以其博大包容的胸襟与情怀、简朴充实的校园生活育我成长。而我经过三年的磨砺也从一个略显青涩的年轻人变得逐渐稳重和踏实。我笃信，西农“诚，朴，勇，毅”的校训将继续指导我人生的航向。值此毕业论文收尾之际，我谨向所有关心、爱护、帮助过我的老师和同学表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。首先感谢张改平院士团队以及我的导师张改平院士，在他的渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，为人正直大气的人格魅力影响下，我得以更加全面的成长进步，从学术到个人修养多方面提升自我，我一定会谨遵导师的教诲：“做学问如同做人，要有远大的理想和踏踏实实的做一些工作，争取对社会做一点贡献”。特别感谢我的指导老师刘运超，刘老师平日待我如兄长一般，不仅对我硕士期间课题以及平时试验进行了悉心的指导，同时他的正直稳重的性格，细致缜密的思维令我受益匪浅，此外我还要感谢他对我实验设计和论文撰写的指导和建议。同时感谢魏蔷老师在我的文章发表期间所付出的辛勤汗水，没有她的悉心指导，我无法如此顺利的完成文章投稿及发表。感谢河南省动物免疫学重点实验室新型疫苗课题组的各位师兄师姐们平日里的帮助与指导，在此特别感谢陈玉梅和刘畅两位师姐，是你们教会了我作为一个研究生应该具备的基本实验素养。感谢蒋大伟师兄，李栋梁师兄，冯华师兄，王彦伟师兄，姬鹏超师姐在科研生活中对我的帮助和建议。感谢在我刚刚进入实验室时，在生活和学习道路上给予我关心，帮助，以及指点的迟佳琦师姐，殷萌琪师姐，万博师兄，谢谢你们的关怀与照顾，让我对科研与人生之路都充满了信心。感谢王寅彪师兄，王耀师兄，刘肖师兄在我的初期实验期间的帮助和建议。感谢同门师姐李华玮，宿靖伟，党露；同校师兄黄柏成，刘宝元；同校师姐陈宜阳，王立珍；同校同学彭先启，徐德鹏，李鹏飞，赵蕾，史云鹏，宋林林，侯高鹏；实验室同门侯婕，丁培阳，张雨杭，高月，许倩茹，李会珍；师妹南靓靓，李亚菲，宋利51 娜，任婷婷，师弟王冬雨，杨棋，崔颖磊，薛正飞。在学习和生活中，有你们相伴，为生活增添了许多欢声笑语。我仍要感谢我另一位恩师，西北农林科技大学动物医学院的周恩民教授，通过您的授课，您主持的组会，以及在日常工作学习中常常告诫我们作为一个科研工作者，无论做什么都要“makesense”的实事求是的科学的态度，都使我受益匪浅。感谢穆杨老师从我入校起对我的点滴帮助，我都将铭记于心。感谢免疫生物学实验室的各位老师和同学的提携与帮助，因此我在校的时间虽短，但收获良多。感谢河南省动物免疫学重点实验室的各位领导老师和同学，有你们的帮助与合作，我才能顺利走到今天。尤其感谢王建中老师和刘艳梅老师的辛勤劳动，您的辛劳与汗水为我们提供了良好的实验材料，为实验的顺利进行作出了不可磨灭的贡献。最后我要感谢我的父亲母亲在生活上给予我无微不至的关怀和照顾，竭力为我创造出良好的生活和学习条件，为我铺平一条求学的坦途，使我可以更加专心的投入到科研工作中去，在精神上支持我、鼓励我，让我有不畏任何艰险的决心，有你们的陪伴，我一定会继续勇往直前。王攀2017.0552 作者简介王攀，男，汉族，1988年4月出生，河南省郑州市人。2014年毕业于河南农业大学牧医工程学院动物医学专业，获农学学士学位。同年考入西北农林科技大学,于动物医学院预防兽医学专业攻读硕士学位，师从中国工程院院士张改平，研究方向为兽医免疫学方向，硕士期间主要从事狂犬病基因工程亚单位疫苗的相关研究。硕士期间以第一作者发表学术论文一篇：王攀，刘运超，魏蔷，柴书军，陈玉梅，张改平.狂犬病病毒G蛋白的原核表达及反应原性分析.河南农业科学，2017,46（4）：108-112.53