成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察论文

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1、成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察论文张卫泽，陈跃武，哈小琴，陈永清，秦勉，马凌，郭建巍，洪志斌【关键词】成人脂肪【Abstract】AIM:Toexplorethemethodsofisolatingandculturingmesenchymalstemcellsfromadultadiposetissue（ADMSCs）andinducingthemtodifferentiateintocardiomyocytesinvitro,soastoestablishaneyoc

2、ardialregeneration.METHODS:MSCsadultadiposetissue.5azacytidine(5aza)inducedthosecellstodifferentiateintocardiomyocytes.ThentheimmunocytochemicalmethodandtheRTPCRmethodyocytesafter14,21,28dofadditionalculturerespectively.RESULTS:ThemorphologyofMSCsinduc

3、edfor14dyocytesunderaphasecontrastmicroscope.CardiactroponinI,desminandcardiacβmyosinheavychaingenemunocytochemistryandRTPCR.CONCLUSION:Adultadiposetissuecontainsplentyofmesenchymalstemcellsyocytesby5azainvitro.ADMSCsmightbeaneyocardialregeneration.【Ke

4、yesenchymalstemcell；adiposetissue；celldifferentiation；cardiomyocytes【摘要】目的：探索成人脂肪组织来源的间充质干细胞（ADMSCs）体外分离、培养方法.freelin）表达阳性，RTPCR检测心肌β肌球蛋白重链（CardiacβMHC）基因表达阳性.结论：成人脂肪组织存在丰富的间充质干细胞且易于分离扩增，体外5aza诱导可使其向心肌细胞分化，可做为心肌再生医学的理想种子细胞.【关键词】间充质干细胞；脂肪组织；细胞分化；心肌细胞0引言

5、近年有关干细胞移植技术的研究进展对临床治疗心肌终末期疾病带来了前所未有的希望.国外已有动物实验及小规模临床试验显示自体骨髓间充质干细胞（bonemarroesenchymalstemcells，BMMSCs）移植入坏死心肌后可改善心功能［1-2］.但由于BMMSCs来源有限，其广泛临床应用受到限制.新近研究发现，同样来源于中胚层的脂肪组织中亦含有一种多向分化潜能干细胞，这种细胞群更易分离，细胞数量多，可以发挥替代BMMSCs的作用［3-6］.本实验我们通过体外分离脂肪组织源性间充质干细胞(adipo

6、sederivedmesenchymalstemcells，ADMSCs)并传代扩增，在体外特定条件下定向诱导，探讨其向心肌细胞分化的潜能.1材料和方法1．1材料新鲜脂肪组织（取自兰州军区总医院微创外科中心单纯性阑尾炎患者大网膜，男性，18岁），高糖DMEM培养基（Sigma），胰蛋白酶（Ameresco），Ⅰ型胶原酶（Sigma），优质胎牛血清（Gibco），5氮胞苷（5azacytidine，5aza，Sigma生物），鼠抗人心肌特异性肌钙蛋白I（CardiacTroponinI，cTNI，美国

7、QED生物）及DesminmAb（Sigma），FITC标记羊抗鼠二抗（博士德），总RNA抽提试剂盒（上海生工），RTPCR试剂盒（Fermentars）.1．2方法1.2.1原代细胞分离培养外科手术室无菌条件下取大网膜脂肪组织约100mg，去除包膜及血管组织，PBS(含2×105U/L青霉素和200mg/L链霉素)冲洗3次以洗去红细胞的污染，眼科剪剪碎至1mm×1mm×1mm大小，加2.5g/L胰蛋白酶5mL,0.75g/LⅠ型胶原酶5mL，37℃恒温水浴箱振荡消化60min，弃上层脂肪及上清，加

8、含150mL/LFBS的DMEM培养基10mL吹打成混悬液终止消化，3000r/min离心10min，弃上清，最底层细胞层用双抗PBS洗3遍，DMEM培养基吹打混悬，400目细胞筛过滤收集细胞并移至25cm×25cm塑料培养瓶中，加完全培养液（150mL/LFBS,100×双抗的LGDMEM培养基）37℃,50mL/LCO2培养箱饱和湿度培养.24h后首次换液，去除悬浮细胞.此后每3日换液1次，12浓度的单细胞悬液，重新接种于培养瓶中培养.24h后换液去除未贴壁细胞，