豚鼠镜片诱导型近视眼中rarβ表达的变化

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1、豚鼠镜片诱导型近视眼中RARβ表达的变化【关键词】近视眼;豚鼠;视黄酸核受体β　　Abstract　　AIM:Toinvestigatetheretinoicacidreceptorβ(RARβ)expressioninguineapigeyesandstudytherelationshipbetentalmyopia.　　METHODS:Fiftyguineapigsizedintothenormalcontrolgroup(n=10),defocusⅠgroup(n=20)anddefocusⅡgroup(n=20).Guineapigsinthedefocusgrou

2、pseasuredbeforeandaftermunohistochemistyand)和镜片诱导型近视(lensinducedmyopia,LIM)[1]。这两种近视眼动物模型都说明屈光状态的发育依赖视觉，视觉环境异常可促使视网膜释放一些信使来影响眼球生长。其中，视黄酸(retinoicacid,RA)[2,3]和视黄酸受体β(retinoicacidreceptorβ,RARβ)[4,5]是调节实验性近视眼发生发展的重要信息分子，但作用机制尚不清楚。RARβ在哺乳动物LIM的作用报道较少。我们前期研究工作中已成功建立豚鼠离焦诱导型近视眼模型，戴10.00D诱导镜14d和28

3、d分别诱导出(5.51±1.90)D和(8.69±2.46)D的相对近视，随戴镜时间的延长近视程度加深。在本实验中我们将研究RARβ在诱导眼中的表达变化，探讨RARβ的表达在哺乳动物镜片诱导性近视眼形成中的作用，从而为实验性近视发病机制的研究提供一条思路。　　1材料和方法　　1.1材料　　选用3～4周龄健康三色豚鼠50只，雌雄不限，体质量180～220g，由辽宁医学院实验动物中心提供。YZ24带状光检影镜(苏州六六视觉公司)、US2000A超仪(日本Nidek)、PCR扩增仪(英国Techne)、RARβ兔多克隆抗体(美国SantaCruz)、兔Envision试剂盒(北京中

4、杉金桥)、RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(大连宝生物)。　　1.2方法　　将50只豚鼠随机分成3组，离焦Ⅰ组(n=20，右眼戴诱导镜，左眼不戴作为对照，诱导14d);离焦Ⅱ组(n=20，右眼戴诱导镜，左眼不戴作为对照，诱导28d);空白对照组(10只20眼，n=20，除检查外不做任何干预)。将10.00D诱导镜粘贴在豚鼠右眼周围皮毛上，作为离焦实验眼。饲养温度维持在20℃～25℃，湿度40%～60%，自然光照。白天隔2h观察豚鼠1次，如镜片脏，用棉签通过环形kt板镜框预留的小孔清洗镜片;如镜片脱落则及时固定。采用单盲法设计，所有检测人员均不知实验动物的具体分组和干预措施。

5、图1豚鼠视网膜内核层RARβ蛋白的表达(Envision×400)A：Ⅱ组离焦眼强阳性(箭头);B：Ⅰ组离焦眼;C：空白组;D：Ⅰ组对照眼;E：Ⅱ组对照眼。　　1.2.1RARβ蛋白表达的检测　　动物模型制作结束时，Ⅰ，Ⅱ组各随机选择5只豚鼠，空白对照组随机选择3只，深度麻醉处死，摘取眼球浸入40g/L多聚甲醛固定液中固定24h，组织脱水，石蜡包埋，5μm连续切片，切取眼球后极部组织，常规脱蜡至水，微波抗原修复，染色步骤按Envision试剂盒内说明书进行，一抗工作浓度为1∶50，用已知阳性表达片为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。应用CIAS1000细胞图像分析系统软件进行

6、图片分析，每个实验组随机选取3张切片，每张切片随机选取5个有阳性表达的视野，对RARβ免疫组织化学染色结果进行平均灰度值的半定量检测，取其平均值。另Ⅰ，Ⅱ组各随机选择6只豚鼠，空白对照组随机选择3只，深度麻醉处死豚鼠，迅速摘取眼球，无菌操作，冰台上用显微剪沿角巩膜缘剪开，去除眼前段组织和玻璃体，快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织，置于灭菌的1.5mL离心管中，标号液氮速冻后移入80℃冰箱冻存。取出冻存的视网膜、脉络膜及巩膜组织，加入细胞裂解液，充分剪碎组织后，匀浆。取蛋白样品20μg，进行SDSPAGE电泳分离蛋白质。转膜，封闭，加抗体(一抗和二抗浓度1∶1000)，洗膜，显色。

7、GeneTools软件分析系统分析目的条带灰度值。　　1.2.2RARβmRNA表达的检测　　提取总RNA：取出冻存的各组视网膜、脉络膜及巩膜组织，Trizol法提取总RNA。RARβ和豚鼠βactin引物如下：RARβ上游5’ACACCACGAATTCCAGTGCT3’，下游5’AGGCAGATGGCACTGAGAAG3’，扩增片段长度379bp;βactin上游5’GAGACGAAGCCCAGAGCA3’，下游5’C