htert基因启动子调控腺病毒介导canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究

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1、郑州大学博士学位论文hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究姓名：朱宝菊申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：乔玉环20090501郑州大学2009年博士论文hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究博士研究生朱宝菊导师乔玉环郑州大学基础医学院郑州450052摘要目前无论治疗与否，晚期卵巢癌患者的预后都不佳。在美国，每年大约有26600例卵巢癌新患者

2、，而每年直接死于卵巢癌的患者约14500例。据统计，全世界卵巢癌总发病人数大约每年19．1万，而由于卵巢癌疾病的隐匿性，仅仅只有23％的卵巢癌患者能在病变早期被诊断出来。晚期卵巢癌患者虽然接受了综合治疗，但是从确诊之同起，5年存活率不超过30％，所以卵巢癌又通常被称为无声杀手(silentkiller)。因此临床上迫切需要特异有效的治疗方法，以期改善晚期卵巢癌患者的预后。研究认为，血管形成(Angiogenesis)在肿瘤的生长和转移过程中起着关键的作用。如果没有肿瘤的血管系统发生，实体肿瘤超过几个毫米将不能生长。此外，血管

3、形成的越密集，肿瘤生长的速度就越快，转移的可能性就越大。在血管生成过程中，IV型胶原(TypeIVcollagen)扮演重要角色。Ⅳ型胶原是构成血管基底膜的主要成分之一，能促进细胞的黏附、迁徙、分化、生长。研究认为，Ⅳ型胶原是一个可以调节肿瘤血管形成的潜在治疗靶点。人血管能抑素Canstatin，是继endostatin之后新发现的一个内源性血管生成抑制因子(endogenousinhibitorofangiogenesis)，来源于血管基底膜IV型胶原Q2链C末端球形非胶原区(noncollagenousdomainofc

4、ollagentypeⅣct2．chains，non—collagenousl，NCl)。NCl区参与Ct链的组装，对Ⅳ型胶原三聚体的形成起关键作用，影响着血管基底膜的形成，而血管基底膜对于新血管形成是非常重要的。关于canstatin基因的研究已阐明，canstatin能抑制血管内皮细胞的生长郑州大学2009年博士论文hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究和迁移，诱导肿瘤细胞凋亡，通过抑制肿瘤血管形成而有效抑制肿瘤移植瘤的生长。有关研究表明，肿瘤移植瘤内系统注射canstatin

5、基因重组子能有效的抑制体内异体胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌移植瘤的生长。然而，Canstatin基因对人卵巢上皮性癌是否有效，国内外尚未见报道。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达，而在正常体细胞中则一般为阴性。研究认为，人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)基因的活性在肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要作用，并且在癌症的基因治疗中已经成为一个新的治疗靶点。有大量的证据表明hTERT基因核心启动子作为启动子可以调控治疗多种实体肿瘤，包括结

6、肠癌、肺癌、肝癌及前列腺癌、卵巢癌等。研究表明hTERT启动子调控的腺病毒复制主要集中在肿瘤细胞内，而对端粒酶阴性的正常细胞不起作用。为了探讨canstatin基因对人卵巢上皮性癌移植瘤的疗效，并使canstatin基因治疗具有靶向性，该课题构建hTERT基因核心启动子调控的Canstatin基凶重组腺病毒(Adxsi．GFP．hTER-T-Canstatin，AdhTERT-Can)，体外通过Lipofectamin介导转染卵巢上皮性癌H08910PM细胞株，研究其对卵巢癌细胞生长的影响，同时建立裸鼠移植瘤动物模型，研究重

7、组腺病毒AdhTEl弭Call对卵巢上皮性癌移植瘤的抑制作用，以期为卵巢癌canstatin基因靶向治疗提供理论依据。本实验分为以下两部分：第一部分人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子canstatin基因重组腺病毒载体的构建方法+1．从卵巢浆液性囊腺癌组织中提取总RNA和基因组DNA，采用RT-PCR方法扩增canstatin基因片段，PCR方法扩增hTERT基因片段。2．XhoI酶切Canstatin和hTERT扩增片段，使其形成粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下，与pMDl8T载体进行连接，将canstatin基

8、因片段和hTERT基因片段同时克隆入pMDl8T载体中，获得pMDl8T-hTERT-Canstatin载体，转化感受态大肠杆菌DH5a，抗生素筛选，摇菌，提取，酶切、电泳鉴定及测序，将核苷酸序列与基因库进行比较。n郑州大学2009年博士论文hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstat