eb病毒相关胃癌及鼻咽癌组织病毒主要潜伏期基因启动子甲基化状态分析

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1、EB病毒相关胃癌及鼻咽癌组织病毒主要潜伏期基因启动子甲基化状态分析：张霞刘霞荆永正邢晓明王云罗兵【摘要】目的研究分析青岛地区EB病毒(EBV)相关胃癌及鼻咽癌组织中EBV主要潜伏期编码基因启动子甲基化状态。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)及亚硫酸氢盐基因组测序法(BGS)，分析32例EBV相关胃癌及20例EBV阳性鼻咽癌标本中编码EBV核抗原EBNAs基因的启动子Cp、P1和LMP2A编码基因启动子的甲基化状态。结果EBV相关胃癌及鼻咽癌肿瘤标本中EBV编码基因启动子的甲基化状态与肿瘤细胞的潜伏感染类型一致

2、：Cp和P1和LMP2A编码基因启动子甲基化状态有所不同，两者在EBV相关胃癌组织甲基化程度明显高于其在EBV阳性的鼻咽癌(χ2=19.15、11.01，P<0.01)。结论甲基化是调控EBV主要潜伏期基因启动子活动的重要机制之一。【关键词】疱疹病毒4型,人;胃肿瘤;鼻咽肿瘤;DNA甲基化;启动区(遗传学)[ABSTRACT]ObjectiveTostudyandanalyzethemethylationstatusofmajorEpsteinBarrvirus(EBV)latencypromotersi

3、nEBVassociatedgastriccarcinoma(EBVaGC)andnasopharyngealcarcinoma(NPC)inQingdaoarea.MethodsMethylationstatusofspecificCpGsitesofCp,P1promoter(LMP1p)andLMP2Apromoter(LMP2Ap)aticallydetectedin32EBVaGCsand20NPCsbybisulfitegenomicsequencing(BGS)andmethylationspe

4、cificPCR(MSP).ResultsThemethylationstatusofthesepromotersinEBVaGCethylated,ethylated;ThemethylationstatusofLMP1pandLMP2ApinEBVaGCNPC:themethylationratesofLMP1pandLMp2ApinEBVaGCethylationstatusoftheEBVmajorlatencypromotersisoneofimportantmechanismsinregulating

5、theactivitiesofthesepromoters.　　[KEYP)1、2A和2B，EBV编码的小RNA(EBER)1和2以及BARF0的转录产物。根据EBV潜伏期基因表达形式不同分为潜伏Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3种潜伏类型。EBV相关胃癌和BURKITT淋巴瘤组织均可以检测到潜伏期基因EBNA1、EBERs、LMP2A、BARF0的转录表达，为潜伏Ⅰ型。除了上述基因以外，在鼻咽癌组织、HODGKIN病中还可检测到LMP1的表达者为Ⅱ型潜伏。体外EBV永生化的B淋巴母细胞系(LCL)可检测到包括6种EBNAs和3

6、种LMPs等在内的大部分EBV潜伏期基因的表达，称为Ⅲ型潜伏。研究表明，EBV相关胃癌及鼻咽癌组织中病毒基因表现为限制性表达，推测EBV可能通过表观遗传机制调控病毒基因启动子，尤其是通过其甲基化状态来调控病毒基因的表达[3]。研究显示，EBV编码基因启动子序列中CpG位点甲基化可抑制相应基因的表达，但这些研究主要集中在淋巴细胞的EBV阳性肿瘤和细胞系。本实验选择上皮的EBV相关胃癌和EBV阳性鼻咽癌作为研究对象，检测其EBV主要潜伏期基因启动子甲基化状态，为深入探讨EBV相关肿瘤的发生机制及防治提供实验基础。　　

7、1材料和方法　　1.1细胞系　　EBV阳性Akata、Raji和B958细胞系由日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠，分别为潜伏Ⅰ型、潜伏Ⅲ型Burkitt淋巴瘤细胞系，EBV永生化的潜伏Ⅲ型LCL细胞系用作该实验的对照细胞。上述细胞用含有体积分数0.10的胎牛血清、105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640营养液，于37℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养。　　1.2肿瘤标本　　新鲜胃癌组织和石蜡包埋鼻咽癌组织取自青岛大学医学院附属医院﹑蓬莱市人民医院和烟台毓璜顶医院。采用原位

8、杂交检测石蜡组织切片中EBV编码的小分子非多聚腺苷酸EBER1的转录[4]，筛选出32例EBV阳性胃癌和20例EBV阳性鼻咽癌标本。　　1.3DNA提取　　采用酚氯仿异戊醇抽提法常规提取新鲜胃癌组织DNA，采用QIAampDNAFFPE试剂盒提取石蜡包埋鼻咽癌组织DNA，具体操作步骤按试剂盒(QIAamptissuekit,Qiagen,Hilden,Germany)