鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析

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硕士学位（毕业）论文鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析学位申请人：崔元指导教师：孙继国教授袁万哲教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日 分类号：S855.3单位代码：10086密级：公开学号：20152200403鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析IsolationandIdentificationofDuckParvovirusSDStrainandAnalysisofGenomicCharacteristics学位申请人：崔元指导教师：孙继国教授袁万哲教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日 摘要“鸭短喙-侏儒综合征”（Beakatrophyanddwarfismsyndrome,BADS）是一种以雏鸭发育不良、喙萎缩变形、舌外伸肿胀和骨质疏松为主要特征的传染病。自2014年11月以来，该病在我国东南多省的商品肉鸭群中发生并流行，给我国鸭养殖业造成了严重的经济损失。本研究旨在从流行病学与病原学角度出发，分离相关病原进行致病性分析，明确引发BADS的病因，并建立病原实验室检测方法，探究致病病原的相关特性，为该病的防控提供理论依据及技术支持。本文主要从以下三个方面进行论述：首先，为了探究BADS的致病原因，本研究对发生BADS病鸭的肝脏和脾脏进行了PCR/RT-PCR检测，排除了其他的鸭常见疫病，将该病的病原命名为鸭细小病毒（Duckparvovirus,DPV）。将阳性病料研磨液接种鸭胚，盲传5代，收获尿囊液，通过PCR检测、测序鉴定、同源进化分析、动物回归试验，最终确定本研究成功分离到了一株DPV（命名为DPVSD）。此外，本研究还利用鸭胚成纤维细胞（Duckembryofibroblasts,DEF）对病毒进行了分离培养，PCR和间接免疫荧光试验（Indirectimmunofluorescenceassay,IFA）结果表明，本研究成功获得了SD株的细胞分离毒。DPVSD株的成功分离为DPV的进一步研究打下了基础。其次，为了进一步探究DPV分子水平上的特性，本研究对SD株的全基因组序列进行了分段扩增，并对其基因序列进行了结构特征分析及同源进化分析。结果表明，SD株全长5053bp，由两端的末端倒置重复序列（Invertedterminalrepeat,ITR）和中间的开放阅读框（Openreadingframe,ORF）组成。左侧ORF（LORF）编码非结构蛋白NS，右侧ORF（RORF）编码结构蛋白VP。SD株与其他BADS分离株和鹅细小病毒（Gooseparvovirus,GPV）欧洲分离株的亲缘关系较近，而与番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus,MDPV）分离株的关系较远。此外，与绝大多数水禽细小病毒相比，SD株的ITR区分别于100~114nt和337~350nt的区域存在14个碱基的缺失。最后，潜在糖基化位点的预测分析结果表明，SD株NS和VP蛋白上共有6个潜在糖基化位点。本研究为DPV的分子致病机制及分子流行病学调查的深入研究奠定了基础。最后，本研究通过PCR扩增了SD株的VP3基因，构建了标准品重组质粒pMD19-SD-VP3。选取VP3基因中在各株DPV之间较为保守且和其他水禽细小病毒有差异的区域，设计了1对荧光定量PCR引物及1条荧光探针。经过对反应体系的优化和标准曲线的绘制，最终建立了针对DPV的荧光定量PCR检测方法，并对其特异性、灵敏性和可重复性进行了验证。结果表明，建立的DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、可重复性良好。此检测方法的建立为DPV的实验室诊断提供了有力的技术支持。关键词：鸭细小病毒；分离鉴定；全基因组测序；荧光定量PCR IsolationandIdentificationofDuckParvovirusSDStrainandAnalysisofGenomicCharacteristicsAuthor:CuiYuanMajor:PreventiveVeterinaryMedicineAdvisors:Prof.SunJiguo;Prof.YuanWanzheAbstractBeakatrophyanddwarfismsyndrome(BADS)wasaninfectiousdiseasecharacterizedbystronggrowthretardation,beakatrophy,protrudingtonguewithswellingandosteoporosis.SinceNovember2014,thediseasehasbeenprevalentincommercialduckfarmsinmanysoutheasternprovincesofChina,whichhascausedseriouseconomiclossestotheduckbreedingindustryinChina.Fromtheperspectiveofepidemiologyandetiology,thepurposeofthisstudyistoisolatethepathogenandanalyzeitspathogenicity,ascertainthecauseofBADS,devolopelaboratorydiagnosticmethodsandexploretherelatedcharacteristicsofthepathogen,whichwouldprovidetheoreticalbasisandtechnicalsupportforthepreventionandcontrolofthedisease.Thisarticleismainlydiscussedfromthefollowingthreeaspects:Firstly,inordertoascertainthecauseofBADS,thisstudydetectedtheliverandspleentissuesamplescollectedfromtheBADSduckgroupsbyPCR/RT-PCR.Afterexcludingothercommondiseasesinducks,thepathogenofBADSwasnamedasduckparvovirus(DPV).ThegrindingfluidofDPVpositivetissueswasinoculatedintoduckembryos.After5generationsblindpassage,allantoicliquidwascollected.Throughthesequencingandidentification,homologyandevolutionanalysisandanimalregressiontest,astrainofDPV(designatedDPVSD)wasconfirmedsuccessfullyisolated.Inaddition,thisstudyalsoisolatedthevirususingduckembryofibroblasts(DEF).TheidentificationresultsofPCRandindirectimmunofluorescenceassay(IFA)showedthattheSDstrainwassuccessfullyisolatedbyDEF.ThesuccessfulisolationofDPVSDstrainlaidthefoundationforfurtherresearchofDPV.Secondly,inordertoexplorethecharacteristicsofDPVinmolecularlevel,5pairsofoverlappingprimersweredesignedbasedonthegenomiccharacteristicsofwaterfowlparvovirus.ThenthewholegenomesequenceofSDstrainwasamplified.Thestructuralcharacteristics,homologyandevolutionrelationshipofthegenesequenceswereanalyzed.ThefullgenomeofSDstrainwasfoundtobe5053bpinsize,whichconsistedofinvertedterminalrepeat(ITR)andopenreadingframes(ORFs).TheleftORFwas1844bpandencodednon-structuralproteinNS.TherightORFwas2199bpandencodedcapsidproteinVP.SDstrainisclosertootherBADSstrainsandGPVEuropeanstrains thanMDPVstrains.Inaddition,comparedwithmostofthewaterfowlparvovirus,theITRregionofSDstrainhastwo14basesdeletionsinthelocationof100~114ntand337~350nt.Finally,thepotentialglycosylationsiteswerepredictedandanalyzed.Theresultsshowedthattherewere6potentialglycosylationsitesintheNSandVPproteinsofSDstrain.ThisstudylaidafoundationforfurtherresearchonmolecularpathogenesisandmolecularepidemiologyofDPV.Atlast,theVP3geneofSDstrainwasamplifiedbyPCR,andtherecombinantplasmidpMD19-SD-VP3wasconstructedforthepreparationofstandardplasmids.ApairoffluorescentquantitativePCRprimersandoneprobeweredesignedbasedontheconservedregionbetweenDPVstrainsofVP3gene.Afteroptimizingreactionsystemandthecreationofthestandardcurve,theTaqMan-basedreal-timefluorescentquantitativePCRdetectionmethodforDPVwasestablished.Afterthat,itsspecificity,sensitivityandrepeatabilitywereverified.TheresultsindicatedthattheestablishedfluorescentquantitativePCRmethodwasspecific,sensitiveandreproducible.ThedevelopmentofthisdetectionmethodcouldprovidepowerfultechnicalsupportforlaboratorydiagnosisofDPV.Keywords:Duckparvovirus;isolationandidentification;completegenomesequencing;fluorescentquantitativePCR 缩略词表LISTOFABBREVIATION英文缩写英文全称中文全称°CCenti-degree摄氏度gGram克LLiter升mLMilliliter毫升µLMicroliter微升µMMicromole微摩尔mol/LMole/Liter摩尔/升dDay天hHour小时minMinute分钟sSecond秒rRound转bpBasepair碱基对dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应GPVGooseparvovirus鹅细小病毒DPVDuckparvovirus鸭细小病毒MDPVMuscovyduckparvovirus番鸭细小病毒BADSBeakatrophyanddwarfismsyndrome鸭短喙–侏儒综合征ITRInvertedterminalrepeat末端倒置重复序列ORFOpenreadingframe开放阅读框LORFLeftopenreadingframe左侧开放阅读框RORFRightopenreadingframes右侧开放阅读框AmpAmpicillin氨苄青霉素PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液FBSFetalbovineserum胎牛血清HEPESN-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfhonicacidN-2-羟乙基哌嗪-N’-2乙磺酸FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素IFAIndirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光试验EID5050%egginfectiondose半数禽胚（鸭胚）感染量TCID5050%tissuecultureinfectiondose半数组织（细胞）培养感染量DEFDuckembryofibroblasts鸭胚成纤维细胞logLogarithm对数CVCoefficientofvariation变异系数S.D.Standarddeviation标准差 目录1引言..............................................................................................................................11.1水禽细小病毒病原学研究进展...........................................................................11.1.1分类地位........................................................................................................11.1.2形态特征及理化特性....................................................................................11.1.3宿主范围及培养特性....................................................................................21.1.4分子生物学特征............................................................................................21.2水禽细小病毒流行病学研究进展.......................................................................41.2.1主要临床症状及病理变化............................................................................41.2.2诊断方法........................................................................................................51.2.3防制................................................................................................................61.3研究目的及意义...................................................................................................72材料与方法..................................................................................................................82.1材料.......................................................................................................................82.1.1病毒、临床样品和实验动物........................................................................82.1.2主要分子生物学试剂和常用生化试剂........................................................82.1.3细胞培养溶液................................................................................................82.1.4工程菌培养及质粒转化用溶液....................................................................92.1.5主要仪器......................................................................................................102.2方法......................................................................................................................112.2.1病原的PCR检测及纯净性检测..................................................................112.2.2SD株鸭胚毒的分离与鉴定........................................................................122.2.3动物回归试验..............................................................................................132.2.4SD株细胞毒的分离与鉴定........................................................................132.2.5SD株全基因组各片段重组质粒的构建....................................................142.2.6SD株全基因组序列的拼接及分析............................................................162.2.7荧光定量PCR引物及探针的设计.............................................................162.2.8PCR反应体系的优化及标准曲线的绘制..................................................172.2.9荧光定量PCR检测方法的验证.................................................................183结果与分析................................................................................................................203.1DPVSD株的分离与鉴定.................................................................................203.1.1发病鸭的流行病学及临床特征..................................................................203.1.2病原PCR检测及纯净性检测结果.............................................................203.1.3鸭胚分离毒PCR鉴定结果.........................................................................213.1.4EID50测定结果............................................................................................223.1.5动物回归试验结果......................................................................................22 3.1.6细胞分离毒PCR鉴定结果.........................................................................233.1.7细胞分离毒IFA检测结果...........................................................................243.2DPVSD株全基因组序列的测定与分析..........................................................243.2.1各片段PCR电泳结果.................................................................................243.2.2全基因组序列特征分析...............................................................................253.2.3NS基因序列特征分析.................................................................................273.2.4VP基因序列特征分析.................................................................................293.2.5ITR区序列特征分析...................................................................................323.2.6潜在糖基化位点预测分析...........................................................................323.3DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立.......................................323.3.1Taq-Man实时荧光定量PCR引物的验证..................................................323.3.2标准品的制备...............................................................................................333.3.3反应体系的优化结果...................................................................................333.3.4标准曲线的绘制...........................................................................................343.3.5特异性试验结果...........................................................................................353.3.6敏感性试验结果...........................................................................................363.3.7重复性试验结果...........................................................................................363.3.8临床样品检测结果.......................................................................................374讨论.............................................................................................................................384.1DPVSD株的分离与鉴定..................................................................................384.2DPVSD株基因组全序的测定与分析..............................................................394.3DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立.......................................395结论.............................................................................................................................41参考文献.........................................................................................................................42在读期间发表的学术论文.............................................................................................47作者简介.........................................................................................................................48致谢.................................................................................................................................49 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析1引言2014年以来，在中国大陆东南多省陆续发生了大规模的“鸭短喙–侏儒综合征”（Beakatrophyanddwarfismsyndrome,BADS或Shortbeakanddwarfismsyndrome,SBDS），该病是以鸭生长发育严重迟缓、上下喙萎缩、舌外伸肿胀、骨质疏松为主要特征的一种传染病，经过病原分离、测序鉴定、同源进化分析、动物模型建立等实验操作，确定引发该病的病原为鸭细小病毒，也称新型鸭细小病毒、鸭源新型鹅细小病毒等[1-4]。1971年，该病被首次报道发生于法国西南部的半番鸭中[5]，1995年，波兰的半番鸭场中也有发生该病的报道[6]，2009年，匈牙利学者对法国半番鸭的BADS病例进行了病原的分离与鉴定，确定病原为GPV的变异株[7-8]，1990年，我国台湾地区曾报道过该病的发生与流行[9]，2014年以前，该病尚未在我国大陆地区大面积地发生与流行。然而近年来，随着BADS发病区域的不断扩大，对我国的养鸭业造成了巨大的冲击，受到了国内外研究人员的广泛关注。1.1水禽细小病毒病原学研究进展1.1.1分类地位水禽细小病毒主要包括GPV、MDPV和DPV，它们都是细小病毒科的成员，之前根据GPV和MDPV的形态结构和培养特性等生物学特性及基因组复制特性，将其归为细小病毒科的细小病毒属[10]。1995年匈牙利学者Zádori[11]发表了GPV和MDPV的全基因组序列，发现与细小病毒属的成员相比，它们的病毒粒子的核酸极性与依赖病毒属的成员更为相似，且蛋白编码区的核苷酸和由核苷酸序列推导出的氨基酸序列与依赖病毒属成员的同源性更高[12-13]，因此在学者们的陆续建议下[11,14]，直到2004年，这两种病毒被国际病毒分类委员会正式划入依赖病毒属[15]。细小病毒科包括细小病毒亚科和浓核病毒亚科，依赖病毒属属于细小病毒亚科，此亚科还包括细小病毒属、红病毒属、牛犬细小病毒属和阿留申水貂病毒属[15]。其中，依赖病毒属的基因组不完备，其子代病毒复制需要有辅助病毒的存在才可进行，但GPV和MDPV在对应的鹅胚成纤维细胞或番鸭胚成纤维细胞上培养时，其增殖过程并不需要辅助病毒的参与，而其自我复制的过程可借助于宿主细胞在DNA合成过程中的某些功能，因此，水禽细小病毒的复制具有自主性。由于兼具自主病毒和依赖病毒的特性，因此推测水禽细小病毒可能是细小病毒进化的变异体，或是自主细小病毒与依赖细小病毒进化过程中的中间体[16]。1.1.2形态特征及理化特性水禽细小病毒呈球形或六角形，无囊膜，电镜下呈晶格排列，为正20面体对称1 河北农业大学硕士学位（毕业）论文结构。电镜下病毒粒子呈两种形态，一种是带有核酸结构的完整病毒粒子，一种是缺少核酸结构的不完整病毒粒子或病毒空壳[17]。粒子直径为20~25nm，核酸由单股DNA组成[4,18]。GPV病毒粒子在CsCl密度梯度离心时，可形成4个主要的密度带：大部分感染性病毒粒子存在于1.38~1.42g/mL，小部分感染性病毒粒子(可能是变异或不同构型的病毒粒子)存在于1.45~1.47g/mL，含有不完整核酸结构的病毒粒子和病毒空壳分别存在于1.35~1.37g/mL和1.30~1.32g/mL[18]。在NaCl和蔗糖溶液中的浮密度分别为1.410~1.431g/mL和1.0810~1.1764g/mL[19]。水禽细小病毒的病毒粒子无囊膜，且不含糖类、脂类，结构紧密，因此对外界理化因素的抵抗力强大，主要表现在：对很多化学试剂如氯仿、乙醚、n-丁醇、脱氧胆酸钠盐、苯酚、胰酶和福尔马林等都不敏感，在强酸溶液（pH=3）中病毒也不被致弱[20]；对热不敏感。方定一教授曾将GPV置于56°C作用1h，病毒仍可保持对鹅胚的感染力并可致死鹅胚，并且将该病毒置于50°C3h或37°C7h的环境下，病毒感染滴度不发生变化[21]。经过中和试验、间接免疫酶联吸附试验、免疫交叉保护试验、间接免疫荧光试验、琼脂扩散试验等试验的验证，证明国内外所有GPV和MDPV的分离毒株都具有相同抗原性，为同一血清型，或只存在微小差异[22-23]，它们的抗血清之间存在交叉反应。水禽细小病毒还有一个重要特点，即不能凝集多种不同的禽类（鸡、鸭、鹅等）、哺乳动物（兔、猪、大白鼠、小鼠、牛、绵羊等）和人类的O型红细胞，但能凝集黄牛精子，并可利用抗血清做血凝抑制试验，作为鉴定水禽细小病毒的一种有效的方法[12,18]。1.1.3宿主范围及培养特性由于细小病毒科成员繁多，因此其宿主范围较广，但特定的细小病毒只有特异范围的宿主。GPV的天然宿主为鹅和番鸭，与之相比，MDPV的感染宿主较为单一，仅限于番鸭。BADS目前已知的感染宿主主要有樱桃谷肉鸭、绿头鸭、番鸭、半番鸭、褐莱鸭及白改鸭等[24]。水禽细小病毒的体外培养具有很强的专一性，只能在宿主相应的鹅胚、番鸭胚或鸭胚以及对应的禽胚成纤维细胞中增殖，而不能在其他禽胚上增殖，也不能在猪肾细胞（PK-15）、仓鼠肾细胞（BHK-21）、鸡胚成纤维细胞（DF-1）和猴肾细胞（Vero）等常见的传代细胞中增殖培养。水禽细小病毒具有自主细小病毒的特性，不需辅助病毒的参与即可进行自行复制，但其复制依赖于宿主细胞分裂的S期或G2期过程中的某些机能，因此需要在禽胚或细胞培养的同时接种病毒，以达到病毒增殖培养的目的。有研究表明，腺联病毒2型（AAV-2）可使GPV在鹅胚中的增殖能力增强[25]。1.1.4分子生物学特征水禽细小病毒的基因组为单链、线性DNA，长约5.0kb，含正链DNA和负链2 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析DNA的两种病毒粒子的数量相当，各占50%，这两者基因组的两端都含有末端倒置回文结构，由“茎”部和“泡”区组成，“泡”区的外形如“箭”状，在“箭头”上有一个sphI酶切位点，形成二分对称中心，并因此在细小病毒基因组的两端形成U形的发夹结构，正由于这个原因，此类病毒的单极性链DNA分子很容易发生退火形成双链DNA[26-27]。根据基因组两端回文结构序列的性质，可将细小病毒分为A、B两类，A类细小病毒基因组两端的回文结构的序列相同，为末端倒置重复序列（ITR），水禽细小病毒即属于此类；B类细小病毒基因组两端的回文结构的序列彼此不相关，多数细小病毒属成员属于此类。细小病毒基因组的中间部分为编码区，包含左右两个开放性阅读框（ORF），这两个ORF之间间隔了18个碱基，互不重叠。LORF编码NS1和NS2两种非结构蛋白，共用同一终止密码子，RORF编码VP1、VP2和VP3这三种结构蛋白，共用同一终止密码子。DPV的全基因组示意图如图1所示。图1DPV全基因组示意图Fig.1DPVgenomediagramGPV的NS1蛋白是在病毒复制早期产生的一种磷酸化蛋白，主要参与DNA复制且有调控转录的功能，还与蛋白质的有效合成及病毒增殖有关[28]，NS1和NS2蛋白可协同作用，从而对宿主细胞产生毒性，抑制宿主细胞的DNA复制。其中NS2蛋白的毒性较弱，它主要是促进NS1蛋白的细胞毒性作用[29-30]。Ennis等表达纯化了人类细小病毒B19的NS蛋白，采集了初期感染B19病人的血清，利用ELISA方法检测，发现在感染病毒的早期即可在血清中检测出抗B19NS蛋白的IgM和IgG抗体，因此NS蛋白抗体可以作为诊断B19初期感染的检测指标之一[31-32]。此外，Wang等[33]的实验结果表明，水禽细小病毒的VP蛋白抗体要在病毒感染6~8周后才出现，而NS蛋白抗体在机体感染病毒的初期就可出现，此研究还证明了NS蛋白可用来鉴别病毒自然感染和重组蛋白（VP2和VP3）疫苗免疫产生的抗体。衣壳蛋白VP1、VP2和VP3在细小病毒的组织嗜性、病毒毒力、宿主域及致病性等方面至关重要[34-36]。Tullis等[36]的研究表明，缺失VP1蛋白的小鼠细小病毒（MVM）突变体失去了对细胞的有效感染力，但是与野生型病毒相比，这些突变体吸附细胞的能力并未受到影响，甚至有所增强，且在转染细胞的过程中，突变体与野生型病毒的复制方式相似，因此推测在侵染宿主细胞的过程中，缺失VP1蛋白的突变体是在与细胞结合之后、启动病毒DNA复制开始之前的某些步骤被阻断了，例如病毒摄入或转运到细胞核的过程。VP1可能能够与宿主细胞表面的相应受体结3 河北农业大学硕士学位（毕业）论文合，从而启动病毒的有效感染能力。此外，VP1蛋白的氨基末端有一段独特的区域，这段区域包含的一些碱性氨基酸，类似于经典的核定位信号（NLS），可以介导病毒粒子或核酸通过核孔向宿主细胞核内的转运功能[36]。这段区域的独特之处还在于其包含了一段磷酸酯酶A2（PLA2）区域，PLA2可以溶解细胞膜，进而避免细胞中的溶酶体将病毒水解，因此，PLA2的活性强弱对细小病毒的致病机制有重要影响[37]。VP2蛋白在病毒核酸的复制以及衣壳化的过程中，作用充分且必不可少，它还可以自我组装病毒样颗粒，参与病毒颗粒的细胞核输出[36]。VP3蛋白是细小病毒主要的衣壳蛋白，约占总量的80%，是细小病毒中研究和应用最广泛也最成熟的蛋白。有研究人员用GPV的VP3蛋白免疫小鼠，获得的单抗经过鉴定显示，既可以很好的与全病毒粒子结合，也能特异性识别VP3重组蛋白[38-39]。VP3蛋白有主要的抗原决定簇，是细小病毒的主要保护性抗原，在细小病毒的诊断及免疫防治中起重要作用。1.2水禽细小病毒流行病学研究进展1.2.1主要临床症状及病理变化鹅细小病毒病又称小鹅瘟，临床表现主要有三种类型：最急性、急性和亚急性型。最急性型：常发生于7日龄以内雏鹅。往往表现为无明显前驱症状（或见精神萎靡数小时）即突然倒地死亡，发病急，传播速度快，数天后就可波及群鹅。发病雏鹅鼻孔可见浆性分泌物，喙部干燥，蹼部颜色灰暗。剖检后典型病变为肠黏膜充血肿胀。急性型：多发于15日龄以内的雏鹅。临床症状较为明显，病鹅精神沉郁，行走无力，站立不稳，喜窝倦怠，食欲减少或废绝，即便采食也多随即甩弃，随后饮水量增多，排黄白色或黄绿色米汤样稀粪，其中可见混有未消化完全的饲料，泄殖腔和肛门周围沾污而潮湿。病鹅呼吸困难，口鼻可见浆性分泌物，喙部干燥发绀，脚蹼颜色灰暗，眼结膜干燥，全身呈现严重脱水状。发病后期（1~2d后）可出现麻痹、瘫痪等神经症状，而后死亡，耐过鹅多预后不良。剖检病变可见肝、肾和胰腺肿胀，皮下组织出血明显。亚急性型：多发于2周龄以上的鹅。表现为精神委顿，腹泻脱水，严重生长停滞，极度消瘦，背部和颈部的羽毛脱落，裸露的皮肤呈深红色，病鹅还可能由于腹腔内积水而呈现“企鹅状”站姿[40]，后期可出现神经症状，病程一般3~7d，部分幸存但多预后不良。病变主要集中在小肠，特征为多表现为急性卡他性-纤维素性坏死性炎症，可形成伪膜，严重者肠腔内充斥有10~20cm灰白或淡黄色的条形凝栓物，此外，患鹅的皮下组织、内脏、脑膜等均有不同程度的肿胀、充血或出血等病理变化。番鸭细小病毒病又称“三周病”，该病主要侵害1~3周龄的雏番鸭，3~4d后为死亡高峰。日龄较大的番鸭也可发病，但发病率和死亡率较低。本病的潜伏期为4~9d，病程一般为2~7d。根据病程长短可分为急性型和亚急性型。急性型多见于1~2周龄，主要表现为精神沉郁，羽毛蓬乱，两翅下垂，尾端下垂，站立不稳，常蹲伏不起，厌食，腹泻，粪便呈白色或淡绿色，离群。多数病鸭流涕、甩头，部分有流4 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析泪痕迹。呼吸困难，喙发绀。病程一般为2~4d，死前多表现为两脚麻痹，倒地抽搐，角弓反张等神经症状，最后衰竭死亡。亚急性型多见于日龄较大的雏番鸭，主要表现为精神萎顿，行走无力，排绿色或白色稀粪，并粘附于肛门周围。病程一般为5~7d，病死率较低，耐过鸭的颈部和尾部发生脱毛，嘴变短，生长发育受阻，成为僵鸭。鸭日龄越小病程越短。患鸭的显著病变主要集中在肝脏、胰腺和肠道。肝稍肿大，胆囊充盈，偶见灰白色坏死点。胰腺肿大，表面散布针尖大小的灰白色坏死灶，有的表面密布大小不等的出血点。整个肠道呈卡他性炎症，黏膜有不同程度的充血和点状出血，尤其以十二指肠、空肠和直肠后段黏膜较为严重，少数病例盲肠黏膜也有出血。肠黏膜常伴有不同程度的脱落，肠壁稍薄，肠内容物为淡白色或灰黄色带有粒状的液体。新型鸭细小病毒病主要发生于10~30日龄的肉鸭，可引起“鸭短喙–侏儒综合征”，又称“鸭大舌病”，主要的临床表现为喙萎缩变形、舌外伸肿胀而向下弯曲、生长发育严重迟缓、跛行甚至瘫痪，部分病鸭有腹泻现象。病鸭全身骨质疏松，翅膀、胫骨和肋骨质地变脆，在抓扑及屠宰过程中非常容易折断。剖检可见胸腺有出血点、肿大，肝脏出血坏死，心脏、肾脏也可见出血点，肠道有卡他性炎症，但无典型的小鹅瘟的“肠栓塞”病变。1.2.2诊断方法目前国内外有多种针对水禽细小病毒的诊断检测方法，首先应根据病例的流行特点、临床症状和剖检病理变化对疾病做出初步的诊断，然后再结合后续的病原分离、血清学诊断及分子生物学检测等一系列实验室技术对疾病的病原进行进一步的判断并最终确诊。目前针对GPV和MDPV的实验室诊断方法主要包括病原学诊断、PCR方法、琼脂扩散试验、中和试验、乳胶凝集试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、免疫酶斑点法等。病原分离培养是这两种病原最经典的检测方法之一，主要是利用相应宿主的11~15日龄的禽胚或成纤维细胞对病原进行分离培养，孵育过程中持续观察，之后将死胚取出进行剖检，观察尿囊液状态、胚体病变等，培养的细胞观察有无病变、脱落等现象。然而由于目前国内SPF级别的鹅胚或番鸭胚难以获得，因此这种诊断结果容易受到母源免疫特性的影响，从而导致检测结果不够稳定。分子生物学诊断病原的方法普遍具有检测迅速、特异性强、灵敏度高、可重复性强、检测结果准确度高等优点，还可以同时检测多种病原，对相似疾病的病原进行鉴别诊断等，是可用于病原诊断的一种常见且应用广泛的实验技术。针对GPV和MDPV建立的各种各样的PCR检测方法，国内外都有大量相关的研究及报道，包括普通PCR[41-45]、多重PCR[46-49]、荧光定量PCR[50-52]、套式PCR[53-54]、PCR-DHPLC[55]、等温环介PCR[56-58]等。酶联免疫吸附试验（ELISA）作为一种血清学诊断方法，在细小病毒疾病检测方面的应用也十分广泛。其中有基于纯化的全病毒粒子和非结构蛋白或结构蛋白而5 河北农业大学硕士学位（毕业）论文建立的用于检测血清中GPV或MDPV抗体水平的间接ELISA方法[59-63]，也有应用制备的鼠抗GPV单抗或兔抗GPV（或VP3蛋白）多抗作为一抗建立的双抗体夹心ELISA方法[64-66]，还有可以用于鉴别区分自然感染GPV产生的抗体和接种基于结构蛋白制备的疫苗获得的抗体的Dot-ELISA方法[67]，此外还有研究人员利用杆状病毒系统表达了VP2蛋白，并以此建立了竞争ELISA方法[68]。琼脂扩散试验（AGP）也是一种常用于检测GPV和MDPV抗原抗体的血清学诊断方法。这种方法操作简便易行，因此适用于基层检测，但也由于抗原抗体的条件限制使得其敏感性较差，在发病初期血清抗体的阳性检出率较低。有研究表明，将聚乙二醇加入琼脂中可以显著提高灵敏性和特异性，但需要高效价的抗原和抗体[69]。秦爱建等[70]利用抗GPV酶标单克隆抗体建立的免疫酶琼扩试验可以将抗原检测的灵敏性提高约256倍，但单抗成本较高，且DAB显色剂是剧毒物质，不适合基层推广应用。鸭细小病毒病作为一种新发传染病，目前相关的实验室诊断方法还不是很多。目前，针对DPV的实验室诊断方法主要涉及血清学诊断和分子生物学诊断这两个方面。宫晓华[71]利用纯化的VP3蛋白作为包被抗原，DPV阳性血清作为一抗，建立了检测DPV抗体的间接ELISA方法。窦砚国等[72]根据DPV的VP3基因设计了2对特异性引物，建立了套式PCR检测方法。郑肖强等[73]建立了特异性针对DPV的地高辛标记核酸探针检测方法。由于病鸭具有短喙长舌、骨脆易折等这些较为有特征性及代表性的临床表现，因此在该病的诊断过程中，临床观察诊断与实验室检测诊断相结合显得尤为重要。1.2.3防制水禽细小病毒病的治疗并无特效药物和特异性治疗方法，此类疾病主要是以预防为主。目前主要依靠高免血清、卵黄抗体和各种疫苗（弱毒苗、灭活苗和基因工程苗）等生物制品对疾病进行防制。水禽细小病毒病的防制可以采用以下两种经济有效的方式，一是对开产前的种禽注射疫苗进行人工免疫，通过这种方式可以使其产生的母源抗体通过卵黄传给子代雏禽，使其获得被动免疫；二是对疫区刚出壳的雏禽立即皮下注射抗血清或卵黄抗体，此方法可有效控制疫情。另外，对于初期感染细小病毒的雏禽，注射高免血清或卵黄抗体对其也可产生较好的治愈效果。黄奇昌等[74]采用了GPV弱毒乳化疫苗免疫山羊、奶山羊和黄牛获得了明显较高抗体滴度的高免血清，混合血清的琼扩效价为1:8时，对1~10日龄雏鹅的预防免疫保护率可到达96.3%，对发病鹅群的治愈率可达到92%。刘大鹏等[75]用盐析法制备的鸭源抗GPV卵黄抗体对雏鹅的预防成功率高达100%，对GPV感染有极显著的预防及治疗效果。抗生素及磺胺类药物对水禽细小病毒病没有治疗效果，但可以和疫苗配合使用，可以防止和减少继发细菌和霉菌感染[76]。6 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析1.3研究目的及意义2014年年底以来，我国大陆东南多省的商品肉鸭群陆续发生了大规模的BADS，养殖户俗称为“鸭长舌病”或“鸭大舌病”，发生该病的肉鸭群虽然死亡率不高，但是病鸭严重生长发育不良，导致料肉比显著升高，给肉鸭养殖业带来了严重的经济损失。因此尽快确定其致病原因、研究致病病原的相关特性、建立特异有效的检测诊断方法迫在眉睫。首先，本研究旨在通过对BADS传染病病原的分离与鉴定，确认引发该病的病因；其次，本研究旨在通过对病原的全基因组序列的测定、结构及同源进化等相关特性的分析，以期为探索DPV的分子生物学特性及分子流行病学特点提供科学理论依据；最后，本研究通过建立DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法，以期为DPV的实验室诊断及流行病学调查奠定实验基础。7 河北农业大学硕士学位（毕业）论文2材料与方法2.1材料2.1.1病毒、临床样品和实验动物小鹅瘟病毒（GPV）、新城疫病毒（NDV）、鸭肠炎病毒（DEV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）均为疫苗株。鸭坦布苏病毒（DTMUV）由本实验室保存。番鸭细小病毒（MDPV）的DNA样品由福建省农业科学院畜牧兽医研究所提供。临床样品来自于山东聊城的发病樱桃谷肉鸭群和各地送检样品。9~11日龄鸭胚购自瑞普(保定)生物药业有限公司。1日龄樱桃谷肉鸭购自保定某肉鸭场。2.5~3.0kg健康成年家兔购自保定某兔场。2.1.2主要分子生物学试剂和常用生化试剂异丙醇、丙酮、甲醇、无水乙醇均购自上海化学试剂有限公司，pEASY-BluntSimpleCloningKit、pEASY-T1SimpleCloningKit、Trans1-T1PhageResistant化学感受态细胞、EasyPureViralDNA/RNAKit、EasyTaqDNAPolymerase、10×EasyTaqBuffer、EasyPfuDNAPolymerase、10×EasyPfuBuffer、2.5mMHighPuredNTPs均购自北京全式金生物技术有限公司，FastPlasmidMiniKit购自康为世纪科技有限公司，胰蛋白酶、羊抗兔IgG-FITC均购自索莱宝生物科技有限公司，T-VectorpMD19(Simple)、PrimeScript1ststrandcDNASynthesiskit、PremixExTaq均购自大连宝生物工程有限公司，溴化乙锭（EthidiumBromide,EB）、胰蛋白胨、酵母提取物、Hepes、DMEM培养基、营养琼脂、琼脂糖均购自Sigma公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。2.1.3细胞培养溶液PBS溶液（10mmol/L，pH7.4）：准确称取8.00gNaCl，0.24gKH2PO4，1.44gNa2HPO4·12H2O，0.20gKCl置于干净瓶中，加入约900mL三蒸水，待加热至完全溶解后倒入容量瓶，将其定容至1000mL，121°C高压灭菌15min，于4°C保存备用。胎牛血清（FBS）：从-20°C取出后室温放置至完全融化，使用前56°C水浴灭活30min，分装到10mL离心管中，于-20°C保存备用。5×DMEM贮存液：在干净玻璃瓶中加入200mL三蒸水，倒入高糖DMEM粉剂，充分混匀至粉末溶解，倒入装上滤膜且已灭菌的金属滤器，通过挤压加压球将8 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析培养基过滤到另一个无菌培养瓶中，于4°C保存备用。10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：将8.0gNaCl，0.2gKCl，2.89gNa2HPO412H2O，0.2gKH2PO4溶于90mL三蒸水中，再加入1:250胰酶粉剂2.5g，完全溶解后，用NaHCO3调节pH至7.2~7.4，用三蒸水定容至100mL，过滤后分装到1mL离心管，于-20°C保存备用。2×104U/mL青链霉素混合液（双抗）：分别取2×106U青霉素和链霉素粉剂，加入100mL三蒸水，混匀，过滤除菌后分装，于-20°C保存备用。500mmol/LHepes缓冲溶液：取12gHepes加入90mL三蒸水中，用NaOH（5mol/L）调pH至7.2，用三蒸水定容到100mL，过滤并分装后于-20°C保存备用。7.5%NaHCO3：称取7.5gNaHCO3溶于100mL三蒸水中，溶解后高压灭菌，于4°C保存备用。10%FBSDMEM：在无菌玻璃瓶中加入三蒸水132mL，5×DMEM40mL，FBS20mL，双抗1mL2×104U/mL，Hepes缓冲液2mL，最后加入约5mL7.5%NaHCO3溶液，调节pH至7.2~7.4，于4°C保存备用。2.1.4工程菌培养及质粒转化用溶液LB液体培养基：依次准确称取胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl2g于一干净锥形瓶中，加入约150mL蒸馏水，加热搅拌至其完全溶解后，用2MNaOH调节pH至7.2~7.4，加蒸馏水定容至200mL，经121°C高压灭菌15min后置于4°C保存备用。Amp+贮存液：准确称取1g氨苄粉剂溶解于10ml蒸馏水中，用一次性滤器过滤除菌，分装后置-20°C冻存备用。Amp+LB液体培养基：在已高压灭菌的LB液体培养基中，加入适量Amp+贮存液，使Amp终浓度为100μg/mL。Amp+LB固体培养基：称取琼脂粉1.5g溶于100mLLB液体培养基中，搅拌至完全溶解后经121°C高压灭菌15min，待其冷却至50°C左右，加入Amp+贮存液，使其终浓度为100μg/mL，无菌操作将其倒入已灭菌的培养皿中，静置制备平板，待其凝固后做好标记，于4°C保存备用。50×TAE电泳缓冲液：准确称取Tris-碱242g，Na2EDTA.2H2O37.2g于1000mL容量瓶中，加入冰乙酸57.1mL，三蒸水800mL，搅拌至溶解完全后，定容至1000mL，于室温保存备用，使用时进行50倍稀释，配制成1×TAE电泳缓冲液。1%琼脂糖凝胶：在20mL1×TAE电泳缓冲液中加入0.2g琼脂糖，煮沸后冷却至50°C左右加入0.5μLEB染料，混匀后倒入插入电泳梳的凝胶平板，室温静置20min待完全凝固后即可使用。9 河北农业大学硕士学位（毕业）论文2.1.5主要仪器仪器名称生产厂家先行者电子天平美国OHAUS公司SW-CJ-1FD净化工作台苏州净化设备仪器公司HERAcell150i型二氧化碳细胞培养箱美国ThermoScientific公司NanoDrop2000蛋白质/核酸浓度测定仪美国ThermoScientific公司TGL-16台式高速冷冻离心机湖南湘仪仪器开发有限公司GP型电热干燥、培养两用箱天津泰斯特仪器有限公司恒温生化培养箱江苏国华仪器公司变温振荡培养箱太仓市豪城研究仪器制造有限公司ZX-10C恒温循环仪上海知信实验仪器技术有限公司TU1002紫外透射台上海山富科学仪器有限公司微量移液器Eppendorf（艾本德）公司病料研磨器北京鼎昊源科技有限公司DK-8D型电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司DYG-31D型水平电泳槽北京六一仪器厂倒置生物显微镜37XB上海光学仪器厂倒置荧光显微镜AxioobserveA1德国蔡司公司ABI7500实时荧光定量PCR系统美国应用生物（ABI）DHS96G基因扩增仪北京鼎昊源有限公司凝胶成像分析仪北京赛智创业科技有限公司海尔超低温保存箱青岛海尔有限公司TU1002紫外透射台上海山富科学仪器有限公司GI54DW立式高压灭菌器美国zealway公司10 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析2.2方法2.2.1病原的PCR检测及纯净性检测2.2.1.1病料的采集与处理采集山东聊城发生BADS的樱桃谷肉鸭群中病鸭的肝脏和脾脏，剪取适量组织，用眼科剪剪至肉糜状，放入2mL圆底离心管中，加入1.5倍体积的生理盐水和一颗直径0.5mm的小钢珠，使用病料研磨器12000r/min研磨1min，循环5次，将匀浆8000r/min离心5min，吸取上清，于-80°C保存备用。2.2.1.2检测引物的设计与合成参考GenBank上发表的多株MDPV分离株核苷酸序列的保守区域，应用PrimerPremier5.0软件设计1对检测引物DPV-decF/DPV-decR，引物序列如表1所示，由上海生工生物技术有限公司合成。表1鸭细小病毒检测引物Table1DetectionprimersofDPV引物名称引物序列产物大小(bp)NameofprimersSequenceofprimersSizeofproductDPV-decF5’-AAACTTACTGAGCCCGTTCCTG-3’659DPV-decR5’-GCGACGCTGTCTGCTTTATTGA-3’2.2.1.3病毒基因组的提取按照EasyPureViralDNA/RNAKit说明书提取组织中的核酸：在1.5mL离心管中加入210μLBB5和5.9μLCarrierRNA；吸取200μL病料组织研磨上清，加入200μL配制好的BB5（含CarrierRNA），再加入20μLProteinaseK，于56°C水浴锅中作用15min；加入250μL无水乙醇，涡旋混匀15s，室温静置5min；将液体全部移入吸附柱，12000r/min离心1min，弃去收集管中的滤出液；加入WB5500μL，12000r/min离心1min，弃掉滤出液；重复洗涤步骤；空柱12000r/min离心2min；将离心柱放入一新管中，开盖晾干至无乙醇味道，在柱膜中央加入30μLRNase-freeWater，室温静置2min；12000r/min离心2min，管底液体即为提取的核酸溶液，于-20°C保存备用。2.2.1.4病原的PCR检测及纯净性检测应用设计的引物DPV-decF/DPV-decR以及本实验室之前建立的PCR或RT-PCR检测方法，对提取的组织中的DNA/RNA进行检测，以判断是否含其他鸭常见疫病病原。检测项目包括禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭瘟病毒（DPV）、11 河北农业大学硕士学位（毕业）论文鸭肝炎病毒（DHV）。20μLPCR体系如下：DNA/cDNA2μL，ddH2O12.5μL，10×EasyTaqBuffer2.5μL，2.5mMHighPuredNTPs2μL，DPV-decF/DPV-decR各0.5μL，EasyTaqDNAPolymerase0.5μL。PCR程序为：预变性94°C3min；94°C30s，55°C30s，72°C30s，30个循环；延伸72°C5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将检测出的BADS的病原初步命名为鸭细小病毒（DPV）。2.2.2SD株鸭胚毒的分离与鉴定2.2.2.1鸭胚毒的分离培养及PCR鉴定将2.2.1中检测为DPV阳性的病料研磨液上清，加入适量双抗，用0.22µm滤器过滤除菌。取9~10日龄鸭胚，用照蛋器确认气室部位并标记，用碘伏消毒，2min后用75%酒精脱碘，打孔器消毒后在气室上端打孔，用1mL注射器经尿囊腔接种过滤后的研磨液上清0.1mL，用蜡油封住小孔，置孵化箱中培养。24h内死亡的鸭胚弃用，随后每隔12h照蛋一次，在死胚气室下方作好时间标记，冷冻保存并记录个数。剩余鸭胚培养至144h全部冷冻致死。无菌条件下打开鸭胚尿囊腔，收获尿囊液，将收获的尿囊液按照上述方法盲传5代，收获F5代尿囊液进行PCR检测，尿囊液分装后于-80°C保存备用。2.2.2.2目的片段的回收按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书回收目的DNA片段：用洁净刀片切取F5代尿囊液PCR产物电泳凝胶中的目的条带，放入一干净离心管中，加入3倍体积的BufferB2，50°C水浴5~10min（每隔2~3min上下颠倒晃动3s）；透光观察无肉眼可见胶块后，加入等体积异丙醇，混匀后移入吸附柱中静置1min（若有剩余液体可分次移入）；9000r/min离心30s，弃去流出液；或将其再次上柱，以提高回收效率；加入500μLWashSolution，9000r/min离心30s后弃去滤出液，再次加入WashSolution重复洗涤一次；将空柱9000r/min离心2min后，把离心柱放入一新离心管中，打开管盖彻底晾干柱膜；将ElutionBuffer于65°C水浴预热，把吸附柱置于一新管中，吸取30μL预热好的ElutionBuffer滴加在吸附膜中央，室温静置2min；9000r/min离心2min，管底液体即为回收的DNA溶液，于-20°C保存备用。2.2.2.3克隆及测序鉴定将回收得到的659bp的目的片段连接至pEASY-T1Simple载体，连接体系5μL：目的片段4μL，载体1μL，37°C水浴20min；将Trans1-T1感受态细胞于冰上缓慢化开，立即加入连接产物，手指轻弹混匀，冰浴30min；水浴锅中42°C热激30s，冰浴2min；加入250μL液体LB，200r/min37°C摇床中振荡培养1h；将菌液5000r/min离心2min，弃去200μL上清，将剩余的上清和菌体沉淀吹吸混匀，将菌液均12 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析匀涂布到Amp+LB固体板上，先正置在37°C培养箱中30min，后倒置过夜培养。次日挑取单克隆菌落至Amp+LB液体培养基中，200r/min37°C振荡培养4~6h，菌液浑浊后进行菌液PCR鉴定，PCR体系及程序同2.2.1。将鉴定为阳性的菌液送至华大基因公司测序，测序结果应用NCBI在线BLAST进行比对，选取与其有同源关系的病毒分离株，利用Megalign软件进行同源性分析，并利用软件MEGA5.0构建遗传进化树。2.2.3动物回归试验2.2.3.1F5代尿囊液EID50的测定收集F5代尿囊液，用生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6。按2.2.2中的鸭胚接种方法，将100~10-6每个稀释度的尿囊液接种4颗鸭胚，放入孵化箱培养。每隔12h观察一次，直至孵化至144h。每颗鸭胚单独收取尿囊液，全部操作过程均需避免交叉污染，提取核酸按2.2.1中的方法进行PCR检测。根据电泳结果，按照Reed-Muench两氏法，计算DPVSD分离株F5代尿囊液的EID50。计算公式如下：距离比例=(高于50%的感染率﹣50%)/(高于50%的感染率﹣低于50%的感染率)；log10(EID50)=log10(感染率高于50%的病毒稀释度)﹢距离比例×log10(稀释系数)。2.2.3.2动物回归试验采用口服和肌肉注射的方式，将测定毒价后的的F5代尿囊液接种10只1日龄樱桃谷肉鸭，接种剂量为105EID50/只，两种方式接种相同剂量。设定对照组，隔离饲养，逐日观察至攻毒后第28d。2.2.4SD株细胞毒的分离与鉴定2.2.4.1鸭胚成纤维细胞的制备取10~12日龄鸭胚，消毒蛋壳，取出鸭胚于无菌培养皿中，去除头、四肢及内脏；PBS反复冲洗胚体后剪碎至肉糜状；加入胚体体积的4~5倍量的胰酶，置于大离心管中；37°C水浴消化30min，每隔10min摇动一次，3000r/min离心15min后弃去上清；用PBS反复清洗、离心和去除上层液，直至上层液澄清；加入10%FBSDMEM生长培养基，细胞筛过滤；计数；将稀释到适宜密度的细胞悬液加入到细胞培养瓶中，置于37°C、5%CO2、饱和湿度下培养，观察细胞贴壁情况。2.2.4.2细胞毒的分离培养取经0.22µm滤器过滤除菌后的F5代尿囊液，用10%DMEM培养基进行10倍稀释，取5mL接种到长成单层的DEF上，置于细胞培养箱中，每隔12h观察一次，培养至144h，照此方法在DEF上盲传5代，于光学显微镜下观察并成像。将细胞培养瓶反复冻融3次，无菌条件下收获细胞培养物，提取核酸进行PCR检测。13 河北农业大学硕士学位（毕业）论文2.2.4.3油乳灭活疫苗的制备首先进行油相的配制，配制的方法如下：取白油（注射用）：司班-80（Span-80）：硬脂酸铝=94(mL):6(mL):2(g)，充分混匀后，于121°C高压蒸气灭菌15min后备用；然后配制疫苗的水相，方法如下：取尿囊液（已加入1/1000甲醛灭活48h）：吐温-80（Tween-80）=20(mL):1(mL)，充分混匀；之后取油相：水相=2:1于搅拌机中高速搅拌乳化3min；待乳化完成后进行剂型检验、离心稳定性检验、黏度检验和无菌检验。最后经检验合格的疫苗于4°C保存备用。2.2.4.4兔高免血清的制备健康成年家兔背部皮下多点注射2mL制备的DPV油乳灭活疫苗，之后分别于首免后第7d和21d以同样的方式注射2mL，于最后一次免疫7d后，心脏采血。将兔子仰卧位保定，触压其胸骨部寻找心脏的位置，当感到心脏跳动时，选择入针位置，用碘酒和酒精棉球进行消毒，将5mL注射器与皮肤约呈45°角，缓慢推入，当发现注射器内有回血时，立即用左手固定针头后缓慢抽血，为防止兔子猝死，可以分两次抽血，每次约抽取5mL。将采集的兔血室温放置2h，再放于4°C静置过夜，3000r/min离心15min后收集血清，作为DPV兔高免血清，分装后于-20°C保存备用。2.2.4.5间接免疫荧光试验（IFA）在96孔细胞板中培养DEF，将PCR检测结果呈DPV阳性的F5代细胞培养物接种于长成单层的DEF后72h，小心吸弃培养液，用PBS轻轻冲洗3次，5min/次；1:1加入-20°C预冷的丙酮和甲醇，于室温固定10~15min，洗涤3次；在不同的细胞培养孔中分别加入1:10、1:20、1:50、1:100稀释的DPV兔高免血清，37°C湿盒中作用1h，洗涤3次；加入1:200稀释的羊抗兔IgG-FITC二抗，37°C湿盒中作用1h，洗涤3次；置于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。2.2.5SD株全基因组各片段重组质粒的构建2.2.5.1全基因组各片段PCR引物的设计根据GenBank中已发布的多株DPV和GPV的全基因组序列，应用生物软件PrimerPremier5.0，设计5对相互重叠的引物，用于扩增DPVSD分离株的基因组序列。引物序列如表2所示，由生工生物工程有限公司合成。14 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析表2DPVSD株全基因组序列的扩增引物Table2PrimersofcompletegenomesequenceofDPVSDstrain片段名称长度(bp)上游引物下游引物NameoffragmentsLengthForwardprimersReverseprimersDPV-SEG-1190Fa:5'-CTTATTGGAGGGTTCGTTCGTTCG-3'Ra:5'-GCATGCGCGTGGTCAACCTAA-3'DPV-SEG-21403Fb:5'-GCATGCCGCGCGGTCAGCCCAATA-3'Rb:5'-AACGCAGCCATAGAAGGGTACAGCA-3'DPV-SEG-31551Fc:5'-GTATCCTGTGCGGCTGGGTGAA-3‘Rc:5'-TTTCAGATGCTGCCACAGGTTCG-3'DPV-SEG-41411Fd:5'-TGCGGGAGGTGGTAGCAGTGTC-3‘Rd:5'-GACCTGTGGTGGTGGATTGTGC-3'DPV-SEG-5608Fe:5'-GGACGAGCAGGAAGTAGCACCCACA-3'Re:5'-CTGTTAGGTTGACCACGCGCATGC-3'2.2.5.2分段PCR扩增以提取的DPV的DNA为模板，选择保真性较高的DNA扩增酶及配套缓冲液，用于扩增DPVSD分离株的基因组。50μLPCR反应体系：DNA2μL，ddH2O35μL，10×EasyPfuBuffer5μL，2.5mMHighPuredNTPs5μL，上、下游引物（10μM）各1μL，EasyPfuDNAPolymerse1μL。根据5对引物的退火温度（Tm值）及产物长度设计的Touch-downPCR反应程序如下：Fa/Ra扩增DPV-SEG-1，预变性94°C3min；94°C30s，68~52°C30s，72°C25s，9个循环；94°C30s，58°C30s，72°C25s，25个循环；延伸72°C10min；Fb/Rb和Fc/Rc分别扩增DPV-SEG-2和DPV-SEG-3，预变性94°C3min；94°C30s，68~52°C30s，72°C3min10s，9个循环；94°C30s，57°C30s，72°C3min10s，25个循环；延伸72°C10min；Fd/Rd扩增DPV-SEG-4，预变性94°C3min；94°C30s，68~52°C30s，72°C2min50s，9个循环；94°C30s，58°C30s，72°C2min50s，25个循环；延伸72°C10min；Ff/Rf扩增DPV-SEG-5，预变性94°C3min；94°C30s，60°C30s，72°C1min40s，30个循环；延伸72°C10min。各片段扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用2.2.2中的方法进行目的片段的纯化回收。2.2.5.3各片段重组质粒的构建将纯化回收的SD株基因组的5个片段分别克隆至pEASY-BluntSimple载体，挑取单克隆，应用5个片段对应的PCR体系和反应程序进行菌液PCR检测，将鉴定为阳性的克隆接种至2mLAmp+LB液体培养基，200r/min37°C过夜培养。按照FastPlasmidMiniKit说明书从培养好的菌液中提取质粒，步骤如下：将2mL菌液12000r/min离心1min，将上清尽量吸弃干净；向沉淀中加入250μLBufferP1（需提前加入RNaseA），涡旋充分混匀；继续加入250μLBufferP2，立即温和地上下颠倒数次，使菌体充分裂解，此时菌液变的清亮粘稠；继续加入350μLBufferN3，立即上下颠倒数次，充分混匀后会出现絮状沉淀，12000r/min离心5min；将离心后的上清移入到吸附柱中，12000r/min离心1min，弃掉滤出液，加入400μLBufferPW（提前加入无水乙醇），12000r/min离心1min；弃掉滤出液，12000r/min离心2min；将吸附柱放置于一个新的离心管中，加入75μL的BufferEB，室温静15 河北农业大学硕士学位（毕业）论文置2min，12000r/min离心2min，离心管底部的液体即为提取的质粒溶液。之后将5个片段的质粒送至华大基因公司测序，将测序所得的5个片段的核苷酸序列分别进行BLAST比对。2.2.6SD株全基因组序列的拼接及分析参照GenBank上多株DPV和GPV的核苷酸序列，应用生物软件DNAStarLasergenev7.1中的EditSeq软件进行SD株基因组序列的拼接，将测序所得的各片段的核苷酸序列，拼接整合成为完整的基因组后，研究其全基因组的结构特点以及非结构蛋白（NS蛋白）编码区、结构蛋白（VP蛋白）编码区和ITR区的长度及位置。参考GenBank上发表的多株水禽细小病毒分离株的基因组序列，应用BLAST、Megalign和MEGA5.0软件进行序列的比对分析和遗传进化树的构建，分析其全基因组、NS蛋白编码区、VP蛋白编码区的核苷酸序列或氨基酸序列的同源性以及遗传进化关系。应用在线软件NetNGlyc1.0Server预测SD株与多株水禽细小病毒分离株的潜在糖基化位点，并进行分析。2.2.7荧光定量PCR引物及探针的设计2.2.7.1引物及探针的设计应用Megalign软件分析在GenBank上下载的多株DPVVP3基因的核苷酸序列，应用生物软件PrimerPremier5.0设计1对用于扩增VP3基因的引物F1/R1。然后选取DPVVP3基因序列中相对保守并且与GPV和MDPV有差异的区域，根据荧光定量PCR引物及其探针的设计原则，利用PrimerExpress3.0软件，在VP3基因内部设计1对只用于检测DPV的特异性荧光定量PCR引物F2/R2及1条探针Probe。引物及探针序列如表3所示，引物及探针由上海生工生物技术有限公司合成。表3Taq-Man实时荧光定量PCR试验所用引物及探针Table3PrimersandprobeforTaq-Manreal-timePCR引物（探针）名称序列产物大小(bp)Nameofprimers(probe)SequenceofprimersSizeofproductsF15’-ATGGCAGAGGGAGGAGGC-3’1605R15’-CAGATTTTGAGTTAGATATCTGGT-3’F25’-CAAATTCCATCCTTCTCCAAATCT-3’R25’-TCTGCAGGTACTGGTGTATTCTTGA-3’90Probe5’-FAM-CTGCACAATCCACCACCACAGGTCTTC-ECLIPSE-3’16 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析2.2.7.2荧光定量PCR引物的验证以F5代尿囊液中提取的DNA为模板，进行普通PCR检测，以验证设计的引物F2/R2是否能扩增出目的片段，PCR体系20μL：DNA2μL，ddH2O12.5μL，10×EasyTaqBuffer2.5μL，2.5mMHighPuredNTPs2μL，F2/R2各0.5μL，EasyTaqDNAPolymerase0.5μL。PCR程序：预变性94°C3min；94°C30s，60°C30s，72°C6s，30个循环；延伸72°C5min，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。回收目的片段，将其克隆至pEASY-T1Simple载体，并送至华大基因公司测序。2.2.8PCR反应体系的优化及标准曲线的绘制2.2.8.1重组质粒pMD19-SD-VP3的构建及测序鉴定以提取的DPV的DNA为模板进行PCR，体系50μL：ddH2O36.5μL，DNA2μL，10×EasyTaqBuffer5μL，2.5mMHighPuredNTPs4μL，F1/R1各1μL，EasyTaqDNAPolymerase0.5μL。PCR程序：预变性94°C3min；94°C30s，58°C30s，72°C1min40s，30个循环；延伸72°C10min，PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收目的片段。将回收的VP3片段克隆至pMD19-T载体，培养单克隆并进行菌液PCR鉴定，然后将鉴定为阳性的单克隆接种到2mLAmp+LB液体培养基中，200r/min37°C过夜培养。使用2.2.5中的方法从培养好的菌液中提取质粒，将其送至华大基因公司测序，测序正确的质粒即为构建成功的pMD19-SD-VP3重组质粒。2.2.8.2标准品的制备应用NanoDrop2000核酸浓度测定仪，测定提取的重组质粒pMD19-SD-VP3的浓度。根据DNA拷贝计算公式计算质粒的拷贝数，公式如下：MW(g/mL)=DNA双链长度×660；质粒拷贝数（copies/μL）=(6.02×1023)×质粒浓度(ng/μL)×10-9/MW(g/mL)。质粒的拷贝数为5.68×107copies/μL。根据计算结果，将质粒进行10倍梯度稀释，吸取10μL提取的质粒加入90μL蒸馏水，混匀，依次稀释直至5.68copies/μL。107~100copies/μL共8管标准品制备完成。2.2.8.3反应体系的优化将不同浓度的引物及荧光探针交叉配组，配制于16个不同的反应体系中，利用荧光定量PCR方法，扩增得到16个不同反应体系对应的16条扩增曲线A~P。从中选择最优扩增曲线对应的引物及探针浓度，最终确定最优反应体系。设定的荧光定量PCR反应程序为：预变性95°C30s；95°C5s，60°C35s，35个循环。将F2/R2的浓度稀释为10μM，Probe的浓度稀释为5μM，在反应体系中加入PremixExTaq12.5μL，pMD19-SD-VP3质粒（浓度为107copies/μL）1μL，引物及探针的具体加入量如表4所示，最后用ddH2O补足至25μL。17 河北农业大学硕士学位（毕业）论文表4实时荧光定量PCR引物及探针浓度的优化Table4Optimizationofconcentrationofprimersandprobe探针体积(μL)引物体积(μL)Volumeofprobe引物浓度(μM)VolumeofprimersConcentrationofprimers0.30.60.91.20.3ABCD0.120.6EFGH0.240.9IJKL0.361.2MNOP0.48探针浓度(μM)0.060.120.180.24Concentrationofprobe2.2.8.4标准曲线的绘制采用优化后的荧光定量PCR方法，对102~107copies/μL浓度梯度的标准质粒进行检测，得到扩增曲线及Ct值，对每个浓度的标准质粒均做3次重复检测。然后以质粒浓度的对数（Logconcentration,LgCon）为横坐标，以3次检测得到的Ct值的平均值为纵坐标，绘制出标准曲线，得到标准曲线方程，并计算其相关系数R2和扩增效率（Efficiency,E）。2.2.9荧光定量PCR检测方法的验证2.2.9.1特异性试验用建立的荧光定量PCR方法对鸭细小病毒（DPV）、小鹅瘟病毒（GPV）、新城疫病毒（NDV）、鸭肠炎病毒（DEV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、番鸭细小病毒（MDPV）的核酸进行检测，以验证方法的特异性。2.2.9.2敏感性试验将10倍梯度稀释的107~100copies/μL的标准质粒作为模板，按照优化好的体系进行荧光定量PCR检测，以此验证模板的最低检出量。2.2.9.3重复性试验为了验证建立的检测方法的重复性，选取107、105、103copies/μL这3个浓度的标准品，对同一个批次稀释的样品，每个浓度均做5次重复检测，并且对3个不同批次稀释的样品进行检测。最后利用检测得到的数据，分析Ct值的重复性差异，并计算批内变异系数（Coefficientofvariation,CV）和批间变异系数。2.2.9.4临床样品的检测收集从我国山东、河南、河北地区送检的90份具有典型BADS临床症状的樱18 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析桃谷肉鸭的临床样品（包括肝脏、脾脏、肾脏、胸腺和血清），提取每份样品的核酸，应用本研究建立的荧光定量PCR方法进行检测，同时应用陈浩等[24]建立的常规PCR方法进行检测，比较两种方法的检测结果。19 河北农业大学硕士学位（毕业）论文3结果与分析3.1DPVSD株的分离与鉴定3.1.1发病鸭的流行病学及临床特征BADS多发于10~30日龄的樱桃谷肉鸭，发病率为5%~10%，可见上下喙萎缩，舌外伸肿胀等症状（图2），排白色或黄白色稀粪。后期沉郁、瘫痪，少数患鸭因无法进食而死亡。大多数病鸭出栏时体重仅为健康鸭的70%~80%，严重者体重减半。在抓扑、屠宰过程中，病鸭翅部骨骼、肋骨和胫骨易发生骨折。剖检可见胸腺肿大、出血，舌头肿胀，肠黏膜轻微出血。偶见肝脏微黄、质地较脆，脾脏微肿[2]。图2患鸭临床症状Fig.2Clinicalsymptomsofpathologicautopsyindiseasedducks3.1.2病原PCR检测及纯净性检测结果对提取的DNA/RNA进行PCR/RT-PCR检测，结果显示，病鸭的肝脏和脾脏样品在约659bp的位置出现与预期相符的目的条带，而病料中禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、鸭呼肠孤病毒（DRV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭瘟病毒（DPV）、鸭肝炎病毒（DHV）的检测结果均为阴性（图3）。M123456789bp20001000750659500250100图3发病鸭PCR检测结果图Fig.3PCRdetectionresultsinthediseasedducksM,DL2000Maker；1~7,检测项目依次为AIV、NDV、MDRV、IBV、DTMUV、DPV、DHV；8,肝脏组织中检测细小病毒；9,脾脏组织中检测细小病毒M,DL2000Maker;1~7,DetectionforAIV,NDV,MDRV,IBV,DTMUV,DPV,DHV,respectively;8,DPVdetectioninlivertissue;9,DPVdetectioninspleentissue20 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析3.1.3鸭胚分离毒PCR鉴定结果鸭胚接种DPV144h后，可偶见胚体出血或发育不良。然后以从F5代尿囊液中提取的核酸为模板，利用引物DPV-decF/DPV-decR，进行PCR检测。结果表明，成功从F5代尿囊液中扩增出与预期大小相符约659bp的目的条带（图4），说明分离的病毒可在鸭胚中稳定传代。M12bp20001000750659500250100图4尿囊液PCR检测结果图Fig.4PCRdetectionofthevirusinallantoicfluidsM,DL2000Maker；1,鸭细小病毒；2,阴性对照M,DL2000Maker;1,Duckparvovirus;2,Negativecontrol图5尿囊液PCR目的片段的系统进化树分析图Fig.5ThephylogenetictreebasedonthetargetsegmentofPCRdetectionofallantoicfluids21 河北农业大学硕士学位（毕业）论文将测序所得的659bp的核苷酸序列进行BLAST比对，选取与其有同源关系的病毒分离株，应用Megalign软件进行同源性分析，结果显示，该分离株与GPV分离株核苷酸序列的同源性较高，为92.7%~99.8%，与MDPV分离株的同源性较低，为79.8%~84.4%。应用MEGA5.0软件中的ClustalW方法对各株病毒的序列进行比对，并构建遗传进化树（图5），结果显示，该分离株与2株山东BADS分离株（SDLC01和QH15）和欧洲GPV分离株位于同一分支，多数中国大陆分离株与台湾分离株位于同一分支。结果表明，本研究用鸭胚成功分离得到了一株鸭细小病毒，命名为DPVSD（GenBank登录号：KU516831）。3.1.4EID50测定结果将F5代尿囊液10倍梯度稀释至10-6后，每个稀释度接种4颗鸭胚，孵化至144h后每颗鸭胚单独收取尿囊液并进行PCR检测，根据检测结果，将鸭胚的感染个数及感染率相关数据进行统计，统计结果如表5所示。表5F5代鸭胚尿囊液EID50的测定结果Table5DeterminationresultsofEID50inF5allantoicfluid累计总数病毒稀释度接种个数未感染数感染数Cumulativetotal感染比感染率(%)VirusdilutionInoculationUninfectionInfection感染数未感染InfectionInfectiongradientsnumbersnumbersnumbersInfectionUninfectionratioratenumbersnumbers10-140411011/1110010-240411011/1110010-3404707/710010-4413313/47510-5440050/5010-6440090/90按照Reed-Muench两氏法，计算得到DPVSD株F5代尿囊液的EID50：距离比例=(75%﹣50%)/75%=0.33；log10(EID50)=-4﹢0.33×(-1)=-4.33；EID-4.3350=10/0.1mL。3.1.5动物回归试验结果从攻毒后14d开始，感染组鸭子的体重明显低于对照组，喙长也明显短于对照组，随机宰杀5只鸭，发现病鸭的胫骨、翅骨和肋骨易发生骨折（图6、图7）。感染组鸭的心、肝、肺、肾、胸腺、脾、舌头、泄殖腔均为DPV阳性。从20d开始，部分鸭出现喙萎缩、舌头外伸、精神沉郁和瘫痪等症状，28d宰杀感染组鸭子，体内各脏器中均可检测出DPV（图8）。对照组无明显症状，检测结果均为阴性。22 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析图6攻毒14d感染组与对照组数据对比柱状图Fig.6Datacomparisonfromthecontrolgroupandthechallengedgroupon14dafterinfectionAB图7攻毒28d感染组鸭临床症状图Fig.7Clinicalsymptomsofinfectedduckson28dafterinfectionA,感染鸭短喙症状图；B,感染鸭胫骨骨折症状图A,Beakatrophysymptomofinfectedducks;B,TibialfracturesymptomofinfectedducksM1234567bp20001000750659500250100图8感染组鸭内脏PCR检测结果图Fig.8PCRdetectionresultsoforgansinthediseasedducksM,DL2000Maker；1~7,依次为心、肝、脾、肺、肾、胸腺、舌M,DL2000Maker;1~7,Heart,liver,spleen,lung,kidney,thymusandtonguetissues,respectively3.1.6细胞分离毒PCR鉴定结果将正常细胞和接毒144h后的细胞置于显微镜下观察，发现DEF贴壁后形态呈梭形，并且接毒后未观察到肉眼可见病变（图9）。收获的F5代细胞培养物用PCR方法进行检测，检测结果为DPV阳性，说明分离的DPV可以在DEF中稳定传代。23 河北农业大学硕士学位（毕业）论文图9鸭胚成纤维细胞在光镜下形态观察图（×200）Fig.9Duckembryofibroblastsunderopticalmicroscope(×200)A,感染DPV144h后的细胞；B,正常细胞A,DPV-infectedcellsat144hpostinoculation;B,Uninfectedcells3.1.7细胞分离毒IFA检测结果将分离的F5代细胞毒接种于长成单层的DEF上，以DPV高免兔血清作为一抗，以羊抗兔IgG-FITC作为二抗，先后作用于细胞后，检测其生物学特性，发现分离的F5代细胞毒接种DEF72h后，于倒置荧光显微镜下可观察到细胞呈阳性反应，胞浆呈可见的特异性绿色荧光，而对照组未出现荧光（图10）。结果表明，本研究成功获得了SD株的细胞分离毒。AB图10IFA法检测DPV感染鸭胚成纤维细胞结果图（×200）Fig.10DetectionofDPV-infectedduckembryofibroblastsbyIFA(×200)A,DPV感染细胞；B,对照细胞A,DPV-infectedcells;B,Uninfectedcellsascontrol3.2DPVSD株全基因组序列的测定与分析3.2.1各片段PCR电泳结果应用设计的5对引物，根据高保真DNA扩增酶的特性和引物的Tm值设定PCR体系及扩增程序，分5个片段扩增DPVSD分离株的基因组序列，电泳结果如图1124 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析所示，5个片段扩增产物的大小符合预期结果，DPV-SEG-1~DPV-SEG-5的长度分别为190bp、1403bp、1551bp、1411bp和608bp。M12345bp20001000750500250100图11DPVSD分离株基因组各片段PCR电泳结果图Fig.11AmplicationproductsoffivegenomefragmentsofDPVSDstrainbyPCRM,DL2000Maker；1,DPV-SEG-1PCR扩增产物；2,DPV-SEG-2PCR扩增产物；3,DPV-SEG-3PCR扩增产物；4,DPV-SEG-4PCR扩增产物；5,DPV-SEG-5PCR扩增产物；M,DL2000Maker;1,TheamplicationofDPV-SEG-1;2,TheamplicationofDPV-SEG-2;3,TheamplicationofDPV-SEG-3;4,TheamplicationofDPV-SEG-4;5,TheamplicationofDPV-SEG-53.2.2全基因组序列特征分析根据上述测序所得的5个相互重叠的片段的核苷酸序列，以及GenBank上多株水禽细小病毒的基因组结构特点，应用生物软件EditSeq将5个片段的核苷酸序列剪切、拼接整合成完整的基因组，并将全基因组序列上传至GenBank（登录号：KY511124）。拼接结果显示，DPVSD株的基因组全长5053bp。分析其核苷酸组成，腺嘌呤A含量最高，占比29.4%，鸟嘌呤G含量为23.9%，胸腺嘧啶T含量为23.7%，胞嘧啶C含量为23.0%。基因组的两端均由反向互补的ITR组成，形成发卡结构，编码区由2个大的ORF组成，LORF区编码非结构蛋白NS，包括NS1和NS2两种蛋白，NS2蛋白完全包含于NS1蛋白中，且这两种蛋白共用一个位于2392~2394nt的终止密码子。RORF区编码结构蛋白VP，包括VP1、VP2和VP3三种蛋白，VP2和VP3蛋白完全包含于VP1蛋白中，并且VP3蛋白完全包含于VP2蛋白中，三种蛋白共用同一个位于4609~4611nt的终止密码子。全基因组的各个区域的长度、位置及蛋白编码区编码氨基酸的个数见表6。表6DPVSD分离株全基因组结构表Table6CompletegenomicstructureofDPVSDstrain5’ITRNS1NS2VP1VP2VP33’ITR长度(bp)38018841356219917641605379Length位置(nt)1~380511~23941039~23942413~46112848~46113007~46114675~5053Position编码氨基酸数(aa)/628452733588535/Numbersofaminoacids25 河北农业大学硕士学位（毕业）论文将拼接所得的DPVSD株的全基因组核苷酸序列与GenBank上登录的多株DPV、GPV和MDPV的核苷酸序列进行BLAST比对，从比对结果中选取32株水禽细小病毒的全基因组核苷酸序列。应用MEGA5.0软件对它们的核苷酸序列进行遗传进化分析并构建系统发育树（图12）。结果显示，所有DPV和GPV分离株同属一个大分支，而所有MDPV独立位于另一个大分支，说明与DPV和MDPV的亲缘关系相比，DPV和GPV亲缘关系更近一些。作为BADS分离株的成员之一，SD株与其他BADS分离株和GPV欧洲分离株的亲缘关系较近，同属一个分支。应用Megalign软件进行全基因组核苷酸序列的同源性分析（图13），发现SD株的全基因组序列与其他BADS分离株的全基因组序列的同源性最高，其中，与JS1的同源性最高，高达100%，其次是与SDLC01、SC16和DS15株的同源性较高，均高达99.8%，与GPV全基因组序列的同源性为92.7%~97.3%，而与MDPV全基因组序列的同源性较低，仅为81.1%~85.0%。BADSisolatesDPVSDLC01(China)DPVDS15(China)DPVSD(China)DPVSC16(China)GPVJS1(China)GPVQH15(China)GPV82-0321V(Taiwan)EuropeGPVGER(Poland)GPVB(Hungary)GPVVG32/1(Germany)GPVRC16(China)GPVWX(China)GPVYZ(China)GPVGPVY(China)GPVYan-2(China)AsiaGPVSHFX1201(China)GPVLH(China)GPVYZ99-6(China)GPV06-0329(Taiwan)GPV82-0321(Taiwan)GPVSH(China)GPVGDaGPV(China)GPVSYG61v(China)MDPVSAAS-SHNH(China)MDPVZW(China)MDPVGX5(China)MDPVLH(China)MDPVMDPVFM(Hungary)MDPVFZ91-30(China)MDPVYY(China)MDPVP(China)MDPVP1(China)0.01图12DPVSD分离株全基因组序列遗传进化分析图Fig.12PhylogeneticanalysisbasedoncompletegenomicsequencesofDPV,GPVandMDPV26 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析图13DPVSD分离株全基因组序列同源性分析图Fig.13SequencedistancesanalysisbasedoncompletegenomicsequencesofDPV,GPVandMDPV3.2.3NS基因序列特征分析将测序所得的SD株的非结构蛋白编码基因NS与其他DPV、GPV和MDPV的NS基因的核苷酸序列进行比对，构建系统遗传进化树（图14），并将核苷酸序列和氨基酸序列分别进行同源性比较（图15、图16）。进化分析结果显示，SD株与另外17株DPV和GPV处于同一个大的分支，纵观所有DPV和GPV分离株，宿主为樱桃谷肉鸭或北京鸭的7个BADS分离株位于同一个小分支，而相对于其他GPV分离株来说，这7个毒株与一株经典的台湾GPV82-0321V疫苗株和荷兰GPVGER致病株亲缘关系较近，处于同一分支。同源性分析显示，SD株与其他BADS分离株NS基因的核苷酸序列的同源性为99.8%~100%，与GPVNS基因的核苷酸序列的同源性为93.5%~97.9%，与MDPVNS基因的核苷酸序列的同源性为82.2%~82.6%。SD株NS基因的氨基酸序列除了与SDLC01的同源性为99.5%外，与其他BADS分离株氨基酸序列同源性均为100%，与GPVNS基因的氨基酸序列的同源性为95.7%~97.8%，与MDPVNS基因的氨基酸序列的同源性为89.5%~90.0%。27 河北农业大学硕士学位（毕业）论文DPVDS15(Cherryvalleyduck.Chinamainland)DPVSD(Cherryvalleyduck.Chinamainland)DPVSC16(Cherryvalleyduck.Chinamainland)GPVJS1(Pekingduck.Chinamainland)GPVQH15(Pekingduck.Chinamainland)DPVSDLC01(Cherryvalleyduck.Chinamainland)GPVAH1(Pekingduck.Chinamainland)GPV82-0321V(Goose.Taiwan)GPVGER(ornamentalduck.Poland)GPVVG32/1(Goose.Germany)GPVB(Anseranser.Hungary)GPV06-0329(Goose.Taiwan)GPV82-0321(Goose.Taiwan)GPVSHFX1201(Swan.Chinamainland)GPVYZ99-6(Goose.Chinamainland)GPVSH(Anseranser.Chinamainland)GPVGDaGPV(Goose.Chinamainland)GPVSYG61v(Goose.Chinamainland)MDPVSAAS-SHNH(Muscovyduck.Chinamainland)MDPVZW(Muscovyduck.Chinamainland)MDPV-GX5(Muscovyduck.Chinamainland)GPVD(Muscovyduck.Chinamainland)GPVPT(Muscovyduck.Chinamainland)MDPVLH(Muleduck.Chinamainland)0.01图14DPVSD分离株NS基因遗传进化分析图Fig.14PhylogeneticanalysisbasedonNSgeneofDPV,GPVandMDPV图15DPVSD分离株NS基因核苷酸序列同源性分析图Fig.15SequencedistancesanalysisbasedonnucleotidesequencesofNSgeneofDPV,GPVandMDPV28 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析图16DPVSD分离株NS基因氨基酸序列同源性分析图Fig.16SequencedistancesanalysisbasedonaminoacidsequencesofNSgeneofDPV,GPVandMDPV3.2.4VP基因序列特征分析将测序所得的SD株的结构蛋白编码基因VP与其他DPV、GPV和MDPV的VP基因的核苷酸序列进行比对，构建系统遗传进化树（图17），并将核苷酸序列和氨基酸序列分别进行同源性比较（图18、图19）。进化分析结果显示，SD株与另外17株DPV和GPV分离株处于同一个大的分支，纵观所有的DPV和GPV分离株，宿主为樱桃谷肉鸭或北京鸭的7个BADS分离株位于同一个小分支，它们都与一株台湾疫苗株82-0321V和多株欧洲源的GPV分离株亲缘关系较近，处于同一分支，但与台湾疫苗株亲缘关系更近一些。同源性分析显示，SD株与其他BADS分离株VP基因的核苷酸序列的同源性为99.7%~100%，与GPVVP基因的核苷酸序列的同源性为93.0%~97.5%，与MDPVVP基因的核苷酸序列的同源性为87.9%~89.0%。SD分离株与BADS分离株VP基因的氨基酸序列的同源性为99.5%~100%，与GPVVP基因的氨基酸序列同源性为95.9%~99.0%，与MDPVVP基因的氨基酸序列同源性为91.5%~92.8%。29 河北农业大学硕士学位（毕业）论文DPVSC16(CherryValleyduck.Chinamainland)GPVJS1(Pekingduck.Chinamainland)GPVQH15(Pekingduck.Chinamainland)DPVSD(CherryValleyduck.Chinamainland)DPVDS15(CherryValleyduck.Chinamainland)GPVAH1(Pekingduck.Chinamainland)DPVSDLC01(CherryValleyduck.Chinamainland)GPV82-0321V(Goose.Taiwan)GPVGER(ornamentalduck.Poland)GPVB(Anseranser.Hungary)GPVVG32/1(Goose.Germany)GPVGDaGPV(Goose.Chinamainland)GPVSYG61v(Goose.Chinamainland)GPVSHFX1201(Swan.Chinamainland)GPVY(Muscovyduck.Chinamainland)GPVYZ99-6(Goose.Chinamainland)GPV82-0321(Goose.Taiwan)GPV06-0329(Goose.Taiwan)GPVDY(Muscovyduck.Chinamainland)GPVD(Muscovyduck.Chinamainland)MDPVLH(Muleduck.Chinamainland)GPVPT(Muscovyduck.Chinamainland)MDPVZW(Muscovyduck.Chinamainland)MDPV-GX5(Muscovyduck.Chinamainland)MDPVSAAS-SHNH(Muscovyduck.Chinamainland)0.01图17DPVSD分离株VP基因遗传进化分析图Fig.17PhylogeneticanalysisbasedonVPgeneofDPV,GPVandMDPV图18DPVSD分离株VP基因核苷酸序列同源性分析图Fig.18SequencedistancesanalysisbasedonnucleotidesequencesofVPgeneofDPV,GPVandMDPV30 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析图19DPVSD分离株VP基因氨基酸序列同源性分析图Fig.19SequencedistancesanalysisbasedonaminoacidsequencesofVPgeneofDPV,GPVandMDPV图20DPVSD分离株ITR区缺失序列分析图Fig.20DeletionregionsinITRofDPVSDstraincomparedwithDPV,GPVandMDPV31 河北农业大学硕士学位（毕业）论文3.2.5ITR区序列特征分析应用Megalign软件将SD株与其他DPV、GPV和MDPV的ITR区核苷酸序列进行比对，比对报告显示（图20），与其他水禽细小病毒分离株相比，SD株的ITR区存在部分碱基的缺失和替换，SD株、SDLC01株、QH15株和82-0321V疫苗株的ITR区均于100~114nt和337~350nt的位置存在14个碱基的缺失。3.2.6潜在糖基化位点预测分析应用在线软件NetNGlyc1.0Server对包含SD株在内的多株水禽小病毒的NS和VP蛋白上的潜在糖基化位点进行预测和分析。结果显示，NS蛋白的潜在糖基化位点在各株水禽细小病毒之间高度保守，它们都含有3个相同的潜在糖基化位点—150~152NKT、225~227NYS和360~362NWT。然而在不同的水禽细小病毒分离株之间，VP蛋白上的潜在糖基化位点的种类差别较大。预测结果显示，SD株的VP蛋白上存在3个潜在糖基化位点，分别为219~221NAS、331~333NLT和703~705NRT。所有水禽细小病毒的VP蛋白上都存在219~221NAS和331~333NLT这2个相同的潜在糖基化位点，MDPV分离株的VP蛋白上普遍存在6或4个糖基化位点，DPV和GPV分离株VP蛋白上普遍存在3或4个糖基化位点。3.3DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立3.3.1Taq-Man实时荧光定量PCR引物的验证利用引物F2/R2进行普通PCR，电泳结果显示，成功扩增出与预期大小相符的约90bp的目的片段，未出现非特异性条带（图21）。测序结果经过BLAST比对，结果显示，与多株DPVVP3基因核苷酸序列的同源性为100%，因此，F2/R2可以用作DPV的Taq-Man实时荧光定量PCR的检测引物。M12bp50030020010090图21荧光定量PCR特异性引物的验证结果图Fig.21ConventionalPCRproductsoffluorescenceprimersM,MakerI；1,DPV；2,阴性对照M,MakerI;1,DPV;2,Negativecontrol32 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析3.3.2标准品的制备3.3.2.1VP3基因PCR扩增结果利用引物F1/R1，以提取的DPV的核酸为模板，进行PCR扩增，结果表明，成功扩增出与预期大小相符的约1605bp的片段（图22）。M1bp200016051000750500250100图22VP3基因的PCR扩增结果图Fig.22PCRproductsofVP3geneM,DL2000Maker；1,VP3基因M,DL2000Maker;1,VP3gene3.3.2.2重组质粒pMD19-SD-VP3鉴定结果将测序所得的1605bp的核苷酸序列翻译成氨基酸，经过在线BLAST比对，结果显示，与多株DPV和GPV的VP3蛋白的氨基酸序列的同源性为100%，表明重组质粒pMD19-SD-VP3构建成功。3.3.3反应体系的优化结果将不同浓度的引物及探针交叉配制于16个不同的反应体系中，通过荧光定量PCR方法得到16条扩增曲线A~P。如图23所示，可见应用曲线L对应的引物及探针浓度的搭配时，即在反应体系中加入F2/R2各0.9μL，终浓度为0.36μM，加入Probe1.2μL，终浓度为0.24μM时，检测样品时可以较早地收获荧光信号，即获得较小的Ct值和较强的信号强度。33 河北农业大学硕士学位（毕业）论文L图23荧光定量PCR引物及探针浓度的优化结果图Fig.23Optimizationresultofprimersandprobeconcentration经过对反应体系中引物和荧光探针终浓度的优化，可确定最终的DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法的反应体系如表7所示：表7DPVTaq-Man实时荧光定量PCR的最终反应体系Table7FinalreactionsystemoftheTaqman-basedreal-timefluorescentquantitativePCRassayofDPV体系组成体积(μL)ComponentsVolumePremixExTaq12.5F2(10μM)0.9R2(10μM)0.9Probe(5μM)1.2DNA1ddH2O8.5总体积(Total)253.3.4标准曲线的绘制以102~107copies/μL标准质粒为模板，采用优化后的反应体系，进行3次荧光定量PCR检测。以标准质粒浓度的对数为横坐标，以每个样品的Ct值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线。如图24所示，在102~107copies/μL标准品之间形成了良好的线性关系，以此得到质粒拷贝数和样品Ct值之间的线性方程为：y=-3.36LgCon﹢40.79(R2=0.999)。其相关系数R2=0.999，扩增效率E=-1﹢10(-1/-3.36)=98.4%。34 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析图24荧光定量PCR标准曲线图Fig.24StandardcurveoffluorescencequantitativePCR3.3.5特异性试验结果如图25所示，应用建立的荧光定量PCR检测方法，对DPV阳性样品进行检测，得到了一条特异性扩增曲线，而对小鹅瘟病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、新城疫病毒（NDV）、鸭肠炎病毒（DEV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）的检测结果均为阴性。说明该方法具有很强的特异性。12~7图25荧光定量PCR方法的特异性试验结果图Fig.25SpecificityofthefluorescentquantitativePCRassay1,模板为DPV；2~7,模板依次为GPV、NDV、DEV、MDRV、DTMUV、MDPV1,DPVastemplate;2~7,GPV,NDV,DEV,MDRV,DTMUV,MDPVastemplates,respectively35 河北农业大学硕士学位（毕业）论文3.3.6敏感性试验结果将10倍梯度稀释的107~100copies/μL的标准质粒，应用建立的荧光定量PCR方法进行检测，如图26所示，质粒的最低检出量可达到102copies，说明该方法具有较高的灵敏性。1234567~8图26荧光定量PCR方法的敏感性试验结果图Fig.26SensitivityofthefluorescentquantitativePCRassay1~8,浓度为107~100copies/μL的标准质粒模板1~8,107~100copies/μLstandardplasmids3.3.7重复性试验结果如表8所示，对同一批次稀释的107、105、103copies/μL的标准品，每个浓度做5次重复检测，计算得到批内变异系数分别为1.05%、0.37%、0.65%。对3个不同批次稀释的样品进行检测，计算得到批间变异系数分别为1.18%、0.98%、0.92%。以上数据结果说明，此检测方法具有良好的重复性。表8荧光定量PCR方法的重复性试验结果Table8ReproducibilityofthefluorescentquantitativePCRassay批内变异批间变异Intra-assayvariabilityInter-assayvariability质粒浓度(copies/μL)CtCtPlasmidconcentration平均值标准差CV(%)平均值标准差CV(%)MeanS.D.MeanS.D.10717.090.181.0517.800.211.1810523.110.090.3723.510.240.9810330.880.200.6531.620.290.9236 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析3.3.8临床样品检测结果应用两种方法对采集的90份临床样品进行检测，结果显示，应用建立的荧光定量PCR方法检测，DPV的检出率为100%（90/90），应用普通PCR方法检测，DPV的检出率为82.2%（74/90）。有16份用建立的荧光定量PCR方法检测为阳性的样品，应用普通PCR方法进行检测，结果为阴性，且这16份样品均为血清样品。结果进一步说明了荧光定量PCR方法的敏感性更高，并可应用于临床样品的检测。37 河北农业大学硕士学位（毕业）论文4讨论4.1DPVSD株的分离与鉴定作为近年来中国大陆新发的一种传染病，BADS病原的命名尚未统一，有研究人员将其命名为新型鸭细小病毒[71]，还有人将其命名为鸭源新型鹅细小病毒[77]、新型鹅细小病毒[78]、鸭细小病毒等[2]。就其本质而言，BADS的病原实际上是一种鹅细小病毒的变异株，基因水平上的某些变异导致其宿主范围、临床症状和剖检病变等均发生了一系列的改变，但它归根到底是一种水禽细小病毒，赋予它新的命名是为了和同属于水禽细小病毒的鹅细小病毒和番鸭细小病毒作区分，因此在探明病原的本质之后，纠结于其命名的意义不大。为了叙述方便，在本文中将其统称为了鸭细小病毒（Duckparvovirus,DPV）。水禽细小病毒需要在宿主细胞培养的同时接种病毒，以达到增殖目的。本研究分离的SD株可在鸭胚及DEF中传代培养，本研究发现SD株在鸭胚上稳定传至F10代后开始产生病变，表现为部分鸭胚的尿囊膜水肿增厚，颜色发灰，尿囊液变得粘稠而不易吸取，颜色偏褐色，偶见胚体出血或发育不良，但是到目前为止（已传代培养至F46），绝大多数鸭胚均能培养至144h而不发生死亡。此外，到目前为止（已传代培养至F16），还未发现SD株可以致DEF产生细胞病变。因此，若使用鸭胚来测定病毒的毒价，只能靠单颗收取鸭胚尿囊液，通过PCR方法来测定EID50，如此在大批量收获尿囊液、提取核酸、配制PCR体系和电泳检测的整个过程中，必须时刻注意避免样品之间的交叉污染而影响测定结果，需要勤换手套、及时更换枪头、避免触碰管盖内侧等容易沾染核酸的部位等，也可以选择分批次操作。若想通过DEF测定毒价，只能通过IFA等方法来确认细胞是否感染DPV，而不能通过观察细胞病变来测定TCID50。因此，SD株的这些生物学特性给病毒毒价的测定造成了一定的困难。目前大部分研究都以测定EID50作为确定DPV毒价的主要依据，本研究利用鸭胚测定的DPVSD株的EID-4.3350为10/0.1mL，但因为目前国内SPF鸭胚很难获得，所以此数据很有可能会受到不同批次鸭胚状态的影响，而导致毒价的测定结果不够稳定。因此，此类病毒毒价的测定方法还有待改善和建立。先前的研究表明，GPV是一种泛嗜性病毒，即该病毒感染雏鹅后存在于患病鹅的大部分组织器官内[79-80]。有研究显示，剖检发现感染DPV的病鸭体内不同的器官均可出现不同程度的水肿和出血，组织病理学变化主要表现在病鸭的心、肝、肾、胰腺、肺脏等组织可出现不同程度的炎性细胞浸润、细胞变性、出血、充血及坏死[81-82]，应用PCR方法检测，体内各脏器（心、肝、脾、肺、肾、胸腺、法氏囊、脑、胰腺、小肠、舌等）均有病毒检出[2,81,83]。以上研究均可表明DPV也是一种具有组织泛嗜性的病毒。38 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析4.2DPVSD株基因组全序的测定与分析本研究对DPVSD分离株的全基因组序列进行了测定与分析。结果显示，SD株全长5053bp，基因组两端为反向互补的ITR区，由此形成的发夹结构导致了基因组两端的扩增较为困难，因此本研究以ITR“泡”区的“对称中心”——sphI酶切位点（GCATGC）为界限，将ITR区分成了2段进行扩增。基因组中间有两个ORF，分别编码非结构蛋白NS和结构蛋白VP，整个基因组的结构特征与GPV和MDPV十分相似。先前的研究表明，细小病毒的ITR区与病毒的复制包装和感染力强弱有关[16,84]。ITR区核苷酸序列的比对结果显示，与其他水禽细小病毒相比，SD（樱桃谷肉鸭）、SDLC01（樱桃谷肉鸭）、QH15分离株（北京鸭）和鹅源的台湾82-0321V疫苗株的ITR区均于100~114nt和337~350nt的位置存在14个碱基的缺失，起初怀疑ITR区的部分缺失与GPV宿主发生改变有关，但随着近两年宿主同为北京鸭或樱桃谷肉鸭的BADS分离株JS1、SC16和DS15的陆续报道，经过比对发现，它们却没有这2段缺失，说明这2段序列的缺失和GPV宿主范围的改变无关，但至于这2段碱基的缺失对于病毒毒力强弱的影响是否存在意义还有待进一步的试验验证。全基因组、NS基因和VP基因的遗传进化分析结果均显示，SD株与所有BADS分离株的亲缘关系最近，同源性最高可达100%，并且和与GPV亚洲分离株的亲缘关系相比，它们与一株经典的台湾GPV82-0321V疫苗株和欧洲源的GPV分离株亲缘关系较近，而与MDPV分离株的基因组序列的亲缘关系较远。由此可以推测，引发BADS的病原可能是GPV疫苗株的广泛应用引起了基因变异，从而导致宿主范围发生改变，也有可能是引入欧洲种禽时将病原带入我国的。另外，从NS基因和VP基因的同源进化分析结果来看，SD株的VP基因比NS基因在各水禽细小病毒之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性更高，即在进化过程中变异差异更小，保守性更强一些，因此提示虽然NS和VP蛋白都具有抗原性，但是在今后研制基于SD株的DPV基因工程疫苗时要尽量选取VP蛋白，以加大对各种变异亚型病毒的免疫保护作用，避免因病毒变异而造成免疫逃避。4.3DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立由于不同水禽细小病毒之间的同源性较高，核苷酸序列具有很高的相似性，并且存在抗原交叉反应，这给建立一种能够将DPV与GPV、MDPV区分开来的分子生物学或血清学诊断方法造成了一定的困难。荧光定量PCR采用全程封闭扩增，可有效避免样品污染和环境污染，相对于普通PCR来说，荧光定量PCR的灵敏性更强，还可以在定性的同时实现病原的定量检测。荧光定量PCR方法包括染料法和探针法。探针法虽然成本较高，但是比染料法具有更好的特异性，检测结果更加准确，避免了染料法非特异性扩增而导致的假阳性问题的出现。在本研究建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法中，引物和探针的存在给DPV的特异性检测提供了双39 河北农业大学硕士学位（毕业）论文重保证，该方法能够特异地针对DPV进行检测，与GPV和MDPV的DNA无杂交反应，与NDV、DEV、MDRV、DTMUV等常见的鸭疫病病原也均无杂交反应，探针的加入还提高了检测的灵敏度，DPV核酸的最低检出量可达到102copies，对BADS临床样品的阳性检出率可达到100%。总之，此检测方法特异性强、灵敏性高、可重复性良好，可应用于临床检测。在应用本研究建立的荧光定量PCR方法检测临床样品时，可能由于样品采集自不同发病日龄的病鸭，病毒具体在某种组织中的含量分布规律并不明显，但总体来说，组织样品中DPV的DNA含量（4.10×103copies~6.68×107copies）要高于血清样品中的DNA含量（2.47×102copies~1.62×103copies）。本研究建立的荧光定量PCR方法可应用于后续探索研究DPV在宿主体内各组织的含量分布规律。自BADS疫情出现至今，尚无有效针对该病的预防和治疗措施，有部分鸭场采用组织灭活疫苗预防具有一定的效果。病鸭生长发育迟缓，骨质变脆，采集病鸭的泄殖腔棉拭子进行PCR检测，检测结果呈阳性，表明可通过粪便排毒，因此在饲养管理过程中应加强注意，饲料中可适量增加钙、磷、维生素等以保障鸭机体对钙磷的吸收，促进骨骼生长，此外应保持鸭舍整洁，通风良好，及时清理粪便等。DPV是GPV的变异株，先前的研究表明，小鹅瘟发病初期注射GPV的高免血清可有效降低死亡率，鸭源抗GPV卵黄抗体对GPV的感染有极显著的预防和治疗效果[85]，这为DPV的预防和治疗提供了良好的思路。为了更有效地防控该病，我们应当加强对疫源地及周边地区肉鸭群的疫情监控，同时，加快疫苗的研制是预防该病极为重要的手段。40 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析5结论5.1本研究从发生BADS的樱桃谷肉鸭病料中，利用鸭胚及其成纤维细胞分离并鉴定出了一株鸭细小病毒，命名为DPVSD株，并确定其为引发BADS的病原。5.2本研究对DPVSD株的全基因组序列进行了测定与分析。结果表明，DPVSD株全长5053bp，由两端的ITR和中间的ORF组成。LORF长1884bp，编码非结构蛋白NS，RORF长2199bp，编码结构蛋白VP。SD株与GPV的亲缘关系较近。5.3本研究建立了一种针对DPV的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法，该方法特异性强，敏感性高，可重复性良好，可应用于临床样品的检测。41 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鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析在读期间发表的学术论文[1]崔元,王建昌,李玉保,等.鸭短喙–侏儒综合征及其病原的初步研究[J].中国预防兽医学报,2016,38(5):348-351.[2]崔元,王建昌,王金凤,等.牛病毒性腹泻病毒基因分型二重RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医杂志,2017,53(7):20-23.[3]崔元,李晓轩,孙继国,等.基于RNA-Seq筛选新型鸭细小病毒感染鸭胚成纤维细胞的差异表达基因[J].现代畜牧兽医,2018(5):1-6.[4]崔元,邹云婧,陈萍,等.我国兽医公共卫生存在的两个问题及对策[C].第五届京津冀畜牧兽医科技创新论坛暨北京畜牧兽医学会论文集,2016,322-326.[5]崔元,陈萍,李佳暖,等.各类PCR技术的比较研究[C].第五届京津冀畜牧兽医科技创新论坛暨北京畜牧兽医学会论文集,2016,293-300.[6]崔元,李佳暖,陈萍,等.产单核细胞李氏杆菌研究进展[C].第五届京津冀畜牧兽医科技创新论坛暨北京畜牧兽医学会论文集,2016,308-316.[7]崔元,李佳暖,陈萍,等.鸭肝炎病毒研究进展[C].第五届京津冀畜牧兽医科技创新论坛暨北京畜牧兽医学会论文集,2016,337-342.[8]袁万哲,崔元,经美,等.鸭短喙–侏儒综合征研究初报[J].中国动物保健,2016,(5):73-74.[9]王建昌,王金凤,崔元,等.BVDV一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医学报,2018(2):245-251.[10]邹云婧,崔元,经美,等.猪皮炎肾病综合征的诊治与防控措施[J].猪业科学,2016,33(6):136-137.[11]李佳暖,李得鑫,崔元,等.牛病毒性腹泻高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报,2018(2):252-254.[12]邹云婧,梁中银,崔元,等.凸隆病毒的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2017(7):51-53.[13]左奕,郑英帅,崔元,等.几种常见猪繁殖障碍性疫病混合感染和综合防制措施[J].北方牧业,2016(9):28-28.[14]李佳暖,李得鑫,崔元,等.仔猪白痢病原菌的分离鉴定与敏感药物筛选[J].今日畜牧兽医,2016(9):53-54.47 河北农业大学硕士学位（毕业）论文作者简介姓名：崔元性别：女出生日期：1993年02月06日籍贯：山东省东营市学习经历：2011年9月~2015年6月，就读于河北农业大学动物医学院动物医学专业。2015年9月~2018年6月，就读于河北农业大学研究生学院预防兽医学专业。研究生在读期间参加的科研项目：2016年1月~2018年3月：主持了河北省研究生创新资助项目——新型鸭源细小病毒感染鸭胚成纤维细胞的基因表达谱分析。2016年3月~2017年3月：参与了河北省大学生创新创业训练计划项目——鸭短喙长舌综合征病因分析。研究生在读期间的获奖情况：2015~2016学年：荣获校级“一等学业奖学金”；获校级“优秀学生干部”荣誉称号。2016~2017学年：荣获校级“一等学业奖学金”；获校级“优秀共青团员”荣誉称号；获校级“优秀研究生”荣誉称号；第一作者发表于中国预防兽医学报的论文《鸭短喙–侏儒综合征及其病原的初步研究》获“中国畜牧兽医学会奖”；第一作者发表的4篇论文获“第五届京津冀畜牧兽医科技创新论坛暨北京畜牧兽医学会十二届新思想、新观点、新方法演讲优秀奖”。48 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析致谢时光荏苒，转瞬间三年的硕士生涯己经到了尾声。蓦然回首，这三个春夏秋冬的学习和科研经历，给我留下了很多感动和美好回忆。在此，谨向三年来对我谆谆教导的两位导师——孙继国教授和袁万哲教授致以最衷心的感谢！首先，要特别感谢我的导师孙继国教授。尊敬的孙老师学识渊博，治学严谨，做事精益求精，他崇高的师德，谨己宽人的风范，平易近人的魅力都使我终身难忘，开导我做人处世的道理更使我受益匪浅。从论文选题、实验设计、数据处理与分析到论文撰写，无不凝聚着老师的无限汗水与心血。值此论文即将完成之际，向我的恩师孙继国教授致以最诚挚的谢意和祝福！在此，也要特别感谢我的指导老师袁万哲教授。尊敬的袁老师工作认真，才思敏捷，勇于创新，他踏实做科研的钻研精神、对学生高度负责的认真态度、诚恳而真挚的待人方式、淡泊名利一心求学的人生信条，这三年来都给了我留下了非常深刻的印象，这些都深深地影响了我，他教会了我如何做科研，如何做工作，如何做人！感谢两位恩师三年来对我的指导与帮助，谨此，向我的两位恩师致以最诚挚的感谢和祝福！感谢预防兽医方向所有老师们给予我的大力支持与帮助，在此，还要特别感谢宋勤叶教授、秦建华教授、范京惠副教授、左玉柱副教授、王家鑫教授在学业和研究中给予我的鼓舞与支持！感谢我的师兄、师姐、师弟、师妹们三年来给予我的帮助与支持。感谢王金凤、孙明潭、郑英帅、戚妍、左奕、柴瑞影、李佳暖、邹云婧、李雅楠、张珊、陈萍、经美、李晓轩、庞琳琳、庞笑语、郭金硕、赵志显、田青、孙振席、杨兴淼、翟佳璐、张哲等兄弟姐妹们，感谢他们在我学习和生活中的无私帮助！此外，还要感谢我的父母多年来对我默默无闻的奉献、理解与支持，他们是我永远的前进动力。借此机会，谨向所有关心、支持和帮助我的老师、同学、家人和朋友表示深深的感谢！崔元2018年5月49 鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析学科专业:预防兽医学研究方向:兽医食品卫生检验学研究生:崔元指导教师:孙继国袁万哲“鸭短喙-侏儒综合征”（Beakatrophyanddwarfismsyndrome,BADS）是一种以雏鸭发育不良、喙萎缩变形、舌外伸肿胀、腹泻和骨质疏松为主要特征的传染病。自2014年11月以来，该病在我国大陆东南多省的商品肉鸭群中发生并流行，发病率为5%~10%，严重时可达50%以上，患鸭出栏体重较健康鸭降低20%~30%，严重者仅为正常体重的50%。该病导致感染鸭群的料肉比显著升高，出栏合格率下降，给我国肉鸭养殖业造成了严重的经济损失，受到了国内外研究人员的广泛关注。面对此严峻形势，本研究旨在从流行病学与病原学角度出发，分离相关病原进行致病性分析，明确引发BADS的病因，探究致病病原的相关特性，并建立病原的实验室检测方法，为该病的防控提供理论依据及技术支持。本文主要从以下3个方面进行论述：首先，为了探究BADS的致病原因并分离得到病原，本研究应用PCR/RT-PCR方法，对从山东聊城发生BADS的鸭群中采集的组织样本进行了检测，排除了其他鸭常见的疫病病原，最终将该病的病原命名为鸭细小病毒（Duckparvovirus,DPV）。将DPV阳性病料研磨液上清通过尿囊腔途径接种鸭胚，盲传5代后收获尿囊液，利用鸭胚测定得到了F5代尿囊液的EID50为10-4.33/0.1mL。提取F5代尿囊液的核酸，进行PCR检测，结果显示，成功从F5代尿囊液中扩增出了与预期大小相符的目的片段。将PCR产物克隆至pEASY-T载体并进行测序，将测序所得的659bp的核苷酸序列进行同源性分析及遗传进化分析，结果显示，该分离株与DPV和鹅细小病毒（Gooseparvovirus,GPV）的同源性较高，为92.7%~99.8%，而与番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus,MDPV）同源性较低，为79.8%~84.4%。然后采用肌肉注射和口服的5EID方式，将接种剂量为1050/只的尿囊液接种至樱桃谷肉鸭，可复制出BADS的临床症状，最终确定本研究成功分离到了一株DPV，将其命名为DPVSD。此外，本研究还利用鸭胚成纤维细胞（Duckembryofibroblasts,DEF）对病毒进行了分离培养。将F5代尿囊液接种于长成单层的DEF上，盲传5代后，应用PCR方法进行检测，可扩增出与预期大小相符的目的条带。应用DPV兔高免血清作为一抗，以FITC-羊抗兔IgG作为二抗，通过间接免疫荧光试验（Immunofluorescenceassay,IFA）检测其生物学特性，发现分离的F5代细胞毒接种DEF72h后，细胞胞浆呈可见的特异性绿色荧光。结果表明，本研究成功获得了SD株的细胞分离毒。DPVSD株的成功分离为DPV的进一步研究打下了基础。其次，为了进一步探究DPV分子水平上的特性，本研究根据水禽细小病毒的基因组特征，设计了5对重叠引物，对SD株的全基因组序列进行了分段扩增。并对其全基因组、NS基因和VP基因分别进行了结构特征分析和同源进化分析。结果表明，SD株基因组全长5053bp，由两端的末端倒置重复序列（Invertedterminalrepeat,ITR）和中间的开放阅读框（Openreadingframe,ORF）组成。左侧ORF（LORF）长1884bp，编码非结构蛋白NS，包括NS1和NS2两种蛋白。右侧ORF（RORF）长2199bp，编码结构蛋白VP，包括VP1、VP2和VP3三种蛋白。同源进化分析结果显示，SD株的全基因组序列与其他BADS分离株的同源性最高，其中，与JS1的同源性高达100%，与SDLC01、SC16和DS15分离株的同源性均为99.8%，与GPV分离株全基因组序列的同源性为92.7%~97.3%，而与MDPV分离株的全基因组序列同源性较低，为81.1%~85.0%。全基因组、NS基因和VP基因的遗传进化分析结果均显示，SD株与其他BADS分离株的亲缘关系最近，同源性可高达100%，并且和与GPV亚洲分离株的亲缘关系相比，它们都与一株经典的台湾GPV82-0321V疫苗株和多株欧洲源的GPV分离株亲缘关系较近，而与MDPV分离株的基因组序列 的亲缘关系较远。此外，与绝大多数水禽细小病毒相比，SD株的ITR区于100~114nt和337~350nt的位置分别存在14个碱基的缺失。最后，对SD株的NS蛋白和VP蛋白进行了潜在糖基化位点的预测分析，结果表明，SD株NS蛋白上的3个潜在糖基化位点为150~152NKT、225~227NYS和360~362NWT，VP蛋白上的3个潜在糖基化位点为219~221NAS、331~333NLT和703~705NRT。本研究为DPV的分子致病机制及分子流行病学调查的深入研究奠定了基础。最后，本研究通过PCR方法，扩增了DPVSD株的VP3基因，将其克隆至pMD19-T载体，构建了重组质粒pMD19-SD-VP3，测定质粒浓度后根据公式换算成拷贝数，将其进行10倍梯度稀释，制备了107~100copies/μL共8管标准品。然后选取VP3基因中在各株DPV之间较为保守且和其他水禽细小病毒有差异的区域，设计了1对荧光定量PCR引物F2/R2及1条荧光探针Probe。应用普通PCR方法对设计的引物进行验证，成功扩增出与预期大小相符约90bp的目的片段。随后进行了反应体系的优化，将不同浓度的引物及探针交叉配制于16个不同的反应体系中，通过荧光定量PCR方法得到了16条扩增曲线A~P，最终确定了当应用曲线L对应的引物及探针浓度搭配时，即在反应体系中加入的F2/R2终浓度为0.36μM，Probe终浓度为0.24μM时，检测样品时可获得较小的Ct值和较强的信号强度。应用优化后的反应体系，对102~107copies/μL的标准质粒进行3次重复检测，以质粒浓度的对数为横坐标，以3次检测得到的Ct值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线并得到线性方程及相关系数。最后对建立的DPV荧光定量PCR检测方法的特异性、灵敏性和可重复性进行验证，并应用建立的方法对具有典型BADS临床症状病鸭的90份临床样品进行检测。结果表明，建立的DPVTaq-Man实时荧光定量PCR方法的特异性强、灵敏性高、可重复性好，临床样品中的DPV阳性检出率为100%，该方法可应用于临床样品的检测。此检测方法的建立为DPV的实验室诊断提供了有力的技术支持。关键词：鸭细小病毒；分离鉴定；全基因组；荧光定量PCR