抗体药物的质量控制方法

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1、抗体药物产品质控方法概述2012.12目录（一）理化检测（二）生物学测定（三）非免疫球蛋白杂质分析1蛋白含量测定：Lowry法、双缩脲法（药典）原理：基于蛋白质在碱性环境中与Cu2+反应形成复合物，并与合适的试剂（Lowry：酚试剂；双缩脲：双缩脲试剂）形成有颜色且稳定的络合物，利用标准蛋白质作对照，采用紫外-分光光度法测定蛋白质含量。BCA法：基本原理与lowry，双缩脲基本相同BCA(bicinchoninicacid)钠盐是一种稳定的水溶性复合物，可与Cu+高度特异性结合，产生紫色复合物。该复合物在562nm处有最大吸光值，并与蛋白浓度成正比。以BSA为标准品求得标准曲线，进而计算

2、未知蛋白样品的浓度2装量标示装量以重量计的产品以“重量法”检查装量，除另有规定外取供试品5个（50g以上者3个），除去外盖和标签，容器外壁用适宜的方法清洁并干燥，分别精密称定重量，除去内容物，容器用适宜的溶剂洗净并干燥，再分别精密称定空容器的重量，求出每个容器内容物的装量与平均装量，应符合规定。如有1个不符合规定，则另取5个（或3个）复试。溶剂通过半透膜由低浓度溶液向高浓度溶液扩散的现象称作渗透，阻止渗透所需施加的压力，即为渗透压。正常人体液渗透压为285~310mOsmol/kg，生理盐水和5%葡萄糖溶液与之相当。渗透压的测定一般由冰点降低法间接求得。通常采用测量溶液冰点下降来间接测定

3、其毫渗透压摩尔浓度。①：△T=Km式①中，K--冰点降低常数，溶剂不同，K值不同，对水溶剂K=1.86；m--渗透压摩尔浓度。而渗透压符合：②：P'=K'm式②中，P‘为渗透压，K’为渗透压常数，m为溶液重量摩尔浓度。由于式①和式②中浓度等同，故可以用冰点下降法测定溶液的渗透压摩尔浓度。测定药物溶液的渗透压时，只要能测得药物溶液的冰点降低值，就可求出。对药物的注射剂、滴眼剂等，要求制成适合人体的等渗溶液。3渗透压美国Advanced公司Fiske210型冰点渗透仪4-1可见异物检查“可见异物系指存在于注射液和滴眼剂中，在规定条件下目视观测到的任何不溶性物质。”——《2010版药典》附录V

4、B方法要点：1复溶冻干制剂，环境100级，方法按说明书2抽检量5支，去标签清除外壁污痕，静置一段时间（抗体制剂要过夜）3设备4人员要求：校正视力5.0以上，无色盲5无色溶液1000-1500lx，有色或透明塑料容器，2000-3000lx6标准6-2不溶性微粒检查法“本法在可见异物检查符合规定后，用以检查静脉注射剂（溶液型注射液、折射用无菌粉末、注射用浓溶液）及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量。”——《2010版药典》附录VI方法要点：光阻法1环境要求100级2溶剂要求用不大于1.0μm的微孔滤膜过滤3外壁洗净后按要求复溶样品4静置2分钟或适当时间（抗体不超过4小时）脱气5

5、依法测4支或混匀后测4次，取后3组数据计算平均值6设备及原理7标准100ml以下静脉注射液（无菌粉末），≥10μm微粒不多于6000个，≥25μm微粒不多于600个7-1鉴别试验（ELISA方法）ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附剂测定）指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性（鉴别）和定量（活性）方法。方法分类：1双抗体夹心法2间接法3竞争法ELISA原理动画7-2鉴别试验（免疫荧光）免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）基于免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。免疫荧光技术就是

6、将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。利用此技术进行组织或细胞内抗原物质的定位（鉴别）和定量（活性，如仙台CIU检测）。方法分类：1直接法（Direct）2间接法（Indirect）免疫荧光动画CIU检测荧光照片（FITC）7-3SDS-PAGESDS-PAGE（SDS：十二烷基硫酸钠，PAGE：Polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳），聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式及目的：还原性和非还原性。还原性（添加强还原剂，如β巯基乙醇或DTT

7、）是常规的SDS-PAGE，还原剂打开二硫键，SDS打开非共价键，所以使蛋白还原变性为椭圆形单体，使蛋白质1级结构的分子量大小逐渐呈梯度分开（鉴别；轻重链分析）；非还原性（不添加强还原剂）在电泳的过程中，蛋白没有完全去折叠。保持这一定的４级结构（多聚体、降解分析）。SDS-PAGE动画SDS-PAGE实例M：marker1：理化对照品2~4:3批次抗体非还原电泳图1非还原性SDS-PAGE电泳图谱M：marker1~3:3批次抗体还