自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病4 例

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中国组织工程研究与临床康复第12卷第43期2008–10–21出版JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchOctober21,2008Vol.12No.43临床医学自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病4例☆李义召1,2，王庆德3，朱士文2，崔贵祥2，谢克勤2，时庆4，侯怀水4，沈伯钧4AutologousbonemesenchymalstemcelltransplantationforAlzheimer’sdiseasein4casesLiYi-zhao1,2,WangQing-de3,ZhuShi-wen2,CuiGui-xiang2,XieKe-qin2,ShiQing4,HouHuai-shui4,ShenBo-jun41CollegeofPublicHealth,ShandongUniversity,Jinan250012,ShandongProvince,China;2TreatmentCenterofStemCells,GreatwallHospitalofJinan,Jinan250022,ShandongProvince,China;3DepartmentofNeurology,HospitalofShandongAluminiumCorporation,Zibo255069,ShandongProvimce,China;4CordBloodBankofQiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,ShandongProvince,ChinaLiYi-zhao☆,Doctor,Chiefphysician,CollegeofPublicHealth,ShandongUniversity,Jinan250012,ShandongProvince,China;TreatmentCenterofStemCells,GreatwallHospitalofJinan,Jinan250022,ShandongProvince,Chinayizhaoli888@yahoo.com.cnReceived:2008-01-22Accepted:2008-08-251山东大学公共卫生学院，山东省济南市250012；2济南长城医院干细胞治疗中心，山东省济南市250022；3山东铝业公司医院神经内科，山东省淄博市255069；4山东大学齐鲁医院脐血库，山东省济南市250012李义召☆，男，1964年生，山东省菏泽市人，汉族，2005年山东大学毕业，博士，主任医师，主要从事干细胞治疗神经系统变性疾病研究。yizhaoli888@yahoo.com.cn中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:1673-8225(2008)43-08431-03收稿日期：2008-01-22修回日期：2008-08-25(08-50-1-594/G·A)Abstract:TenpatientswithAlzheimer’sdiseaseweredividedintostemcelltreatmentinsitugroup(n=6),whichunderwentrecombinedgranulocytecolony-stimulatingfactortreatment(G-CSFgroup),150μg,onceperday,with7-10daysasonetreatmentcourse,combinedwithSalviamiltiorrhizaintravenousinjection(20mL/d)for10days;autologousbonemesenchymalstemcelltreatmentgroup(MSCs,n=4),inwhichbonemarrow(230-330mL)washarvestedfromthepatients’iliaandthenthemononuclearcellswereisolatedbydensitygradientcentrifugation,andthemononuclearcellswereinjectedintravenouslyorintosubarachnoidspacebylumberpunctureonceorseveraltimes.Inaddition,theG-CSFwassubcutaneouslyinjectedonthesameday(stemcelltreatmentinsitu).Beforeandafterstemcelltreatment,mini-mentalstateexamination(MMSE),AbilityofDailyLiving(ADL)andperipheralbloodcellsweremeasured,andneuralfunctionandside-effectswereassessedrespectively.Therewerenoside-effectsintheG-CSFtreatedpatients,andperipheralbloodleucocytewascountedfor35-40×109L-1.BeforeandthreemonthsafterG-CSFtreatment,theMMSEandADLscoresweresignificantlyimprovedcomparedwithbeforetreatment(P<0.05)respectively.TwocasesintheMSCsgrouphadfever(mentemperatureunder38℃)withlightheadacheandthesymptomrelievedwithouttreatmentwithin24hours.MSCstransplantationiseffectiveandsafeinshort-termforpatientswithAlzheimer’sdisease,andmoreeffectivewhencombinedwithG-CSFtreatment,butlong-termcurativeeffectsneedmoreobservation.LiYZ,WangQD,ZhuSW,CuiGX,XieKQ,ShiQ,HouHS,ShenBJ.AutologousbonemesenchymalstemcelltransplantationforAlzheimer’sdiseasein4cases.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2008;12(43):8431-8433[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-43/43k-8431(ps).pdf]摘要：阿尔茨海默病患者10例，按治疗方法分为两组：干细胞原位治疗组6例，给予重组人粒细胞集落刺激因子150μg，腹部皮下注射，1次/d，7~10d为1个疗程；同时给予丹参注射液20mL，静脉滴注，1次/d，10d为1个疗程；自体骨髓干细胞治疗组4例，经骨髓穿刺采集自体骨髓230~330mL，分离提取骨髓单核细胞后经静脉途径和/或椎管内一次性或分次注射；注射后当日给予干细胞原位治疗。干细胞治疗前、治疗3个月后进行简易智能测量、日常生活活动能力评分及外周血细胞监测，并对患者神经功能变化及不良反应进行评价。干细胞原位治疗组6例患者未发现任何不良反应，外周血白细胞计数控制在(35~40)×109L-1。治疗后3个月时简易智能测量评分及日常生活活动能力评分均高于治疗前（P<0.05）。自体骨髓干细胞治疗组4例患者中发热2例，体温均在38℃以下，且24h后体温恢复正常；有轻微头痛3例，未行治疗24h后缓解。治疗后3个月时简易智能测量评分及日常生活活动能力评分均显著高于治疗前（P<0.01）。骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病近期疗效明显，不良反应较少，与干细胞原位治疗联合应用疗效更佳，其远期疗效还需要进一步随访和观察。关键词：干细胞；骨髓细胞；细胞移植；阿尔茨海默病李义召，王庆德，朱士文，崔贵祥，谢克勤，时庆，侯怀水，沈伯钧.自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病4例[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(43):8431-8433[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-43/43k-8431(ps).pdf]8431ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAHwww.zglckf.com李义召，等.自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病4例0引言当前用于治疗阿尔茨海默病的药物很多，但至今尚无治疗阿尔茨海默病的特效药。有研究表明，神经干细胞对阿尔茨海默病的治疗具有潜在的应用前景[1]。本文观察采用自体骨髓神经干细胞治疗阿尔茨海默病的临床效果及不良反应。1对象和方法对象：选择2004-01/2007-12在济南长城医院干细胞治疗中心住院的阿尔茨海默病患者10例，均符合由美国NINCDS-ADRDA专题工作组推荐的诊断标准。其中男7例，女3例；年龄61~81岁，平均70岁；6例进行干细胞原位治疗，4例进行自体骨髓干细胞移植治疗。患者及家属知情同意并签署手术协议书，治疗方案符合医疗机构管理条例[2]。本组10例患者的详细资料见表1。方法：干细胞原位治疗：给予重组人粒细胞集落刺激因子（吉粒芬，哈药集团生物工程有限公司生产）注射液150μg，腹部皮下注射，1次/d，7~10d为1个疗程；同时给予丹参注射液20mL，静脉滴注，1次/d，10d为1个疗程。自体骨髓干细胞治疗：行骨髓穿刺，采集自体骨髓230~330mL，分离提取骨髓单核细胞，经静脉途径和/或椎管内一次性或分次注射；注射后当日给予干细胞原位治疗。干细胞治疗前和治疗后1，2，3，5，7，14d及1，2，3，4，5，6个月分别对患者神经功能及不良反应进行评价。并进行简易智能测量、日8431ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAH www.zglckf.com李义召，等.自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病4例常生活活动能力评分及外周血细胞监测。病例性别年龄（岁）病程（年）骨髓量(mL)注射细胞数量及注射途径1男612rhG-CSF150μg，腹部皮下注射，1次/d，共10d2男673rhG-CSF150μg，腹部皮下注射，1次/d，共8d3女723.5rhG-CSF150μg，腹部皮下注射，1次/d，共7d4男751.5rhG-CSF150μg，腹部皮下注射，1次/d，共9d5女653rhG-CSF150μg，腹部皮下注射，1次/d，共10d6女702.5rhG-CSF150μg，腹部皮下注射，1次/d，共8d7男782330MNC第1次10.6×107L-1腰穿椎管内，第2次6.8×107L-1腰穿椎管内，第3次4.3×107L-1腰穿椎管内；NC60.4×108L-1第1次腰穿时静脉滴注8男661.5280MNC第1次5.8×107L-1腰穿椎管内，第2次3.7×107L-1腰穿椎管内,第3次3.9×107L-1腰穿椎管内；NC29.7×108L-1第1次腰穿时静脉滴注9男814.5260MNC第1次5.6×107L-1腰穿椎管内，第2次5.3×107L-1腰穿椎管内，NC33.7×108L-1第1次静脉滴注10男682.5280MNC4.2×107L-1腰穿椎管内，NC36.5×108L-1同时静脉滴注两次注射间隔时间为1个月,rhG-CSF:重组人粒细胞集落刺激因子;MNC:单粒细胞；NC：有核细胞表1本组10例进行干细胞治疗的阿尔茨海默病患者的临床资料及治疗方法2结果本组10例进行干细胞治疗的阿尔茨海默病患者的治疗及不良反应见表2。表2本组10例进行干细胞治疗的阿尔茨海默病患者的治疗及随访结果病例不良反应外周血白细胞计数（L-1）治疗后3个月MMSE评分治疗后3个月ADL评分1无35×10918702无39×10915703无37×10919794无40×10916735无36×10917776无40×10916807发热、头痛10×10922848头痛11×10919809无13×109237710发热、头痛10×1092087干细胞原位治疗组：6例患者未发现任何不良反应，外周血白细胞计数控制在（35~40）×109L-1。治疗后3个月时，简易智能测量评分高于治疗前（17.3±3.2，13.6±2.3，P<0.05），日常生活活动能力评分也高于治疗前（75.4±8.52，51.6±7.35，P<0.05）。自体骨髓干细胞治疗组：4例患者中发热2例，体温均在38℃以下，且24h后体温恢复正常；有轻微头痛3例，未行治疗24h后缓解。治疗后3个月时，简易智能测量评分显著高于治疗前（21.6±3.3，14.1±2.6，P<0.01），日常生活活动能力评分也显著高于治疗前（82.5±9.15，50.7±6.96，P<0.01）。3讨论骨髓间充质干细胞作为一种多潜能干细胞对中枢神经系统缺血损伤或外伤等造成的功能缺失治疗作用显著，与其他细胞来源相比具有明显的优点：①获取方便，可从患者本人骨髓取材。②可在体外快速培养扩增，并定向诱导分化。③在宿主脑组织中可长期生存并进行整合。④避开了免疫排斥的难题等。⑤可进行基因工程技术加工。因此，成人骨髓间充质干细胞是一种理想的细胞来源，为神经系统疾病的细胞和基因治疗提供了新的思路和广阔前景[3-4]。骨髓间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，来源于中胚层，在一定诱导条件下可以向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化，同时骨髓间充质干细胞还可以向外胚层的神经细胞分化。因此，骨髓间充质干细胞是细胞治疗和基因治疗的种子细胞之一。大量动物实验已证实[3-5]，骨髓间充质干细胞经上述各种途径移植后均可到达病损部位，并分化成神经干细胞、成熟神经元和胶质细胞，能安全和有效地改善中枢神经损伤后的功能恢复。神经系统干细胞移植的途径包括脑实质内移植、血液内移植和脑脊液内移植。本实验采用干细胞的原位治疗、腰穿蛛网膜下腔移植或静脉内移植方法对阿尔茨海默病患者的临床疗效和不良反应进行了初步观察，取得了一定的临床效果。有实验提示，神经干细胞移植到阿尔茨海默病大鼠脑内1个月后，在阿尔茨海默病大鼠的额叶和海马区存活，并分化成神经元，可与宿主建立突触联系[6]。并可导致乙酰胆碱酯酶纤维密度增加，显著改善阿尔茨海默病大鼠的学习和记忆能力，而且可减少海马中老年斑的沉积和神经元纤维缠结的形成。可能是因为移植后的神经干细胞在局部微环境的作用下，分化成为胆碱能神经元和其他一些神经营养细胞，或通过调节蛋白磷酸化和去磷酸化的从而提高了阿尔茨海默病大鼠的学习和记忆8433ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAH www.zglckf.com李义召，等.自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病4例能力，同时减少了老年斑的沉积和神经元纤维缠结的形成。实验采用干细胞原位治疗组6例未发现任何不良反应，记忆力等认知功能及大小便功能均有不同程度的改善，多数患者在治疗后2周有明显改善，治疗后3个月平均简易智能测量评分较治疗前明显提高，日常生活活动能力明显改善；自体骨髓干细胞治疗组，在干细胞原位治疗的基础上加用自体骨髓间充质干细胞治疗阿尔茨海默病4例，记忆力等认知功能及大小便功能的改善较干细胞原位治疗组更明显，说明联合治疗效果更显著，但还需要大样本前瞻性对照研究进一步证实。骨髓间充质干细胞移植常见的不良反应包括发热（2/4例），多数为低热，伴有头痛（2例），1例于椎管内后出现脑膜刺激征（颈部抵抗、Kernig征阳性）。这些不良反应多在24h内自行消失，严重者需给予相应处理。不良反应的发生可能与单核细胞、粒细胞等释放内源性致热源有关，椎管内注射引起脑膜反应则可能是头痛和脑膜刺激征的原因。骨髓间充质干细胞移植改善神经功能的机制，可能为骨髓间充质干细胞移植后，可源源不断地进入脑组织，遍及全脑，包括大脑皮质、海马、丘脑、脑干和小脑，并分化成神经细胞，呈现中枢神经系统神经元的特征，骨髓间充质干细胞可能通过细胞替代弥补中枢神经系统疾病或损伤引起的神经功能缺损。同时，还可合成细胞外基质，包括Ⅰ型、Ⅳ型胶原蛋白，纤维连接蛋白和基底膜层粘蛋白；分泌多种细胞因子，主要的有白细胞介素7、白细胞介素8、白细胞介素11等白细胞介素及干细胞因子、神经营养因子、集落刺激因子，骨形成蛋白及造血调节分子等。其中骨形成蛋白可触发神经干细胞向神经元分化；集落刺激因子在中枢神经系统是1种生长因子；白细胞介素11对造血细胞和非造血细胞有多种作用，在中枢神经系统，白细胞介素11分布于齿状回颗粒细胞层、海马锥体细胞层、脊髓前角和侧角神经元。体外研究发现，白细胞介素11能促进海马神经元前体细胞增殖，对神经功能的调节具有重要作用。因此，骨髓间充质干细胞还能够通过其自身的合成与分泌功能促进神经组织的自我修复，改善神经功能。近年来研究证实，人及成年动物神经系统中均存在神经干细胞，只是大部分神经干细胞在体内处于静止状态[7]。研究表明神经干细胞在损伤等病理条件下可以增殖，以弥补神经功能和组织学丧失，这显示神经干细胞可能在中枢神经系统损伤后自我修复中有潜在的治疗作用[8]。本实验发现干细胞原位治疗组患者的认知功能及大小便功能均有不同程度的改善，生活质量得到不同程度的提高。可能与增加了病灶区神经干细胞的数量，提高了神经干细胞在中枢神经系统疾病中自我修复的作用，其具体的机制有待进一步探讨。人骨髓间充质干细胞能够分化为神经元样和神经胶质样细胞，其取材容易，体外可迅速培养、扩增，弥补了神经干细胞的诸多缺点，自骨髓间充质干细胞移植又避免了移植后的免疫排斥反应，因此骨髓间充质干细胞作为神经细胞的另一来源，用于神经系统损伤修复的细胞治疗，具有明显的临床应用价值。骨髓间充质干细胞移植治疗神经系统疾病在临床上的应用仍处于起步阶段，其作用机制并不十分明确，移植的途径以及取得显著的治疗效果所需的剂量还需要大样本的研究进一步确认，其远期疗效和安全性需进一步观察和随访。本组资料虽然显示近期有效，安全性较好，但是由于样本较小，观察和随访时间较短，其远期疗效和安全性还需进一步观察。尽管神经干细胞在阿尔茨海默病治疗方面的研究尚处于初级阶段，但它可弥补药物治疗的不足，为阿尔茨海默病的治疗开辟新途径。4参考文献1AsaharaT，KalkaC，IsnerJM.Stemcelltherapyandgenetransferforregenerution.GeneTher2000;7(6):451-4572StateCouncilofthePeople'sRepublicofChina.AdministrativeRegulationsonMedicalInstitution.1994-09-01.http://www.gov.cn/banshi/2005-08/01/content_19113.htm中华人民共和国国务院.医疗机构管理条例.1994-09-01.http://www.gov.cn/banshi/2005-08/01/content_19113.htm3DezawaM,KannoH,HoshinoM,etal.Specificinductionofneuronalcellsfrombonemarrowstromalcellsandapplicationforautologoustransplantation.JClinInvest2004;113(12):1701-17104ChenJ,LiY,WangL,etal.Therapeuticbenefitofintracerebraltransplantationofbonemarrowstromalcellsaftercerebralischemiainrats.JNeurolSci2001;189(1-2):49-575SatakeK,LouJ,LenkeLG.Migrationofmesenchymalstemcellsthroughcerebrospinalfluidintoinjuredspinalcordtissue.Spine2004;29(18):1971-19796WuSL,JinLH,LiZY,etal.ZhongguoLinchuangKangfu2004;8(19):3734-3736吴树亮，金连弘，李竹英,等.阿尔茨海默病动物模型的建立及神经于细胞对阿尔茨海默病的治疗作用[J].中国临床康复,2004,8(19):3734-37367Alvarez-BuyllaA,Garcia-VerdugoJM.Aunifiedhypothesisonthelineageofneuralstemcells.BatRevNeurosci2001;2:287-2938YipS,AboodyKS,BumsM,etal.Neuralstemcellbiologymaybewellsuitedforimprovingbraintumortherapies.CancerJ2003;9(3):189-2048433ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAHwww.zglckf.com李义召，等.自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病4例8433ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAH