仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响

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1、仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响【关键词】仙台病毒载体；树突状细胞；蛋白质组　　【Abstract】AIM：Toinvestigatetheproteinchangesinimmaturedendriticcells(DC)infectedinedintheimmatureDCinfectedensionalgelelectrophoresis(2DE)andvisualizedbysilverstaining.Digitalimagesassfingerprinting(PMF)usingMALDITOFMS.RE

2、SULTS:Morethan40proteinspotsdisappearedin2DEofthetreatedgroup.Amongthem5proteinspotsthatic　　【摘要】目的：研究仙台病毒载体对未成熟树突状细胞（DC）蛋白质表达的影响.方法：提取转染仙台病毒载体的树突状细胞和对照细胞的总蛋白，定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分，胶体银染显色，PDQuest进行图像分析后选取差异点，胶内酶解后MALDITOFMS进行肽指纹图谱鉴定.结果：图像分析结果显示，处理组2DE图缺少了40个以上的蛋白点，对其中明显没有表

3、达的5个蛋白点进行了鉴定.结论：仙台病毒载体感染未成熟树突状细胞可引起蛋白表达的减少.　　【关键词】仙台病毒载体；树突状细胞；蛋白质组　　0引言　　随着人类基因组计划的成功实施，各国科学家将生命科学的战略重点转到以阐明人类基因组整体功能为目标的功能基因组学上.蛋白质作为生命活动的“执行者”，自然成为新的研究焦点.以二维电泳（2DE）为核心的蛋白分离技术和以质谱方法为主的蛋白质鉴定技术等技术体系已基本成熟.树突状细胞（DC）是至今发现最强的抗原递呈细胞，在国内外都已将其作为肿瘤疫苗应用于基因治疗.仙台病毒载体是细胞质型RNA载体，

4、对各种动物细胞有较高的感染效率；它本身不进入细胞核内，在细胞质中进行基因表达；在理论上不存在改变细胞核内染色体的危险性，与以往的载体相比具有更高的安全性.我们通过蛋白质组学方法来研究仙台病毒感染树突状细胞后蛋白表达变化，为联合运用树突状细胞和仙台病毒进行基因治疗方案的设计提供了实验依据.　　1材料和方法　　1.1材料C57BL/6小鼠，6~8周龄，雌性，由日本SLC株式公司培育.IPG胶条购于AmershamPharmaciaBiotech(Uppsala,Sega(Madison,ED，BIS购于BIORAD，TFA购于Sig

5、ma，其余试剂采用国产分析纯.　　1.2方法参照文献［1］方法培养C57BL/6小鼠的DC.小鼠骨髓细胞，在含IL425U/mL，GMCSF250U/mL的1640培养基中于37℃的CO2培养箱培养，第4日更换一半培养基，第7日回收细胞.每1×106细胞加100μL1640培养基，感染仙台病毒（感染重数，multiplyofinfection,moi=40），37℃1h，收集细胞.用醋酸镁缓冲液冲洗收集到的细胞数次，参照文献［2］方法提取蛋白，并测定蛋白浓度，样品于-70℃冻存备用.双向电泳参照Amersham公司技术手册，18

6、cmpH3～10胶条，上样体积350μL，上样量100μg，一向等电聚焦设置50V12h；500V1h；1000V1h；4000V1h；6000V1h；8000V10h.胶条分别在含10g/LDTT和40g/LIAA的平衡液（50mmol/LTrisHClpH8.8，6mol/L尿素、300g/L甘油、20g/LSDS）中平衡15min后进行第二向SDSPAGE电泳，300g/L的丙烯酰胺，银染法检测蛋白.重复3次.　　　　染色后的双向电泳凝胶照相后用PDQuest软件（BioRadLaboratories,Hercules,C

7、A）进行图像分析.包括确定蛋白点的分子量、等电点和斑点匹配，切取重复性较好的差异蛋白点，经过脱色、胰酶酶解、浓缩后进行质谱分析.取1μL样品于点样盘，加入等体积基质，室温干燥后用带有PerSeptiveBiosystemMALDITOFVoyagerDERPBiospectrometry工作站（AppliedBiosystems,Framingham,MA）的MALDITOFMS分析.所得肽指纹图谱用Sr（3.0～6.6）×104，pI值主要分布于5.5～9.2间.对其中明显未表达的5个蛋白点作MALDITOFMS分析，得到图2

8、.通过数据库搜索，结合2DE图谱上相应蛋白质的分子量、pI值，确定它们分别为小鼠钙粒蛋白B，磷酸丙糖异构酶，乳酸脱氢酶C链，钙磷脂结合蛋白Ⅰ和白细胞介素11受体β链（表1）.　　表1仙台病毒载体转染未成熟DC后差异蛋白鉴定结果（略）　　乳酸脱氢酶也存在于细胞质基