大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养和鉴定

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1、大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养和鉴［摘要］目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)体夕卜分离培养方法。方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物，并进行成脂、成骨分化诱导。结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长。生长曲线呈S形，细胞周期显示86.02%P3代细胞为G0/G1期，保持活跃的扩增能力。BMSCs高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45o成脂诱导21d后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴

2、。成骨诱导21d后，可见大量橘红色矿化结节形成。结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCso［关键词］骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；鉴定［中图分类号］R329.2［文献标识码］A［文章编号］1673-9701(2014)01-0007-04BMSCs具有高度增殖的能力、体外基因转移效率高以及多向分化潜能等优点［1-2］,使其成为组织工程、细胞替代治疗等领域的首选种子细胞。但是骨髓中的间充质干细胞含量极低［3］,且其含量随年龄增长而逐渐减少［4］,需经体外分离、纯化、扩增为纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞才能满足组织工程需求。实验旨在建立一套简便有效的BMSCs

3、原代培养方法，为后续实验做好准备。1材料与方法1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量100g,由浙江省实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。1.2时间及地点于2013年1〜6月在中国人民解放军第一一七医院干细胞治疗中心完成。1.3实验主要试剂低糖DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/链霉素(吉诺生物)，优质胎牛血清(Gibco),anti-CD45、anti-CD90(BD),anti~CD34(SantaCruz),anti~CD44(Abeam),细胞周期即时检测试剂盒(凯基生物)，

4、成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红0(Cyagen公司)。1.4实验方法1.4.1BMSCs的原代分离培养用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠后，置于75%的乙醇中浸泡7min。无菌条件下分离股骨和胫骨，眼科剪切除两端骨肪，用2.5mL注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，待骨髓腔变白。充分吹打混匀，经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块。收集细胞悬液于15mL离心管中，400g室温离心5mine离心后去上清，用5mL完全培养液重悬，混匀，转移至25cm培养瓶中，置于37°C.体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。2d后首次全量换液

5、，以后每3天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。1.4.2BMSCs的纯化扩增待细胞融合至80%开始传代，PBS冲洗。加入1.0mL预热的0.25%胰酶-0.02%EDTA,轻轻摇动培养瓶，室温孵育0.5min,待镜下胞质回缩后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，并轻轻吹打培养瓶底。将细胞悬液转移至15mL离心管，400g室温离心5min,弃上清，完全培养液重悬，以1：2或1：3比例进行传代培养。此时细胞记为P1,以后每周换液2次，待细胞融合达80%后，重复上述步骤进行传代，依次记为P2、P3等。1.4.3BMSCs的生长曲线测定取生长良好的第3代细胞，0.

6、25%胰酶-0.02%EDTA常规消化，以2X104/mL接种于24孔板，每天取3孔消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续8do以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘生长曲线。1.4.4流式细胞仪检测细胞周期取生长状态良好的第3代BMSCs,常规消化，制成单细胞悬液，将200uL4°C预冷的乙醇与细胞悬液均匀固定，室温孵育10min,加入RnaseA200uL,尽量避免产生气泡，室温孵育10min,加入碘化丙噪300UL,室温避光孵育15min,上机检测。1.4.5流式细胞仪检测细胞表面标记待第3代BMSCs融合至80%,常规消化制成单细胞悬液，分装至EP管中。于待检测的样本中各加

7、入100uLPBS重悬，分别加入CD34,CD44,CD45,CD90一抗及同型对照10uL,充分混匀，室温避光孵育30min后，用PES洗涤2次，400g,室温离心5min,弃上清，每测试管加500uLPBS,充分混匀，流式细胞仪检测。1.4.6成脂肪细胞诱导分化待培养的P3BMSCs生长至80%融合，常规消化，以2X105/孔密度接种于6孔培养板，每3天换新鲜的基础培养液，待细胞完全融合后，实验组加入2mL成脂肪诱导分化培养液A,3d后将分化诱导液换为成脂肪诱导分化培养液B,