猪细小病毒ppvsd1株vp2基因重组腺病毒表达载体的构建

《猪细小病毒ppvsd1株vp2基因重组腺病毒表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

万方数据第39卷第8期2008年8月东北农业大．学学报JournalofN砷∞mA#culturalUniversity39(8)：100-103Aug．2008文章编号1005—9369(2008)08-0100-04猪细小病毒PPV—SDI株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建王金良，沈志强‘，管宇，曲光刚，唐娜(山东省滨州畜牧■医研究院。山东省畜禽用蜂胶疫苗工程技术研究中心，山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600)摘要：通过细酋内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PlⅣ)¨哩基因的重组腺病毒表达栽体。将y忍基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShutth—CMV上，并将重组质粒pShutde-CMV／VP2用PineI线性化后转化至携带有腺病毒骨榘栽体pAOF螂一1的大肠杆茵BJ5183感受态细胞，经细茵内同源重组产生重组腺病毒质粒pAaV邺,一VP2。为进一步研究PPV腺病毒活栽体疫苗奠定了基础。关键词：猪细小病毒；VP2基因；重组腺病毒中图分类号：鼹船；$852．65文献标识码：A猪细小病毒(PorcineParvovirus，PPV)属细小病毒科，可引起猪的繁殖障碍病，给世界各国的养猪业造成了巨大经济损失。我国80年代中后期频繁从国外引种，使该病在我国迅速传播。近几年对我国规模化养猪场造成的危害尤为严重，同其它许多病毒病的防治一样，该病也主要以免疫预防为主【11。目前已有10多个国家研制出了PPV疫苗，包括弱毒疫苗与灭活疫苗。尽管PPV的弱毒苗和灭活疫苗在猪细小病毒病的预防控制中起到了十分重要的作用，但是各种疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗发生重组与毒力返强及圆环病毒污染的潜在威胁，灭活疫苗生产细胞不稳定、生产困难、生产成本高等【2】。因此寻找更为安全有效的疫苗一直是猪细小病毒免疫预防研究的主题。现有研究表明，以腺病毒为表达载体的基因工程疫苗具有良好的应用前景，该载体介导的基因具有转移效率高、感染细胞谱广、病毒滴度高、易于浓缩和贮存等诸多优点【31。’本试验构建了包含PPVVP2基因的腺病毒质粒，为成功研制安全有效的PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。收稿日期：2008-02—18基金项目：山东省自然科学基金项目(Y2005D10)作者简介：王金良(t97s-)，男，黑龙江人，研究实习员，硕士，主要从事动物分子病毒学与免疫学研究工作。+通讯作者E-mail：bzshenzq@sina．coin1材料与方法I．I质粒及菌株腺病毒穿梭载体pShuttle—CMV、腺病毒骨架．载体'pAclEasy一1、DH5a、BJ5183、及携带有PPV、y挖基因的重组质粒pcDNA3．1(+)一VP2由本实验室保存并提供。’1．2工具酶及其它试剂盒。T4DNA连接酶、KpnI、XbaI、砌酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自大连宝生物公司。PmeI、PacI等限制性内切酶购自NEB公司。1．3鉴定引物鉴定引物为构建pcDNA3．1(+)一VP2重组质粒时设计的，由上海生物工程有限公司合成。引物序列为：iP1：5’-ACAg丛!盟ACCGCAATGGGTGAAAA一3’(含BarnHI酶切位点)iP2：5’一AAGCGGCCGCAGTI’丌：-I'AT兀'ACAGAGT-3’(含NotI酶切位点)’1．4目的基因获得用KpnI、XbaI限制性内切酶双切携带有PPVVP2基因的重组质粒pcDNA3．1(+)-VP2，回收1．8kb的目的片段。1．5重组腺病毒穿梭载体的构建将回收得到的VP2基因与同时用勋nI、XbaI 万方数据第8期王金良等：猪细小病毒PPV-SDI株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建·101·限制性内切酶双切的腺病毒pShuttle-CMV载体用3"4DNA连接酶进行连接。按常规方法将连接产物转化DH5tx感受态细胞中，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，进行克隆，提取质粒。采用酶切、PCR等方法进行鉴定，得到阳性重组质粒，命名为pShume—CM、WP2。1．6重组腺病毒质粒的构建用骨架载体pAdEasy一1转化大肠杆菌BJ5183，制备携带腺病毒骨架载体的感受态菌。将重组穿梭载pShuttle—CMV／VP2用PineI内切酶线性化，转化至含携带腺病毒骨架载体的感受态菌BJ5183。取适量的细胞涂入含50nag·mL_卡那霉素的培养皿中，于37℃培养16～20h，挑选卡那抗性克隆，小量提取质粒DNA，用0．8％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析及PacI酶切图谱分析。将所得的重组腺病毒质粒以上述同样条件电转入宿主菌DH5n,，在此宿主菌内可获得大量高质量的质粒，挑选目的克隆，命名为pAdEasy—VP2。2结果与分析2．1VP2基因的获得酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析表明，切出了与y挖基因相应的约1800bp大小的特异片段，与预期结果相符，见图1。M一标准分子量DLIS000；l—^，pⅡl／XbaI酶切M-DNAMarkerDLl5000；1-Recombinantplasmiddigestedby和nl膳6口l图1VP2基因鉴定啦!IdentificationofVP2gene2．2重组腺病毒穿梭载体的构建将所获得的含有VP2基因的腺病毒穿梭质粒用却nI和XbaI双酶切，可切出一条约l800bp的片段，PCR扩增也出现同样大小的片段，见图2。M一标准分子量DLl5000；l—^≯nI酶切；2-KpnVXbaI酶切：3-PCR产物M-DNAMarkerDLl5000；,1-Shuttleplasmiddigestedby却厅I；2-ShuttleplasmiddigestedbylO,nI／XbaI：3-Product0fPCR图2重组穿梭质粒鉴定n昏2Identificationofrecombinantshuttleplasmids2．3复制缺陷型腺病毒质粒的获得将重组穿梭质粒线性化后；氯化钙法转化至BJ5183感受态菌，挑取阳性克隆，小量提取质粒，用0．8％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果见图3。质粒有两种，一种为没有与腺病毒骨架重组上的穿梭载体质粒，另一种为重组上的质粒，与pAd—Easy一1大小相似，而大于穿梭载体质粒，PaeI限制性内切酶酶切后可产生约4．5l【b和33kb的条带，PCR扩增出1．8kb的VP2基因片段，其结果与预期相符，见图4。1，2，3，5—pshuttle-CMV／VP2；4--重组腺病毒质粒．I，2，3，5-Plamid0fpShuttle--CMV／VP2；4-Plasmidofrecombinantadenovims图3重组腺病毒质粒电泳鉴定rig．3IdentificationofpAdEasy一、rl眩byagarosedectrophoresis 万方数据东北农业大学学报第39卷和抗体和细胞毒性T细胞的产生，能有效抵抗狂一犬病病毒的攻击[71。Moraes等构建了含有口蹄疫病毒Pl一24和3CD基因的重组腺病毒表达载体，免疫猪体后用同型口蹄疫病毒攻击，结果表明其具有很好的保护作用嗍。而有关PPV腺病毒活载体疫苗的研究国内尚未见报道。因此，本研究将y忍基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle—CMV上，通过在带有recA重组酶的大肠杆菌内同源重组，将目的基因表达盒插入到缺失E1和E3区的人腺病毒5型骨架质粒中。通过PCR扩．增和序列测定证明，目的基因可以在重组病毒中M—DNA分子质量标准DLl5000；1-PacI单酶切；2-PER扩增稳定遗传。这些试验结果为PPV基因工程活载体M—DNAMark盯DLl5000；1一R舢1bi。mmpl”mlddige8tedbYPacI；疫苗研究奠定了基础。2-AmplicationofPCR图4pAdEasy-VP2鉴定【参考文献]Fig．4IdentificationofpA珊gasy-VPZ3讨论¨1茎==茎三=茹‘黼锐明-嘶-北，VP2蛋白是构成PPV病毒粒子的主要结构蛋【2】吕建强，陈焕春，赵俊龙猪细小病毒疫苗研究进展田．动物医白，其在体外表达后，可以自我装配成病毒样颗学进展。2002，23(1)：31—34．粒，具有很好的免疫学活性。Martinez等将PPV【3】孙朝晖，修波，崔志强，等．腺病毒表达载体pAdEasy一1／VP2基因成功地在昆虫细胞中高效表达，用其免疫pAdTrack--CMV-Shh-N的构建及表达叨．中华神经外科疾病研母猪能诱导产生强烈的免疫应答闱；sedlik等分别究杂志，2006,t邓)：2舡243．将PPVVP2和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病毒的【4】MartinezC。叫sgaardKLop,％deTurisoJ气eta1．Productionof118～132位氨基酸及乙肝病毒HBSAg的抗原决定簇porcineparvovirtmemptyeap8idswithhigllimmunogemcactivity区相连，利用该重组蛋白免疫鼠也可以诱导强烈的们．Vaccine,1992,lo(10)：6肄枷．CTL反应，在体内持续时间长达9个月，并可抵抗【5】sedlikc，Dridi气1)eriaudE'eta1．Intnmasaldelivery0f籼一致死量的相关病毒攻击阁。李斐等对VP2蛋白的主binantparvoviruslikepmicleselicitscytotoxicTcelland要抗原位点区域进行了原核表达，通过Westeronneutralizing枷bodyresponses[J1．JViroL1999，73(4)：2739一Blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活2744．性阀。这些研究结果确立了VP2基因在PPV预防方【6】李斐’曹瑞兵，周斌'等．猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位法研究中的地位。基因的原核表达及检测应用饥冲国病毒学，2005，20圆：507一活载体疫苗是近年来研究热点之一。由于外510．源基因已经作为载体病毒自身结构的一部分，其[71XiangzQ，Pa8quims，ErtlHC．Inductiondgenitalimmunityby所产生的免疫应答水平通常不低于完整病毒相应DNApnminsandintranasalboosterimmunizationwitharepli一成分所引起的免疫强度；而腺病毒载体在哺乳动cation-defectiveadenoviralr—xanbinant[J]．1mmunoL1999，162：物多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性，6716-6723．且宿主范围较广，不仅能感染能进行分裂的细胞，【8】MoracsMP，bhyrGA。MasonPW，eta1．Earlyprotection也能感染不再分裂的细胞如神经细胞，使其在基againsthomologouschallengeafterasi嚼edoseofreplication一因疫苗及基因治疗的研究中广受青睐。Xiang等利defectivehumanadenovirustype5expressingeapsidproteinsof用狂犬病毒的G基因构建了复制缺损型重组腺病footandmouthdiseases砌nA24田．Vacdne，2002，20：1631一毒，经皮下、呼吸道等途径接种小鼠，可诱导中1639· 万方数据第8期王金良等：猪细小病毒PPV-SDI株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建-103·一··‘1●'』●●-J■pl-1■ConstructionandldenUnCatlon0lrecomDinantadenovlrUScontainingporcineparvovirusPPV-SD1strain肫geneWANGJinliang，SHENZhiqiang，GUANYu，QuGuanggang，TANGNa(Slmndo唱BinzhouAnimalScienceandVetetineryMedicineAcademy，ShandongPropdisVaccineResearchPopIll丑l缸撕∞。lheM,mmComer，虢咖LvduBio—lndumyco”Ltd·，Bin血ousIl|mdon$256600，China)Abstract：Recombinantreplication-defectivehumanadenovirusserotype5vectorcontainingporcineparvo—·vires(PPV)y忍genewasconstructedusingthemethodofhomologousrecombinationinbacteria．Firstly．¨呓geneWassubclonedintoadenovirusshuttlevectors．AndthenthepositiverecombinantplasmidpShuttle-(：MV／-—2WaslinearizedbyPineIandcarriedintoAd—BJ5183competentcellsthathadalreadybeentransformedwithadenovirusskeletalvectorspAdEasy-1．therecombinantadenovimsplasmidpAdEasy—VP2weresuccessfullyobtained．TheseresultsindicatedthatrecombinantadenoviruscouldbeusedonanimhforPPVrecombinantadenovirusvaccine．Keywords：porcineparvovirus；卯2gene；recombinantadenovims