细胞实验方法大全

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1、试剂、试剂盒仪器、耗材细胞冻存和细胞复苏细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二中基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的吋间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞A形成胞A再结品对细胞造成损伤。实验材料细胞D-Hanks液小牛血清培养液青霉素链霉素胰蛋白酶HCINaHC03DMSO甘油微量加样枪吸头离心管冻

2、存管枪头胶塞移液管玻璃瓶红血球计数板记号笔医用橡皮膏移液枪超浄工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱液氮冰箱一、材料准备1.仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4°C、-20°C,-70°C）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。2.玻璃器皿：吸管（弯尖、直尖）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。3.塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1〜2ml）。实验4.其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液步骤枪。5.试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗

3、（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCI、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。二、细胞冻存1.配制含10%DMS◦或甘油、10〜20%小牛血淸的冻存培养液。2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。1.离心1000rpm,5min。2.去除胰蛋G酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5x106/ml〜1xio7/ml。3.将细胞分装入冻存管中，每管1〜1.5ml。4.在冻存管

4、上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。5.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1〜-2°C/min;当温度达-25°C以下时，可增至-5°C〜-10°C/min;至U-100°C时，则可迅速浸入液氮中。也可将装冇细胞的冻存管放入-2(TC冰箱2h,然后放入-70aC冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器闪。三、细胞复苏1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37°C温水中，并不吋摇动令其尽快融化。2.从37°C水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。3.离心，1000rpm，5min。4.弃去上清液，加

5、入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37°C培养箱静置培养。5.次口更换一次培养液，继续培养。收起2意项注事1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液。将冻存管放入液氮容器或从屮取出时，要做好防护工作，以免冻伤。3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。一、冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞A形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就

6、大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，0的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。二、慢冻程序1.标准程序：采用细胞冻存器当温度在-25°C以上吋，1〜2°C/min；当温度达-25°C以下时，5-10°C/min；当温度达-100°C时，可迅速放入液氮中。2.简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋阀定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2"C的速度,在40min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。其仙3.传统程序:冷冻管置于4°C10分钟y20aC30分钟一>-80°C16〜1

7、8小时（或隔夜）—液氮槽长期储存。三、低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。四、细胞冻存方法1.预先配制冻存液（1）10%DMSO+细胞生长液（20%血清+基础培养液）（2）10%甘汕+细胞生长液（20%血清+基础培养液）2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1><106~5MO

8、6细胞/ml）。1.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻H期。液氮长期保存。五、保存细胞的复苏方法1.快速解冻冻存细胞从液氮屮取出后，立即放入37"C水浴屮，轻轻摇动冷冻管，