羊肚菌多糖提取分离条件的研究

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1、羊肚菌多糖提取分离条件的研究羊肚菌又名羊肚菜、美味羊肚菌,隶属于子囊菌亚门(Asycotina)盘菌纲(Disycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella),共有28种,在我国陕西、甘肃、青海等20多个省市都有着极为广泛的分布[1]，且在世界多个国家有分布。羊肚菌多糖是羊肚菌主要的活性成分之一,具有抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等多种药理活性。有研究表明,羊肚菌多糖对小鼠肝脏损伤有明显的保护作用[2]。由此,提高羊肚菌多糖的提取率也是

2、将其应用于工业生产的关键步骤。常规的羊肚菌多糖提取方法以热水浸提为主,贾氏等[3]研究发现,羊肚菌菌丝体多糖最佳的提取条件为：浸提温度90℃,浸提时间150min,浸提次数2次,加水比1∶40。鉴于单纯热水浸提多糖的提取量有限,笔者在前人研究基础上进行了改进,研究超声及其酶法对多糖得率的影响,为工业生产提供必要的研究基础。　　1材料与方法　　1.1试药与仪器供试菌种羊肚菌GIM5.69[(Morchellaesculenta(L.)Pers.)]及黑脉羊肚菌GIM5.29(Morchellaelat

3、a),广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。纤维素酶和果胶酶由Solarbio公司提供,标准葡聚糖DextranT70为Pharmacia公司产品,其余试剂均为国产分析纯。Labofuge400R台式冷冻离心机(德国Heraeus),恒温培养箱(上海智城),RE-52旋转蒸发仪(上海青浦沪西),BP211D电子天平(德国Sartorius),MLS-3750灭菌器(日本Sanyo)。　　1.2培养基及培养方法工程论文发表斜面培养基：采用PDA培养基,含土豆10%、蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏

4、0.5%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O0.05%,无菌接种后25℃培养7～10d,4℃保存。液体种子培养基：含蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、MgSO40.05%、KH2PO40.05%；每瓶200mL分装于500mL三角瓶中,灭菌后从斜面培养基上接种,25℃摇床培养10～14d,转速180r/min。发酵培养基：含蔗糖4%、NH4NO30.3%、KH2PO40.15%、MgSO40.15%、酵母膏0.5%；每瓶200mL分装于500mL三角瓶中,灭菌后按2%接种量吸取摇床

5、培养的种子培养液接种,25℃摇床培养10～14d,转速180r/min。　　1.3多糖提取经过以上培养后得到的羊肚菌菌丝体经过干燥后用于多糖提取,本研究将羊肚菌菌丝体分别以超声、纤维素酶、果胶酶处理后进行多糖提取,并将结果与常规热水浸提加以比较,以获得优化多糖提取方式。　　1.3.1热水浸提　　称取5g干菌丝体,粉碎后加入40倍体积的去离子水,90℃,150min,残渣重复浸提2次。合并上清液,过滤。在37℃条件下,上清液用旋转蒸发仪浓缩至适当体积并以ΦMolish反应；FeCl3反应；(CTAB)

6、络合反应[5]；硫酸-咔唑反应；I2-KI反应；同时在190～390nm波长范围内对羊肚菌多糖进行扫描。2结果　　2.1粗多糖重量比较　　(见表1)表1粗多糖重量比较（略）从粗多糖重量比较上分析,与单纯热水浸提相比,超声及酶法均可明显提高粗多糖得率。工程论文发表　　2.2苯酚-硫酸法检测多糖含量及制作标准曲线根据苯酚-硫酸法检测结果制作标准曲线,多糖含量与吸光度A490之间的关系满足方程Y＝0.0071X－0.0455,其中X为A490,Y为溶液中多糖含量。　　2.3粗多糖中总糖含量检测测得羊肚菌多

7、糖的A490值,对照标准曲线方程Y＝0.0071X－0.0455计算所得的总糖含量。结果见表2、表3。表2黑脉羊肚菌GIM5.29的多糖得率（略）表3羊肚菌GIM5.69的多糖得率（略）　　在以往对多糖提取方法的优化研究中,通常以最终粗多糖得率来衡量提取技术优劣,如武氏等[6]对羊肚菌多糖提取方法优化后所得粗多糖得率为2.58%。该衡量标准较直观快捷,但因粗多糖中仍存在一定杂质,故结果可能有一定误差。本研究在统计粗多糖重量基础上进一步采用苯酚-硫酸法精确测量粗多糖中总糖含量,从糖得率上看数值较低,但

8、结果更为精确。试验结果表明,超声和酶法处理均可显著提高多糖得率,且两类菌种多糖得率也有明显差异。提取方法以超声10min,超声频率为40kHz,在90℃下,恒温加热150min,浸提2次,多糖的得率最高。两种菌种之中,以GIM5.69型菌种多糖得率较高。　　2.4多糖性质测定羊肚菌多糖溶于水,不溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。与I2-KI反应不显示蓝色,说明其为非淀粉类多糖。与斐林试剂反应及FeCl3反应为阴性,说明不含单糖和多酚类物质；Molish反应为阳性,