eb病毒相关胃癌及鼻咽癌组织病毒主要潜伏期基因启动子甲基化状态分析论文

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1、EB病毒相关胃癌及鼻咽癌组织病毒主要潜伏期基因启动子甲基化状态分析论文张霞刘霞荆永正邢晓明王云罗兵【摘要】目的研究分析青岛地区EB病毒(EBV)相关胃癌及鼻咽癌组织中EBV主要潜伏期编码基因启动子甲基化状态。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)及亚硫酸氢盐基因组测序法(BGS)，分析32例EBV相关胃癌及20例EBV阳性鼻咽癌标本中编码EBV核抗原EBNAs基因的启动子Cp、P1和LMP2A编码基因启动子的甲基化状态。结果EBV相关胃癌及鼻咽癌肿瘤标本中EBV编码基因启动子的甲基化状态与肿瘤细胞的潜伏感

2、染类型一致：Cp和P1和LMP2A编码基因启动子甲基化状态有所不同，两者在EBV相关胃癌组织甲基化程度明显高于其在EBV阳性的鼻咽癌(χ2=19.15、11.01，P0.01)。结论甲基化是调控EBV主要潜伏期基因启动子活动的重要机制之一。【关键词】疱疹病毒4型,人;胃肿瘤;鼻咽肿瘤;DNA甲基化;启动区(遗传学)ABSTRACTObjectiveTostudyandanalyzethemethylationstatusofmajorEpsteinBarrvirus(EBV)latencypromote

3、rsinEBVassociatedgastriccarcinoma(EBVaGC)andnasopharyngealcarcinoma(NPC)inQingdaoarea.MethodsMethylationstatusofspecificCpGsitesofCp,P1promoter(LMP1p)andLMP2Apromoter(LMP2Ap)aticallydetectedin32EBVaGCsand20NPCsbybisulfitegenomicsequencing(BGS)andmethylat

4、ionspecificPCR(MSP).ResultsThemethylationstatusofthesepromotersinEBVaGCethylated,ethylated;ThemethylationstatusofLMP1pandLMP2ApinEBVaGCNPC:themethylationratesofLMP1pandLMp2ApinEBVaGCethylationstatusoftheEBVmajorlatencypromotersisoneofimportantmechanismsi

5、nregulatingtheactivitiesofthesepromoters.KEYI1640营养液，于37℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养。1.2肿瘤标本新鲜胃癌组织和石蜡包埋鼻咽癌组织取自青岛大学医学院附属医院﹑蓬莱市人民医院和烟台毓璜顶医院。采用原位杂交检测石蜡组织切片中EBV编码的小分子非多聚腺苷酸EBER1的转录4，筛选出32例EBV阳性胃癌和20例EBV阳性鼻咽癌标本。1.3DNA提取采用酚氯仿异戊醇抽提法常规提取新鲜胃癌组织DNA，采用QIAampDNAFFPE试剂盒提取石

6、蜡包埋鼻咽癌组织DNA，具体操作步骤按试剂盒(QIAamptissuekit,Qiagen,Hilden,Germany)说明进行。1.4DNA处理取30μL上述提取的组织DNA(2～5μg)，加33μL新鲜配制3mol/L的NaOH溶液混匀变性，置37℃水浴15min;将新鲜配制的亚硫酸盐溶液(2.4mol/L亚硫酸钠，pH5.0～5.2;0.5mmol/L氢醌与3mol/LNaOH的混合液)333μL加入变性DNA中进行修饰，55℃避光孵育4h。修饰后的DNA脱盐纯化处理按照DNA纯化试剂盒(Qiag

7、en,Hilden,Germany)说明操作步骤进行;脱盐纯化的DNA溶于50μLTE缓冲液中，室温下静置5min。再加入3mol/L的NaOH5.56μL，37℃水浴15min，使其脱磺化基团。将纯化后DNA溶解于100μLTE缓冲液中，-20℃保存备用5。1.5甲基化特异性PCR(MSP)以亚硫酸氢盐修饰的组织DNA作为模板进行MSP，甲基化特异性引物、未甲基化特异性引物以及MSP产物大小见表1，其中P1和LMP2A启动子特异性引物采用MethPrimer软件进行在线设计。PCR反应体积为25μL，包

8、括DNA模板2μL，1.25U热启动酶TaKaRa，1.5mmol/LMgCl2，0.2nmol/LdNTP和0.6mmol/L引物。反应条件：95℃预变性5～10min;然后95℃变性30s，最适温度退火30s，72℃延伸1min，共38个循环;最后72℃延伸10min。扩增产物置20g/L的琼脂糖凝胶上电泳，紫外线凝胶成像系统记录分析结果。EBV阳性Akata、Raji和B958细胞系DNA作阳性对照，EBV阴性Ramo