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化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾组织CTGFmRNA表达的影响作者：尹智炜高俊杰陈志强孙玉凤丁奇峰王月华张江华【摘要】 观察化瘀通络中药—肾络通对实验性大鼠糖尿病肾病(DN)模型肾功能及肾组织结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达的影响。方法SD大鼠40只随机分为正常组、模型组、对照组和中药组，模型组、对照组和中药组应用链脲佐菌素(STZ)60mg/kg一次性腹腔注射制备大鼠糖尿病模型。中药组给予肾络通煎剂灌胃25g/(kg·d)，对照组给予贝那普利水溶液10mg/(kg·d)，正常组和模型组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃。检测各组大鼠24h尿蛋白、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和肾组织CTGFmRNA的表达。结果模型组24h尿蛋白、BUN、Cr和肾组织CTGFmRNA的表达均显著高于正常组(P<0.01)；对照组和中药组24h尿蛋白、BUN、Cr和肾组织CTGFmRNA的表达与模型组相比显著降低(P<0.01)。结论化瘀通络中药能够显著减少DN模型大鼠24h尿蛋白，保护DN模型大鼠肾脏功能，并可从基因水平显著降低肾组织CTGF的表达，提示下调CTGF的表达可能是化瘀通络中药保护DN模型大鼠肾功能的重要机制。【关键词】糖尿病肾病大鼠SD肾功能结缔组织生长因子 【Abstract】ObjectiveToobserveeffectsofdispersing10 bloodstasisanddredgingcollateral—ShenluotongonrenalfunctionandexpressionofCTGFmRNAindiabeticnephropathy(DN)rats’kidney.MethodsTheratswererandomlydividedintofourgroupsincludingnormalgroup,modelgroup,controlgroupandTraditionalChineseMedicine(TCM)group.TheDNmodelofratwasmadethroughone-timeinjectionofperitonealofstreptozotocin(STZ)60mg/kg.TCMgroupwereintragastricadministratedwithShenluotong25g/kg·d,Controlgroupandthemodelgroupwereintragastricadministratedwithbenazepril10mg/kg·d,Normalgroupandmodelgroupweregivenequivalentphysiologicalsaline.24hoururinaryprotein,ScrandBUNofdifferentgroups,andtheexpressionofCTGFmRNAinnephridialtissueweredetected.ResultsIncomparisonwithnormalgroup,24hoururinaryprotein,Scr,BUNandtheexpressionofCTGFmRNAinnephridialtissueofmodelgroupwereincreasedobviously(P<0.01);Whileincomparisonwithmodelgroup,thoseofTCMandControlgroupweredecreasedobviously(P<0.01).ConclusionDispersingbloodstasisanddredgingcollateralcanreduce24hoururinaryprotein,protecttherenalfunctionanddown-regulatetheexpressionofCTGFmRNAinnephridialtissue.Itindicatedthatdown-regulationtheexpressionofCTGFmaybeanimportantwayofdisperseblood10 stasisanddredgecollateralprotectrats’renalfunction. 【Keywords】Diabeticnephropathy;Rat,SD;Renalfunction;Connectivetissuegrowthfactor 糖尿病肾病(diabeticNephropathy,DN)泛指由于糖尿病导致的肾小球病变，因其明显的变化是细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)增生，所以又称糖尿病肾小球硬化症，是导致慢性肾衰竭(chronicrenalfailure,CRF)的主要原因之一。结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)是近年来研究发现的一种新的生长因子，其相关研究已经成为目前防治脏器纤维化的热点。它对肾细胞的分泌、增生及ECM的合成和降解具有重要的调控作用，其异常表达在肾纤维化进程中起着关键作用［1］。化瘀通络中药—肾络通是我们临床上治疗慢性肾脏疾病的基础方［2］。本实验应用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)制备大鼠糖尿病模型，采用RT-PCR检测化瘀通络中药对其肾组织CTGFmRNA表达的影响，从分子水平探讨化瘀通络中药的可能作用机制，为中药治疗DN提供新的思路。 1材料与方法 1.1动物10 清洁级健康雄性Sprague-Dauley系大鼠40只，体质量(180±10)g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：冀医动管字07259号。 1.2化瘀通络中药 肾络通，由地龙、乌梢蛇、丹参、黄芪等组成，按比例称取后，水煎、过滤，浓缩至含生药1.5g/mL。装入瓶中密封保存于4℃冰箱中。饮片经过鉴定均为正品，由河北医科大学中医院制剂室提供，并经过鉴定均为正品。 1.3造模与分组 大鼠自由饮水，常规饲料适应性喂养1周后，进行尿蛋白定性检测，结果全部为阴性。随机分为正常组、模型组、对照组和中药组，每组10只。除正常组外，其他各组按60mg/kg一次性腹腔注射STZ，自由饮水、摄食，72h后尾静脉取血快速血糖仪测随机血糖，以≥16.7mmol/L为糖尿病模型成模标准［3］。正常组注射相应量0.9%氯化钠注射液。造模各组在糖尿病模型建立后，按血糖水平重新分组，组别与动物数不变。 1.4给药与取材10 成模后1周开始给药，中药组给予肾络通煎剂灌胃25g/(kg·d)，对照组给予贝那普利水溶液10mg/(kg·d)，对照组、中药组用药量均相当于临床人用剂量的20倍。正常组和模型组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃，均每日1次。 1.5取材 给药第16周末，各组大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水收集大鼠24h尿液；10%水合氯醛30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清，然后迅速取肾组织置于液氮中，再转存于-70℃超低温冰箱中待检。 1.6生化指标检测 双缩脲法定量24h尿蛋白，Beckmancx7全自动生化分析仪检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)等生化指标。 1.7CTGFmRNA检测 各组肾组织采用Trizol一步法提取总RNA，CTGF引物由上海中生生物工程公司合成，其序列为5′-GAAAGACAGGTACTAGCTGA-310 ′，5′-CGTACCATATGTTCTGACAG-3′；扩增产物长度为521bp。GAPDH引物序列为5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGA-3′，5′-CACAGTCTTCTGAGTGGCA-3′，扩增产物长度为298bp。选用美国ThermoHybaidPCR仪，反应条为：①cDNA的合成和预变性：42℃,45min；94℃,5min；②PCR扩增：94℃，45s；55.8℃，45s；72℃，45s；共35个循环；③循环完毕后72℃延伸7min。PCR产物的定量分析以GAPDH校正做相对量分析，用图像析处理系统(UVP公司)进行灰度扫描，以CTGF与GAPDH之间光密度的比值表示CTGFmRNA的相对含量。 1.8统计学处理 数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS11.5统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1各组大鼠24h尿蛋白定量比较 见表1。表1各组大鼠24h尿蛋白定量比较（略） 由表10 1可见，模型组较正常组显著升高(P<0.01)，提示糖尿病肾病模型造模成功；对照组、中药(TCM)组与模型组相比明显降低(P<0.01)，而对照组与中药组之间无显著区别(P>0.05)。 2.2各组大鼠Cr和BUN比较 见表2。表2各组大鼠Cr和BUN比较（略） Cr和BUN模型组与正常组相比显著升高(P<0.01)，对照组、中药组与模型组相比明显降低(P<0.01)，但对照组、中药组BUN仍明显高于正常组(P<0.01)，对照组与中药组之间差异无统计学意义(P>0.05)。 2.3各组对大鼠肾组织CTGFmRNA表达的影响 见表3。表3各组对大鼠肾组织CTGFmRNA表达的影响（略） RT-PCR半定量分析显示，模型组大鼠肾组织中CTGFmRNA表达较正常组显著增高(P＜0.01)，CTGF在中药组和对照组大鼠肾组织中表达量均较模型组显著降低(P＜0.01) 3讨论 化瘀通络中药—10 肾络通系经验方，临床治疗多种肾脏病取得了良好效果，对糖尿病肾病蛋白尿的疗效尤为显著。我们提出了结合临床实践,认为糖尿病肾病属于病久瘀血入于肾络，肾络瘀阻所致，属于肾中络脉为病。前期研究证实［4］，化瘀通络中药对高糖诱导足细胞产生MMP9具有调节作用，本实验进一步证实其对DN模型动物的肾功能具有显著的保护作用。 CTGF近年来发现的一种多功能细胞因子，它是一种富含半(CyR61)胱氨酸的多肽，是即刻早期基因CCN家族［包括CTGF、半胱氨酸蛋白61(CYR61)等］成员之一，有介导细胞的迁移、趋化、黏附、积聚，诱导增生、细胞凋亡和胶原生成的作用［1］。CTGF过度表达与增生性或纤维化性疾病的发生密切相关，在体内外转化生长因子β1(TGF-β1)可以特异性地诱导CTGF的表达，反过来CTGF又介导TGF-β对间质细胞的作用，可促进细胞增生和ECM合成等［5］。国内外均有研究报道［6，7］，在糖尿病尿白蛋白正常患者的肾组织中CTGF的表达已显著升高，随着糖尿病肾脏损害的加重CTGF的表达进一步增强，说明CTGF参与DN的发生发展，CTGF的表达高低并与糖尿病肾脏损害的程度密切相关。 在本实验中我们应用化瘀通络中药干预STZ制备的大鼠DN模型，检测了大鼠24h尿蛋白、肾功能(Cr和BUN)以及肾组织CTGFmRNA表达的改变。结果表明，DN模型大鼠肾组织CTGF的表达显著升高，化瘀通络中药能够显著减少DN模型大鼠2410 h尿蛋白，保护DN模型大鼠肾脏功能，并可从基因水平显著降低肾组织CTGF的表达，提示下调CTGF的表达可能是化瘀通络中药保护DN模型大鼠肾功能的重要机制。【参考文献】 ［1］魏晨,赵宗江.结缔组织生长因子在肾纤维化中的作用［J］.中国中西医结合肾病杂志,2005,(2):114-117. ［2］赵玉庸,陈志强,于春泉,等.肾络通治疗系膜增生性肾小球肾炎的临床观察［J］.中国中西医结合杂志,2002,22(12):909-911. ［3］雷作熹,罗仁,董晓蕾,等.STZ诱导糖尿病肾病大鼠模型的建立［J］.中国实验动物学报,2005,13(3):163-165. ［4］白亚玲,赵玉庸,黄海长,等.肾络通对高糖诱导足细胞产生MMP9的调节作用［J］.中国中医基础医学杂志,2005,11(3):180-183. ［5］KothapalliD,GrotendorstGR.CTGFmodulatescellcycleprogressionincAMP-arrestedNRKfibroblasts［J］.CellPhysiol,2000,182(1):119-126.10 ［6］RiserBL,CortesP,DeNichiloM,etal.UrinaryCNN2(CTGF)asapossiblepredictorofdiabeticnephropathy:preliminaryreport.KidneyInt,2003,64(2):451-458. ［7］肖厚勤,张建鄂,丁国华,等.肾脏结缔组织生长因子的检测及其对糖尿病肾病早期诊断的价值［J］.中国糖尿病杂志,2006,14(1):37-40.10
