体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胆碱能样神经元

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1、体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胆碱能样神经元作者：井绪东张洹陈丽何冬梅【摘要】　　目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞能否分化为胆碱能样神经元。方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），取2～4代MSCs，进行诱导其向胆碱能神经元分化。诱导方案：10%胎牛血清诱导2d；换液为DMEM/F12培养基，加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、巯基乙醇(ME)、维甲酸(RA)、神经生长因子(NGF)，诱导8d；加入表皮生长因子(EGF)，肝素（Heparin）继续诱导8d。空白对照组不作任何处理。观察诱导后的形态变化。采用

2、RTPCR检测巢蛋白（nestin），核受体相关因子（Nurr1），胆碱乙酰转移酶（ChAT）mRNA的表达，间接免疫荧光法检测表达nestin、ChAT、神经核蛋白（NeuN)，乙酰胆碱酯酶(AchE)的阳性细胞。结果诱导后细胞形态逐渐由长梭形变为圆形或椭圆形，突起形成；RTPCR显示，诱导后的细胞高表达nestin、Nurr1、ChAT，且基因表达相对强度与未诱导的MSCs比较有显著差异（P<0.01）。免疫荧光法检测显示，诱导后的细胞高表达nestin、ChAT、NeuN、AchE，且阳性细胞大于80

3、%，而对照组除ChAT阳性细胞为1%外，其他均为阴性。结论大鼠MSCs可诱导为胆碱能样神经细胞。【关键词】间充质干细胞；胆碱能神经元；大鼠；生长因子13　　【Abstract】ObjectiveToexplorethedifferentiationofratmarrowmesenchymalstemcells(MSCs)intocholinergiclikeneuronsbyinducingreagents.MethodsMSCsfromratbonemarrowwereisolatedandpurifiedbyc

4、ellculture,whichwereinducedanddifferentiatedintocholinergiclikeneuronswith2～4generationsof　MSCsbyinducingreagents.Theprotocolwasasfollows:MSCswereincubatedwith10%FBSfor2daysandthenmediumwasreplacedbyDMEM/F12complementedwith10μg/LofbFGF,0.1mmol/Lof2ME,1mmol/Lo

5、fRA,10μg/LofNGFfor8days.Andthen10μg/LofEGFand1250U/mlofheparinwereaddedintotheculturesystemforculturefor8days.RTPCRandgelelectrophoresiswereusedtodetectgeneexpressionofnestin,Nurr1,cholineacetyltransferase(CHAT).Immunologicalfluorescentstainingwasusedtomeasur

6、enestin,CHAT,NeuN，acetylcholineesterase(AchE)positivecells.ResultsInducedcellsgraduallybecamefromlongshuttleintoroundorellipsewithneuronlikedendrite.RTPCRshowedthattheinducedneuronlikecellsexpressedspecialneurocytegenesofnestin，Nurron，CHAT.Indirectimmunologi

7、calfluorescentstainingshowedpositivecellswithnestin，CHAT，NeuN，AchEreached80%respectively.ConclusionsMSCsfromrat13bonemarrowcandifferentiateintocholinergiclikeneurons.　　【Keywords】Mesenchymalstemcells;Cholinergicneuron;Rat;Growthfactors　　骨髓间充质干细胞(MSCs)具有向多种细胞系分化

8、的潜能。近年来发现它还具有向神经细胞分化的潜能,为治疗神经损伤、帕金森病、早老性痴呆等神经退行性疾病带来了希望，是组织工程种子细胞〔1，2〕。就目前MSCs向神经分化研究而言，国内外大多数研究集中在MSCs在体内外分化为神经元样细胞及神经干细胞或胚胎干细胞向胆碱能神经元分化〔3，4〕，尚未见MSCs直接向特异性胆碱能神经元分化的系统报道。本实验