仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响论文

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1、仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响论文易发平张平波郭风劲马永平宋方洲【关键词】仙台病毒载体；树突状细胞；蛋白质组【Abstract】AIM：Toinvestigatetheproteinchangesinimmaturedendriticcells(DC)infectedinedintheimmatureDCinfectedensionalgelelectrophoresis(2DE)andvisualizedbysilverstaining.Digitalimagesassfingerprinting(PMF)usingMALDITOFMS.RESULTS:Moreth

2、an40proteinspotsdisappearedin2DEofthetreatedgroup.Amongthem5proteinspotsthatic【摘要】目的：研究仙台病毒载体对未成熟树突状细胞（DC）蛋白质表达的影响.方法：提取转染仙台病毒载体的树突状细胞和对照细胞的总蛋白，定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分，胶体银染显色，PDQuest进行图像分析后选取差异点，胶内酶解后MALDITOFMS进行肽指纹图谱鉴定.结果：图像分析结果显示，处理组2DE图缺少了40个以上的蛋白点，对其中明显没有表达的5个蛋白点进行了鉴定.结论：仙台病毒载体感染未成熟树突状细胞可引起蛋白表达的减

3、少.【关键词】仙台病毒载体；树突状细胞；蛋白质组0引言随着人类基因组计划的成功实施，各国科学家将生命科学的战略重点转到以阐明人类基因组整体功能为目标的功能基因组学上.蛋白质作为生命活动的“执行者”.freelershamPharmaciaBiotech(Uppsala,Sega(Madison,ED，BIS购于BIORAD，TFA购于Sigma，其余试剂采用国产分析纯.1.2方法参照文献［1］方法培养C57BL/6小鼠来源的DC.小鼠骨髓细胞，在含IL425U/mL，GMCSF250U/mL的1640培养基中于37℃的CO2培养箱培养，第4日更换一半培养基，第7日回收细胞.每1×1

4、06细胞加100μL1640培养基，感染仙台病毒（感染重数，multiplyofinfection,moi=40），37℃1h，收集细胞.用醋酸镁缓冲液冲洗收集到的细胞数次，参照文献［2］方法提取蛋白，并测定蛋白浓度，样品于-70℃冻存备用.双向电泳参照Amersham公司技术手册，18cmpH3～10胶条，上样体积350μL，上样量100μg，一向等电聚焦设置50V12h；500V1h；1000V1h；4000V1h；6000V1h；8000V10h.胶条分别在含10g/LDTT和40g/LIAA的平衡液（50mmol/LTrisHClpH8.8，6mol/L尿素、300g/L甘

5、油、20g/LSDS）中平衡15min后进行第二向SDSPAGE电泳，300g/L的丙烯酰胺，银染法检测蛋白.重复3次.染色后的双向电泳凝胶照相后用PDQuest软件（BioRadLaboratories,Hercules,CA）进行图像分析.包括确定蛋白点的分子量、等电点和斑点匹配，切取重复性较好的差异蛋白点，经过脱色、胰酶酶解、浓缩后进行质谱分析.取1μL样品于点样盘，加入等体积基质，室温干燥后用带有PerSeptiveBiosystemMALDITOFVoyagerDERPBiospectrometry工作站（AppliedBiosystems,Framingham,MA）的

6、MALDITOFMS分析.所得肽指纹图谱用Sr（3.0～6.6）×104，pI值主要分布于5.5～9.2间.对其中明显未表达的5个蛋白点作MALDITOFMS分析，得到图2.通过数据库搜索，结合2DE图谱上相应蛋白质的分子量、pI值，确定它们分别为小鼠钙粒蛋白B，磷酸丙糖异构酶，乳酸脱氢酶C链，钙磷脂结合蛋白Ⅰ和白细胞介素11受体β链（表1）.图1未成熟DC（A）和仙台病毒载体转染后的DC（B）的双向电泳图（略）3讨论钙粒蛋白B参与翻译后调控，目前有关其功能的研究报道甚少.钙粒蛋白家族与一些肿瘤的发展相关，而且主要存在于胞浆中.磷酸丙糖异构酶存在于细胞质基质中.其功能是在糖酵解代谢

7、途径中催化磷酸二羟丙酮与3磷酸甘油醛之间的相互转化，并在光合作用、糖异生等代谢途径中也催化同一反应.已有大量的原细菌、真细菌和真核生物TIM的研究报导.表1仙台病毒载体转染未成熟DC后差异蛋白鉴定结果（略）乳酸脱氢酶也存在于细胞质基质中.其功能是在乳酸发酵过程中使丙酮酸还原成乳酸.钙磷脂结合蛋白Ⅰ是钙磷脂结合蛋白超家族中的成员,作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶的底物,通过阻断mRNA的合成而抑制磷脂酶A2的表达.具有多种生物学功能，并在多种肿瘤发生早期出现表达水平的改变