新疆天然雪莲与其组织培养物中水溶性多糖的研究

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1、新疆天然雪莲与其组织培养物中水溶性多糖的研究作者：刘春兰杜宁邓义红杨林李阳【摘要】目的对新疆天然雪莲及其组织培养物进行多糖提取分离纯化，为合理利用雪莲提供一定依据。方法雪莲经热水浸提，乙醇沉淀得粗多糖。粗多糖经Sevage法和酶法联合脱蛋白，得初步纯化的新疆天然雪莲多糖和培养雪莲多糖。结果纸层析和气相色谱分析表明XJXL1和PYXL1是由多种单糖组成的酸性杂多糖。XJXL1和PYXL1对超氧阴离子自由基和羟自由基具有明显的清除效果，且对细菌有很好的抑制作用。结论从多糖含量、清除自由基及抑菌活性实验可以证明新疆雪莲培养物是新疆天然雪莲的良好替代物，具有进一步开发生产的价值。【关键词】雪莲

2、多糖自由基抑菌雪莲SausureainvolucrateKir.系菊科凤毛菊属的高山草本植物，是我国民族药中有代表性的珍稀名贵药材，系国家3级濒危物种。其化学成分主要有黄酮类化合物、糖类、萜类及其衍生物、甾体成分、木脂素［1］。雪莲花的干燥地上部分入药，可祛风胜湿,通经活络,用于风湿性关节炎、小腹冷痛、月经不调［2］。现代药理研究表明雪莲花具有抗炎镇痛、抗癌、扩张血管、降血压、清除自由基及抗疲劳等作用。由于雪莲生长环境特异，人工栽培困难，加上雪莲被掠夺性采挖,致使目前雪莲资源匮乏，雪莲物种濒临灭绝。为此应用组织培养技术生产某些重要次生代谢产物的研究越来越受到人们的重视［3］。植物组织培

3、养物是指在无菌和人工控制的营养及环境条件下，研究植物的细胞组织器官以及控制其生长发育的技术［4］。本论文就是对应用这种技术生产的新疆雪莲组织培养物［5］和新疆天然雪莲进行水溶性多糖提取分析，初步纯化，并进行体外清除自由基及抗菌活性初步比较研究，为进一步探讨雪莲多糖的药理活性，完善雪莲多糖的质量评价体系和合理利用天然雪莲提供依据。1器材与方法材料与仪器新疆天然雪莲SaussureainvolucrataKir.；组织培养雪莲由杨林老师提供［5］。毛细管气相色谱仪GC-XX型(日本岛津)；FC-95A馏分自助收集器；722型光栅分光光度计；8002型电热恒温水浴锅；精密电子天平，LD4-8

4、型离心机；101-3型电热鼓风干燥箱。方法雪莲粗多糖的提取准确称取干燥的雪莲，加入95％的乙醇回流脱脂后，85℃水浴加热水提乙醇沉淀，95％乙醇、无水乙醇洗沉淀去除单糖，离心，真空干燥后得去除单糖的雪莲多糖粗品。雪莲粗多糖的确认及性质硫酸-咔唑反应［6］：糖醛酸与咔唑反应，生成紫红色化合物。费林试剂反应［7］：还原糖中的还原性醛基可以将费林试剂中的Cu2+还原成Cu+，从而生成红色的沉淀。取粗多糖水溶液10ml，加入过量的费林试剂煮沸min，将产生的红色沉淀趁热除去，滤液加入硫酸酸化，加热煮沸10min后用10%氢氧化钠中和，再加入一定量费林试剂，加热煮沸，观察是否有砖红色沉淀。碘-碘

5、化钾反应［8］：淀粉遇碘具有一种特征蓝色。取粗多糖水溶液10ml，加入碘化钾-碘试剂，观察溶液是否变蓝。Molish反应［8］：五碳糖类以及它们的双糖类均能被硫酸分解成糠醛，六碳糖类以及它们的双糖类同样地被分解成羟甲基糠醛。这些糠醛类化合物与a-奈酚作用产生有色缩合产物。苯酚-硫酸反应［8］：五碳糖类以及它们的双糖类均能被硫酸分解成糠醛，六碳糖类以及它们的双糖类同样地被分解成羟甲基糠醛。这些糠醛类化合物与苯酚作用产生橘红色缩合产物。雪莲粗多糖蛋白质、糖含量及半乳糖醛酸含量测定蛋白质含量测定采用凯氏定氮法检测［9］；总糖含量采用苯酚-硫酸法检测［10］；糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法检测［1

6、1］。雪莲粗多糖的初步纯化及组成分析粗多糖的初步纯化:将粗多糖配成2%溶液，链酶蛋白酶与Sevage法联合脱蛋白，重复3次［12］。纸层析法［13］：取10mg多糖，完全酸水解，以BaCO中和，沉淀过滤后将溶液浓缩至1ml，点样于新华1号中速滤纸，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水。室温展层30h后取出，吹干后喷显色剂。气相色谱法［14］：取10mg多糖，甲醇解，硅烷化上样。OV210型毛细管柱，氢气为载气，流速为/s。柱温为100℃→250℃，程序升温，FID检测器。雪莲多糖清除自由基活性测定雪莲多糖清除·OH的测定［15～16］：清除率＝(A0－A样品)/A0×100％雪莲多糖清除O-2·的

7、测定［17］：清除率＝(A0－A样品)/A0×100％雪莲多糖清除R·的测定［18］：清除率＝(A0－A样品)/A0×100％A0—试剂空白吸光度；A样品—样品吸光度。雪莲多糖抑菌活性研究最低抑菌浓度试验［19］：①细菌：以紫外分光光度计在波长为550nm处测定的细菌培养液的OD值表示，培养液OD值与培养液内细菌繁殖速度呈正相关，OD值升高越快，表示培养液内细菌繁殖速度越快。在培养液中加入雪莲提取物,可延缓其OD值上升。若其吸光度与空白对照组一