麦冬水溶性多糖OPB的分离纯化及抗氧化活性研究.doc

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1、麦冬水溶性多糖OPB的分离纯化及抗氧化活性研究【摘要】目的：从麦冬中提取出水溶性粗多糖OP，经分离纯化，得到均一多糖OPB，并研究其组成、性质以及抗氧化能力。方法：粗多糖经DEAESepharoseCL6B柱层析分离纯化得到OPB，经HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法检验其均一性，超氧阴离子清除实验和羟自由基清除实验鉴定其抗氧化能力。结果：OPB是均一组分多糖，GC分析表明它的单糖组成是葡萄糖。结论：OPB有较强的超氧阴离子清除作用。【关键词】麦冬；水溶性多糖；分离纯化；抗氧化活性基金项目:国务院侨办科研基金资助项目(07QZR07);福建省自然科学基金计划资助项目(

2、Z0516009)　　　　麦冬为百合科沿阶草属植物的干燥块根，是常用的滋阴中药，始载于《神农本草经》，有滋阴生津，润肺清心的功能［1］。为了合理利用麦冬资源并寻找新的麦冬有效成份，本文对麦冬粗多糖进行分离纯化，并对其抗氧化活性进行了研究。　　1材料与方法　　1.1材料、试剂与仪器材料：麦冬，购于福建泉州百合药店。试剂与仪器：氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)，脱氧核糖，硫代巴比妥酸(TBA)及还原型辅酶I(NADH·2Na)，标准品为Sigma公司试剂；DEAE-sepharoseCL6B为Pharmacia公司产品；其他试剂均为上海化学试剂有限公

3、司分析纯。MC992自动核酸蛋白分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱，安捷伦HP1100；气相色谱仪，安捷伦6890N。　　1.2实验方法　　1.2.1麦冬粗多糖的提取准确称取麦冬200g，加入2000mL80%乙醇，在50℃水浴中回流提取6h，过滤，将残渣烘干后取100g加入4000mL蒸馏水，90℃恒温水浴下提取2h，过滤，滤液在60℃减压旋转蒸发浓缩至小体积，离心10min(3500r/min)，弃去沉淀物，上清液加入4倍体积无水乙醇，4℃过夜。次日离心，取沉淀，沉淀常规干燥得粗多糖。　　1.2.2粗多糖的DEAESepharoseCL6B柱层析

4、制备500mg麦冬粗多糖溶于10mL蒸馏水，上样，先后用蒸馏水和01MNaCl进行洗脱，流速40mL/h,1管/12min，自动部分收集器收集。用苯酚硫酸法测定糖的分布情况，制定洗脱分布图，按各波峰范围部分收集洗脱液。由分离层析仪中的UV4160A紫外光谱于280nm下同步检测蛋白质，记录仪记录。　　1.2.3多糖样品纯度鉴定方法采用HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法，色谱柱为SUGARKS804，水作流动相，流速1mL/min，柱温50℃，示差检测器检测。　　1.2.4性质分析［2-3］红外光谱分析确定是否含有多糖特征吸收峰；采用气相色谱法(GC)分析糖组成；

5、糖含量测定采用苯酚硫酸法；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。　　1.2.5体外抗氧化实验［4-5］超氧阴离子清除能力实验用样品浓度为0(对照)，25，50，70，100和120mg/mL；羟自由基清除作用样品浓度为0(对照)，1.56，3.125，6.25，12.5，25和50mg/mL。　　2结果与分析　　2.1粗多糖的提取与分离纯化麦冬经水提取，粗多糖得率为28.5%，命名为OP。OP的蒸馏水洗脱液经苯酚硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，但含量较少，暂且不做分析。　　OP经DEAE-SepharoseCL6BNaCl梯度洗脱曲线如图1所示。由图1可以看出，OP经0

6、-1MNaCl梯度洗脱，洗脱液经苯酚硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，紫外检测仪在280nm下也检测到一个蛋白质洗脱峰，并且与糖洗脱曲线相吻合，可能是结合蛋白，收集25-55管洗脱液，透析，浓缩，醇沉，沉淀常规干燥命名为OPB。　　2.2OPB的纯度鉴定配制0.1%的样品液，0.4μm纤维素膜过滤，进样量20μL。OPB的高效液相色谱结果(图2)检测出单一对称峰，证明OPB是纯度较好的样品。OPB的醋酸纤维素薄膜电泳结果只显示一条区带，再次验证OPB为纯度较好的样品。　　2.3OPB的性质分析经苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法检测得出OPB糖含量95.8%，蛋白质含量4%。　

7、　2.3.1OPB的单糖组成分析OPB经酸水解，衍生化后的气相色谱结果如图3所示。由于在衍生物的制备过程中会产生衍生物的异构体，使得色谱分析时每种单糖会产生几个峰，对照标准单糖的气相色谱图，2min前是溶剂峰，5.098min和5.868min出现的峰代表葡萄糖，5.475min出现的峰是内标甘露醇，所以得出OPB由葡萄糖组成。　　图1OP的DEAESepharoseCL6BNaCl洗脱曲线（略）　　图2OPB的HPLC图谱（略）　　图3OPB的GC图谱（略）　　2.3.2OPB的红外光谱分析红外光谱分析表明，OPB在3600-3200cm有-OH吸收峰，在2