体外诱导胰岛HO1适度表达保护异种胰岛移植物

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-------上海交通大学医学院硕士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行分析工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的分析做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日2---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日3---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文体外诱导胰岛HO-1适度表达保护异种胰岛移植物摘要当前胰岛移植已成为Ⅰ型糖尿病的有效治疗手段，但这一疗法也面临着供体短缺的问题，若单纯从胎胰或尸胰获得胰岛远不能满足患者的需要，故近年来更多学者将目光关注于解决胰岛移植的供体来源问题，其中异种胰岛移植一直是国内外学者孜孜以求的目标。然而，进行异种移植面临的问题较同种移植更大，例如移植部位更强烈的炎症反应及异种免疫排斥反应等均可使异种胰岛功能受损甚至导致其死亡，从而减弱移植效果。其中强烈的炎症反应不但削弱胰岛功能，且可导致特异性免疫应答，形成恶性循环。故如何使异种胰岛产生自我保护功能对于异种胰岛移植来说至关重要。血红素氧化酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）是一种可诱导的细胞保护性物质。本分析旨在探讨HO-1对异种胰岛移植物的保护作用及其机制。现通过以下4个部分加以阐述。第1部分大鼠胰岛分离、纯化技术的改良本部分旨在探讨一种SD大鼠胰岛分离、纯化的改良方案，并评价依该法分离所得胰岛的生物学特性。我们以浓度为0.75mg/ml的Ⅺ型胶原酶经胆管充分灌注SD大鼠胰腺，完整分离后37℃水浴振荡消化17min，4---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文Dextron70梯度液不连续密度梯度（密度分别为1.091、1.081及1.037）离心法分离、纯化胰岛，DTZ染色鉴定胰岛并计算得率，AO/PI染色检测胰岛活性，糖刺激试验判定胰岛功能，光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果显示纯化后每只大鼠胰岛收获量为（743.60±43.07）个，胰岛纯度>90％，胰岛活性>90％。胰岛在低糖和高糖刺激下分泌的胰岛素浓度分别为（25.35±7.00）µIU/ml和（86.48±12.75）µIU/mL。高糖刺激时胰岛素分泌量为低糖时的3.4（刺激指数）倍。依改良后的分离纯化方案分离大鼠胰岛可获得高纯度高活性的胰岛，且细胞形态正常、功能良好。第2部分CoPP诱导大鼠胰岛HO-1适度表达的分析本部分旨在分析钴原卟啉（cobaltprotoporphyrin,CoPP）体外诱导大鼠胰岛血红素氧化酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）适度表达的剂量－效应及诱导时间－效应关系并观察该效应对胰岛功能的影响。首先我们将分离纯化的大鼠胰岛随机均分为5组，与不同剂量的CoPP共培养24h。A组：对照组；B组：CoPP剂量为5mmol/l；C组：CoPP剂量为25mmol/l；D组：CoPP剂量50mmol/l；E组：CoPP剂量为75mmol/l。分别以RT-PCR及Western-Blot检测HO-1mRNA和蛋白表达，根据结果选择最适CoPP诱导剂量。随后将分离纯化的胰岛再次随机均分为5组，以最适CoPP诱导剂量诱导不同时间。组1：诱导6h；组2：诱导12h；组3：诱导24h；组4：诱导36h；组5：诱导48h。RT-PCR及Western-Blot检测5---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文HO-1mRNA和蛋白表达，根据结果选择最佳CoPP诱导时间。选取新鲜分离的胰岛（对照组）、经最适诱导剂量及最佳诱导时间诱导的胰岛（实验组）及高剂量诱导的胰岛（高剂量组）行糖刺激试验，以明确胰岛功能的变化。结果显示D组及组4HO-1mRNA上调最强且该两组蛋白条带最深。实验组在低糖及高糖刺激下胰岛素分泌量为（30.52±2.04）µIU/ml及（104.60±5.10）µIU/ml均显著高于对照组的（20.35±1.79）µIU/ml及（62.39±2.50）µIU/ml，且两组刺激指数分别为（3.47±0.06）及（3.10±0.08），有显著差异（P<0.05）。胰岛在CoPP剂量为75mmol/l，诱导时间为36h时（高剂量组）胰岛素分泌量为（14.57±2.41）µIU/ml及（43.67±7.40）µIU/ml，显著低于对照组（P<0.05），说明胰岛功能已受损。结论：CoPP体外诱导大鼠胰岛HO-1适度表达的最适剂量为50mmol/l，最佳诱导时间为36h。CoPP诱导HO-1适度表达能改善胰岛功能。第3部分HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护作用本部分旨在分析CoPP诱导HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护作用。我们采用大鼠对小鼠的异种胰岛移植模型。按术前不同处理方式将分离纯化的胰岛随机分为3组：A组胰岛体外培养36h；B组胰岛与50mmol/lCoPP共培养36h；C组胰岛与50mmol/lCoPP及50mmol/lHO-1诱导阻断剂锌原卟啉（zincprotoporphyrin,ZnPP）共培养36h。RT-PCR及Western-Blot检测各组胰岛HO-1mRNA及蛋白表达。受体鼠6---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文也随机分为3组，每组11只，分别接受上述3组胰岛。比较各组中8只受体鼠血糖维持正常之时间，其余3只用于第四部分实验。结果显示A组胰岛HO-1mRNA相对表达量为（1），B组为（3.326±0.251），C组为（0.724±0.139）。A、B两组比较差异有统计学意义（P=0.02），B、C两组差异有统计学意义（P=0.005），A、C两组差异无统计学意义（P=0.08）。B组受体鼠血糖维持正常时间为（14.63±1.19）d，与A组的（9.88±2.17）d及C组的（9.38±1.60）d相比有显著差异（P<0.01），而A、C两组无显著差异（P>0.05）。我们认为CoPP体外诱导HO-1适度表达对异种胰岛移植物具保护作用。第4部分HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护机制本部分旨在分析HO-1适度表达对异种胰岛移植物可能的保护机制。在进行第三部分实验时，移植后3天A、B、C组各取3只受体鼠，经球后静脉采血分离血清并取胰岛移植物。ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β的量，同时RT-PCR检测移植物组织中IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1βmRNA的表达情况，HE染色观察各组移植物中淋巴细胞浸润情况。结果B组受体鼠血清IL-10含量为（72.97±9.74）pg/ml，与A组的（30.57±3.94）pg/ml及C组的（45.55±8.26）pg/ml比较差异有统计学意义，P值分别为0.005及0.02，而A、C两组比较差异无统计学意义（P=0.06）。各组血清中IFN-γ、TNF-α及IL-1β的量无显著差异（P7---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文>0.05）。B组受体鼠胰岛移植物中IL-10mRNA的相对表达量为（5.71±1.02）与A、C组的（1）及（1.61±0.77）比较差异有统计学意义（P值分别为0.007及0.03），而A、C两组比较差异无统计学意义（P=0.15）。各组胰岛移植物中IFN-γ、TNF-α及IL-1βmRNA的相对表达量无显著差异（P>0.05）。B组移植物中淋巴细胞浸润明显轻于A、C两组。我们认为HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护机制可能与IL-10有关。关键词：异种移植，胰岛，血红素氧化酶-1，钴原卟啉，锌原卟啉8---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文HEMEOXYGENASE-1INDUCTIONINISLETSINVITRORESULTSINPROTECTIONINVIVOAFTERXENO-TRANSPLANTATIONABSTRACTTransplantationofisletsofLangerhansrepresentsaviabletherapeuticapproachforthetreatmentoftype1diabetes.Unfortunately,theshortageofdonormakesitadilemmaforislettransplantation.However,theproblemcanberesolvedbyxeno-transplantation,whichismerelyunknowntous.Xeno-isletsaremoresusceptibletoallogeneicrecognitionandrejection,recurrenceofautoimmunity,anddestructionbylocalinflammationatthesiteofimplantation.Thelastofthesephenomenamightnotonlyresultinfunctionalimpairmentanddeathofisletcellsbutcouldalsocontributetoamplifyingthesubsequentspecificimmuneresponse.Inductionofisletcellprotectioninxeno-transplantationcouldthereforebepostulatedtobeapowerfulmeantoimproveoverallgraftfate.Hemeoxygenase-1(HO-1)has---- -------beendescribedasaninducibleproteincapableofcytoprotection.ThisresearchwastodiscovertheprotectiveeffectofHO-1forxeno-isletgraftandwasdividedinto4parts.PartITechnicalAlternativeforIsolationandPurificationofRat9---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文IsletsWeestablishedanalternativeforisolationandpurificationofSDratisletsinthispart.IsletswereisolatedbymeansofⅪcollagenase(Concentration0.75mg/ml)digestionanddiscontinuousdensitygradientcentrifugationusingDextron70（Density1.091、1.081and1.037）.Isletpuritywasaccessedbydithizone（DTZ）stainingandviabilitybyacridineorange(AO)andpropidiumiodide(PI)fluorescencestaining.Isletfunctionwasdeterminedbyglucosestimulatedtest.Themorphologyofisletswasobservedundermicroscope.Thetotalnumberofisletsfromonedonorwas(743.60±43.07)(purity>90%,viability>90%).Thesecretionamountofinsulinwas(25.35±7.00)µIU/mland(86.48±12.75)µIU/mlat3.3mmol/land16.7mmol/lconcentrationofglucoserespectively.WefoundthatpreciseoptimizationofisletisolationprocedureledtohighyieldandpurityofSDratisletsandensuretheisletfunctionatthesametime.---- -------PartIIOptimalExpressionofHemeOxygenase-1InducedbyCobaltProtoporphyrininRatIsletsWeaimedtoanalyzethedose-effectandtime-effectbetweencobaltprotoporphyrin(CoPP)andhemeoxygenase-1(HO-1)expressioninratisletsandtoevaluatethefunctionofisletsafterCoPPinductioninthispart.IsletsisolatedandpurifiedfromSDratswerefirstrandomlydividedinto5groups10---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文andincubatedwithdifferentdosesofCoPPfor24h.GroupA:controlgroup,GroupB:5mmol/lCoPP,GroupC:25mmol/lCoPP,GroupD:50mmol/lCoPP,GroupE:75mmol/lCoPP.TheexpressionofHO-1mRNAandproteininisletsweredetectedbyRT-PCRandWestern-Blotrespectively.TheoptimaldoseofCoPPwaschosenaccordingtotheresults.Thenanother5groupsofisletswereincubatedwiththeoptimaldoseofCoPPfordifferenttime,Group1:6h;Group2:12h;Group3:24h;Group4:36h;Group5:48h.RT-PCRandWestern-BlotwereusedtotesttheexpressionofHO-1mRNAandprotein.Glucoseoflowandhighconcentrationswasaddedtoisletstoevaluatetheinsulin-releasingfunction.WefoundthattheexpressionofHO-1mRNAandthatofHO-1proteininisletsofGroupDandGroup4werehigherthanthoseofothergroups.Afterstimulationofglucose,theinsulinconcentrationofinducedislets(CoPPdose:50mmol/l,inducingtime:36h)wassignificantlyhigherthanthatoffreshlyisolatedislets(P<0.05).Thefunctionofisletswasimpairedwhentheinsulinconcentrationof---- -------inducedislets(CoPPdose:75mmol/l,inducingtime:36h)wassignificantlylowerthanthatoffreshlyisolatedislets(P<0.05).TheoptimaldoseandtimeforHO-1inductioninratisletsis50mmol/land36h.TheoptimalinductionofHO-1byCoPPpromotestheglucose-stimulatedinsulinsecretionofislets.11---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文PartⅢHemeOxygenase-1OptimalInductioninIsletsResultsinProtectionInVivoAfterXeno-TransplantationWeaimedtoinvestigatetheprotectiveeffectofHO-1inisletxeno-transplantationinthispart.MaleSDratswereusedasdonorsandmaleC57BL/6mouseasrecipients.33recipientswererandomlydividedinto3groupsaccordingtodifferentpretreatmentfordonorislets:GroupA:isletswereculturedfor36h.GroupB:isletswereco-culturedwith50mmol/lofcobalt-protoporphyrin(CoPP),hemeoxygenase-1inducer,for36h.GroupC:isletswereco-culturedwith50mmol/lofCoPPand50mmol/lofzincprotoporphyrin(ZnPP),HO-1inhibitor,for36h.TheexpressionofHO-1mRNAandproteinweredetectedbyRT-PCRandWestern-Blotrespectively.Timeofnormoglycemiawasobservedaftertransplantation.WefoundthattheexpressionofHO-1mRNAandproteinofGroupBweresignificantlyhigherthanthoseofothergroups(P<0.01).ThetimefornormoglycemiaofGroupBwas(14.63±1.19)d，significantly---- -------longerthanthatofGroupA（9.88±2.17）dandgroupC(9.38±1.60)d(bothP<0.01).However,itwasofnosignificancebetweengroupAandC（P>0.05）.WeconcludethattheoptimalinductionofHO-1byCoPPinvitroprotectsxeno-isletgraft.12---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文PartⅣTheProbableMechanismofHemeOxygenase-1InProtectingXeno-isletGraftWeaimedtoinvestigatetheprobablemechanismofhemeoxygenase-1inprotectingxeno-isletgraft.InpartⅢ,wecollectedthebloodandtissueofisletgraft3daysaftertransplantationineachgroup.ThebloodconcentrationofIFN-γ,TNF-α,IL-10andIL-1βweredetectedbyELISA.TheexpressionsofIFN-γ,TNF-α,IL-10andIL-1βmRNAweredetectedbyRT-PCR.TheinfiltrationoflymphocyteswasobservedbyH.E.stainingpathologically.TheresultsshowedthatthebloodconcentrationofIL-10ingroupBwas(72.97±9.74)pg/ml,significantlyhigherthanthoseofgroupA(30.57±3.94)pg/mlandC(45.55±8.26)pg/m（lbothP<0.05）,howevergroupAandCwerethesame（P>0.05）.Therewerenosignificantdifferencesamongthe3groupsforIFN-γ,TNF-αandIL-1β（P>0.05）.TheexpressioningrafttissueofIL-10mRNAingroupBwas（5.71±1.02）,significantlyhigherthanthoseofgroupA(1)andC(1.61±0.77)（bothP<0.05）,howevergroupAandCwerethe---- -------same（P>0.05）.Therewerenosignificantdifferencesamongthe3groupsforIFN-γ,TNF-αandIL-1β（P>0.05）.TheinfiltrationoflymphocytesingroupBwaslighterthangroupAandC.WeconcludethatIL-10mayplayasignificantroleinprotectionofHO-1forxeno-isletgraft.13---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文KEYWORDS:xeno-transplantation,islet,heme-oxygenase-1,cobalt-proto-porphyrin,zinc-protoporphyrin14---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文前言近十年来，糖尿病患病率在世界各国急剧上升，已成为全球性卫生保健问题。为了糖尿病病人长期健康，通过移植的胰岛替代胰腺分泌功能，增加病人胰岛素分泌，可有效控制血糖，减少和改善糖尿病并发症。近年来胰岛移植在技术上取得了令人鼓舞的成绩：①胰腺切取时向腹主动脉灌注UW液后再用冰盐水浸没网膜囊及整个胰腺，迅速分离胰腺体尾部，提高了胰岛产量、活性及功能；②胰岛分离、纯化方面，采用Ficoll或Dextran密度梯度离心将胰岛从消化了的胰腺组织中分离，可获取75％～95％纯度的胰岛；通过静脉导管向门静脉注入胰岛不但操作简单、安全而且能使胰岛更好地发挥功能。2006年Shapiro等报道北美6个中心和欧洲3个中心采用Edmonton方案共为36例Ⅰ型糖尿病人实施成人胰岛移植,1年随访结果显示:不依赖胰岛素(完全撤除胰岛素)者占44％(16/36)、胰岛部分发挥功能(胰岛素减量)者占28％(10/36)、1年后移植物完全丧失功能者为28％(10/36)。Truong等报道截至2005年12月,Edmonton单中心最大一组ITA治疗T1DM，共实施成人胰岛移植168次,87例病人的临床资料显示:接受2次胰岛移植，1年胰岛素不依赖70％～80％；单次胰岛移植,胰岛素不依赖仅为10％。因此,80％的病人行二次移植、17％病人行3次移植。平均胰岛移植量为11910IEQ/kg体重，但有3例移植胰岛量达16000IEQ/kg体重，仍未撤除胰岛素。总结文献资料，造成如此低的成功率主要与炎症反应、胰岛凋亡和免疫排斥反应有关。此外，当前供胰短缺严重影响了胰岛移植的发展，异种胰岛移植可提供无限的供胰，有望成为胰岛移植的发展趋势。对异种移植，先要解决的“瓶颈”问题－异种免疫排斥反应。是否存在一种物质可保护异种胰岛移植物呢？随着在肝、肾等传统移植领域中分析的不断深入，血红素氧和酶-1(hemeoxygenase1,HO-1)被证实与器官移植中细胞保护作用有关。HO-1是体内的一种抗氧化酶，主要分布于肝脏和脾脏，为血红素分解代谢限速酶，催化血红素降解为胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁，另称热休克蛋白32(heatshockprotein32,HSP-32)。HO-1在多数组织内低水平表达，可被多种损伤性刺激包括高血红素、高氧、缺氧、热休克、内毒素、过氧化氢、细胞因子、紫外线、17---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文重金属和NO等诱导产生高水平表达。HO-1具抗细胞氧化、抗炎和抗细胞凋亡作用，并在器官移植冷保存损伤[1]和急、慢性排斥反应中起细胞保护作用[2]。Nath等[3]应用HO-1基因敲除肾损伤动物模型证实HO-1的表达是阻止肾小管间质炎症反应及炎症因子基因表达所必需的物质。Tullius等[4]在大鼠同种异体肾移植缺血再灌注损伤模型中证实急性排异反应可诱导HO-1表达，再灌注前应用钴原卟啉(CoPP)诱导HO-1过表达可减轻移植肾的损伤，延长移植肾存活时间。我们设想通过借鉴HO-1在肝、肾等器官移植中的细胞保护作用、HO-1生物学功能及其发挥功能的具体机制，大胆将其运用于异种胰岛移植领域以提高异种胰岛移植的成功率是有科学依据的。本实验将通过4部分对以上问题进行阐述。第1部分：大鼠胰岛分离、纯化技术的改良；第2部分：CoPP诱导胰岛HO-1适度表达的分析；第3部分：HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护作用；第4部分：HO-1适度表达对异种胰岛移植物保护机制的初步探索。18---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文第1部分大鼠胰岛分离、纯化技术的改良胰岛移植是当前内分泌学界及移植学界的分析热点，然而分析胰岛移植就必须有高得率、高活力和高纯度的胰岛获得手段作前提。早在1985年Gotoh等就创立了经胆总管注酶扩张、消化胰腺，密度梯度离心分离纯化胰岛的经典方法，但该方法影响因素较多，操作较复杂，致分离结果相对不稳定[5]，各家依该法分离大鼠胰岛所得结果相差亦甚远，胰岛得率在400～650个不等，纯度于80％～90％之间。本分析在Gotoh法的基础上进行了改良。材料与方法16.7材料1.1.实验动物SPF级雄性SD大鼠10只，体重240～260g，由中国科学院上海实验动物中心提供。饲养标准遵照卫生部颁发的“医学实验动物全价营养饲料标准”。实验前禁食24小时，自由饮水。1.2.主要试剂胶原酶：CollagenaseXI：美国Sigma公司Dextran70：美国Amersham公司双硫腙（DTZ）：中国药材进出口公司吖啶橙(AO)：美国sigma公司碘化丙锭（PI）：中国药材进出口公司胰岛素放射免疫试剂盒（Rat）：美国Linco公司（测定值批内变异<4.6％,批间变异<9.4％）DMEM细胞培养液：Invitrogen-Gibco公司D-葡萄糖（D-Glucose）：美国Sigma公司胎牛血清（BSA）：美国Gibco公司，Gold级血清19---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文青、链霉素：美国Gibco公司16.7试剂配制：①Hanks平衡盐溶液（HBSS）成分：1.1.mmol/lKCl；0.3mmol/lNa2HPO4；0.4mmol/lKH2PO4；4.2mmol/lNaHCO3；1.3mmol/lCaCl2；0.5mmol/lMgCl2；0.6mmol/lMgSO4；137mmol/lNaCl；5.6mmol/lD-Glucose；pH7.2-7.4②胰岛洗液：HBSS＋0.1％BSA③酶溶液：HBSS＋1％BSA＋20mmol/lHEPES＋1mol/lNaOHpH7.4，使用之前充氧5min。④不连续梯度液：A液（密度1.091）：162gDextran70溶于500mLHBSS液中，校对密度B液（密度1.081）：12.8mLA液＋2.8mLHBSSC液（密度1.037）：4.78mLB液＋5.22mLHBSS⑤克-林重碳酸盐缓冲液（Krebs-Ringerbicarbonate，KRB）缓冲液成分：118mmol/lNaCl；5.4mmol/lKCl；2.4mmol/lCaCl2；1.2mmol/lMgSO4；1.2mmol/lKH2PO4；10mmol/lHEPES；2.8mmol/l及25mmol/lD-Glucose；0.1％BSA；pH7.2-7.4，使用前充氧10min。⑥DTZ染液：190mgDTZ加入30mL二甲亚砜混匀，避光摇晃10h，过滤后避光保存。⑦PI/AO染液：PI贮存液：1mg/mL浓度，溶于0.01mol/lPBS中，避光，-20℃保存，使用前稀释100倍。AO贮存液：60ug/mL浓度，溶于0.1mol/l柠檬酸缓冲液中，避光，-20℃保存，使用前稀释10倍。⑧胰岛培养液：DMEM细胞培养液：含糖5.6mmol/l，10％BSA，青霉素（100u/ml）/链霉素（100µg/ml）。20---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文16.7主要器械及仪器恒温水浴箱：JouanNordic公司，型号：SBD50-1bio5810R高速冷冻离心机：Eppendorf公司体式解剖显微镜：Leica公司荧光倒置相差显微镜：Leica公司恒温水浴摇床：丹麦HETO公司蠕动泵：Minipuls3speedcontrolmodule，Gilson公司恒温磁力搅拌器：英国JENWAY公司二氧化碳培养箱：德国Heraeus公司超净工作台：苏州净化设备厂1.1.胰岛分离、纯化大鼠采用乙醚持续吸入麻醉，四肢固定后喷洒70％酒精消毒胸腹部，腹部锲形切开，暴露腹腔，沿十二指肠找到胆总管十二指肠端用止血钳夹闭，刺破心脏,放血处死大鼠，于各胆管汇入胆总管上方剪开主胆管，插入24G套管灌注0.75mg/mlⅪ型胶原酶（0.75mg/mL）10ml,分离已充盈的胰腺，置于预先加入1ml胶原酶溶液的消化瓶中，37℃水浴振荡消化17～19min，取出后置漩涡振荡器上打散致细沙状，600µm不锈钢丝网过筛，立即加入4℃HBSS液40ml终止消化，1000r/min4℃离心1min,弃上清，同法再洗涤2次，沉淀加密度为1.091的Dextron70A溶液10ml混匀，随后再依次加入密度1.091、1.081和1.037的Dextron70B、C溶液各4ml，4℃离心400r/min,4min后稳步加速至1900r/min继续离心15min，吸取1.081、1.037界面的胰岛置于4℃HBSS液中1500r/min洗3次。3．观察指标7.2．DTZ特异性染色鉴定胰岛细胞:因胰岛内锌离子含量高于其他组织，可与DTZ特异性结合，呈现鲜红色，其他组织细胞无此表现,故可用以鉴定胰岛组织。取3mL配置完的DTZ溶液加HBSS液1.5mL，滤去沉淀，以1：10比例与胰岛悬液混合，21---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文3min后镜检。16.7胰岛计数及纯度评估：将新分离后的胰岛离心后去上清，沉淀加DMEM培养液，定量至5ml，取100µl与DTZ混和后，镜下直接计数DTZ红染细胞团，估算每只大鼠获得胰岛数，并依红染细胞团占镜下所有细胞团总数比估定胰岛纯度。16.8糖刺激试验:镜下选取直径为150～250µm的胰岛置入24孔板，10个/孔，每孔加1ml含0.5％BSA、低糖（3.3mmol/l）KRBB预培养胰岛30min后去上清，先后换入含0.5％BSA的低糖（3.3mmol/l）、高糖（16.7mmol/l）KRBB液1ml/孔，各培养45min，收集上清，放射免疫法检测胰岛素含量。16.9胰岛活性检测：AO/PI荧光染色法判定胰岛内细胞活性。取0.01mlAO,1mlPI溶液混合,Dulbeccos磷酸盐缓冲液10倍稀释，0.22µm滤膜过滤，加入胰岛混合10min，双向倒置荧光显微镜下分别以555nm和429nm激发，可见绿色及红色荧光，绿色荧光为有活性的胰岛细胞，红色荧光为死亡的胰岛细胞。16.10胰岛细胞培养及形态学观察：新分离胰岛悬浮于培养液中，37℃、5％CO2培养箱培养，隔日换液，定期镜下观察并记录其生长情况。1.1.统计学分析数据以均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较用团体t检验。结果7.2胰岛计数：10只大鼠每只纯化后获得胰岛数（743.60±43.07）个（表1）。表1：每只大鼠纯化后获得的胰岛个数Tab1Thenumberofisletsisolatedfromeachrat编号12345678910胰岛个数（个）651725764782738766792697772749x743.6s43.722---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文16.7新鲜分离纯化的胰岛：图1新鲜分离、纯化的胰岛Fig1freshlyisolatedratislets（200×）经Dextron70不连续梯度密度离心后，除底部沉淀外，各层均较清亮，仅于1.081、1.1.界面间见一折光性不同的薄层。吸取该薄层物质，洗涤后镜下观察，见大小不一、圆形或椭圆形、边缘清晰的立体细胞团块。16.8DTZ染色：图2胰岛DTZ染色Fig2DTZstainingofratislets（400×）DTZ染色显示：经分离纯化后，有大量表面光滑不透光细胞团呈DTZ染色阳性（鲜红色），且形状规则，边界完整，多为圆形或椭圆形。部分DTZ染色阳性细胞呈散在状态，单个或数个聚集分布于外分泌组织碎片中。16.9PI/AO染色：23---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文图3胰岛AO/PI染色Fig3PI/AOstainingofratislets（200×）PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染呈阳性；AO阳性为活细胞，AO能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。荧光镜下呈绿色。PI和AO的比例取决于每次分离纯化后胰岛的活性。总体而言，AO阳性率一般在90％以上。5．体外培养2周的胰岛：图4培养2周的胰岛Fig4ratisletsculturedfor2weeks（400×）胰岛培养过程中，外分泌组织等杂质逐渐减少。胰岛细胞早期生长状况良好，包膜清晰、表面光滑。自培养第9天始，少数胰岛包膜逐渐皱缩，形态不规则，周围出现散在单个细胞。培养至2周左右，部分胰岛中心出现坏死。16.7糖刺激试验:24---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文12010016.748±12.758060401.1.35±7.002007.23mmol/L16.7mmol/L图5：胰岛糖刺激试验结果Fig5Insulinreleaseofratislets获得的胰岛在低糖和高糖环境刺激下，胰岛素释放量分别为（25.35±7.00）µIU/ml和（86.48±12.75）µIU/ml,胰岛高糖刺激释放的胰岛素浓度达低糖的3倍以上，具有十分显著的差异（P<0.01）,说明所得胰岛具有较高的胰岛素分泌能力。讨论稳定、高效的胰岛分离、纯化技术是进一步开展胰岛移植治疗糖尿病相关分析的基础,然而在当前各家报道的众多改良或改进的胰岛分离方法中并无一种能被普遍认同而成为标准化方案。本分析中10只大鼠应用该方案行胰岛分离，皆获得了稳定且质量较高的分离结果，现总结经验如下：①胰腺的充盈程度直接关系到分离的结果[6]，而胶原酶注入的速度又影响胰腺的充盈。我们的经验是胆管注酶须先慢后快，最初2ml酶溶液应缓慢注入，使近肝细小胰管充分扩张，而剩余的8ml则需快速推注，提升压力以充盈近脾脏及结肠端的胰腺。②大鼠胰腺包膜与肠管系统广泛连接，逐一分离较困难，但该连接仅在十二指肠近端及结肠远端较为牢固，以眼科剪离断此两处牢固连接，再向上提拉肠管即可分离肠管和胰腺。充盈后的胰腺包膜易破，不能直接钳夹，可以脾脏作为牵引，剪开胰腺与其他部位的连接，即可获得包膜较25---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文为完整的胰腺组织。胰腺分离后应及时进行修剪，去除与胰腺附着的脂肪、淋巴及血管等，以避免影响对消化程度的判断。自刺破大鼠心脏至获得胰腺组织置入消化瓶，时间应控制在6min以内，否则会影响分离结果。③胶原酶浓度不宜过高，否则将导致胶冻状物质形成，影响胰岛分离结果，本分析选用较低的0.75mg/mL浓度，未观察到有胶冻状物质形成。消化时间应控制在17～19min，消化时间过短，胰岛与周围结缔组织分离不完全，而消化过度则可导致分离后胰岛功能受损[7]。④使用Vetex漩涡振荡器打散消化后的胰腺组织可避免人工振荡打散用力不均等缺点，且方便初学者掌握，打散一般7～10次，要求打散至细沙状即可，过细则破坏胰岛完整性。⑤相对于普遍使用的Ficoll离心液，Dextron70离心液获得方便，而纯化效果毫不逊色，本组使用Dextron70分离纯化后所得胰岛在获得胰岛数量及纯度上皆与国内李永翔等Ficoll分离结果相似[8]，且Dextron70可保持胶体渗透压，抑制胰岛组织间水肿，保证分离后胰岛的活性及功能，本组分离所得胰岛在高糖刺激下分泌胰岛素量达低糖刺激的3倍以上，达到或略优于多数文献报道。加注密度1.081和1.037的Dextron70溶液时速度须慢，以避免不同密度的离心液混合，破坏密度界面，可选用1ml移液枪吸取溶液沿离心管管壁滴注。离心前设定离心机离心程序为稳步加速和无刹车减速，避免突然加速和减速造成离心液激荡而破坏密度界面。1900r/min主离心前400r/min的初离心目的则在于对胰腺各组织细胞进行初分，同时减少胰岛贴壁，提高胰岛收获量。大多数的文献[9、10]中提取大鼠胰岛皆须添加4种密度的离心液，且须在2个界面上吸取胰岛细胞，操作较繁琐，经改良的分离法只须添加3种密度并只在1个界面上吸取胰岛，简化了操作流程。胰岛分离、纯化是一项对实验条件、操作人员熟练度等各方面要求甚高的精细技术。相同的实验条件，不同的实验人员操作，最终的分离结果可能相差甚多，问题的关键在于细节的把握和处理。本改良技术在保证胰岛产量和质量的基础上简化了实验流程、规范了操作细节。26---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文第2部分CoPP诱导胰岛HO-1适度表达的分析HO-1的作用在一定范围内与其表达量呈正相关，表达过低，发挥作用不明显，诱导其过表达则会因诱导剂量过大对供体产生毒性作用而削弱移植物功能[11]。国内外文献尚未见将CoPP应用于大鼠胰岛的报道，故有必要对该药物的作用特点做一深入分析以应用于以后的实验。材料与方法16.7材料1.1.实验动物：SPF级雄性SD大鼠10只，体重240～260g，由中国科学院上海实验动物中心提供。饲养标准遵照卫生部颁发的“医学实验动物全价营养饲料标准”。实验前禁食24h，自由饮水。7.2．主要试剂：CoPP购自Sigma公司，按文献[11]配成溶液，其余试剂同第一部分。2．方法743.6．大鼠胰岛的分离、纯化：同第一部分。743.7．剂量－效应关系的分析：将20只大鼠的胰岛随机均分为5组，分别加入含不同剂量CoPP的DMEM培养液于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。A组：对照组，加入不含CoPP的DMEM液培养；B组：CoPP剂量为5mmol/l；C组：CoPP剂量为25mmol/l；D组：CoPP剂量为50mmol/l；E组：CoPP剂量为75mmol/l。RT-PCR检测HO-1mRNA，Western-Blot检测HO-1蛋白表达。根据结果选择最佳CoPP剂量。43.7诱导时间－效应关系的分析：根据不同诱导时间将20只大鼠的胰岛随机均分为5组，分别加入含最适剂量27---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文CoPP的DMEM培养液于37℃，5％CO2培养箱中培养。组1：培养6h；组2：培养12h；组3：培养24h；组4：培养36h；组5：培养48h。RT-PCR检测HO-1mRNA， Western-Blot检测HO-1蛋白表达。根据结果选择最佳CoPP诱导时间。16.7RT-PCR测定胰岛HO-1mRNA表达：1.1.RT-PCR主要试剂、仪器及用途名称厂家用途移液器Eppendorf样品RNA抽提Eppendorf5810R离心机mastercycleep384PCR仪EppendorfRNA逆转录（cDNA合 PTC-200PCR仪MJResearch成）BIORADIcycler5色荧光定量BIORADPCR、Real－timePCR PCR仪Icyclerversion3.1.7050荧光定BIORAD荧光定量PCR分析软量分析软件件；GELMate2000电泳系统TOYOBOBiotechGIS数码凝胶图像处理系统上海天能科技TrizolReagentInvitrogenDNaseI(RNaseFree)宝生物工程(大连)PCR产物电泳系统及分析软件样品RNA抽提无水乙醇、异丙醇、氯仿上海国药集团RevertraAce－a－TOYOBOBiotechRNA逆转录（cDNA合 SupersciptIIIReverseInvitrogen Transcriptase成）RealTimePCRMasterMixr-TAQTOYOBOBiotechPCR、Real－timePCRKODPLUSBlendTaqAgaroseBIOWESTAGAROSEPCR产物电泳DNA100bpMarkerTOYOBOBiotech引物及探针上海生工引物及设计软件引物上海英骏PRIMER5.0引物设计软件ABI1.2.步骤①样品处理，细胞样品RNA的抽提:---- -------28---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文a.将贴壁细胞的培养液倒掉，迅速加入1mltrizol，反复吹吸使细胞样品充分裂解。b.转移到1.5mlDEPC处理的无菌离心管中，加入400ul氯仿，剧烈震荡混匀，4℃12000rpm离心10min。c.转移上清至另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），剧烈震荡混匀，4℃12000rpm离心10min。d.转移上清至另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），剧烈震荡混匀，4℃12000rpm离心10min。e.转移上清至另一离心管中，加入等体积异丙醇，震荡混匀，室温放置2min，4℃12000rpm离心10min。f.轻轻移弃上清，防止吸去沉淀，加入1ml70％乙醇，悬浮沉淀，4℃12000rpm离心10min。g.重复步骤f。h.轻轻移弃上清，防止吸去沉淀，4℃12000rpm离心1min，用移液器吸干残余酒精，室温空气干燥，使酒精挥发，不要太干，不然RNA难于溶解。i.加入50ulDEPC处理的灭菌水，溶解RNA。j.电泳察看RNA的浓度和完整性。②DnaseI(RnaseFree)去除基因组DNAa.在微量Tube中配制下列反应液，全量50ul全RNA20ug10×DnaseIBuffer5ulDnaseI(Rnase-free,5U/ul)2ulRnaseInhibitor(40U/ul)0.5ulDEPC处理水加至50ulb.37℃反应20～30min。c.加入50ul的DEPC处理水。d.加入100ul(等量)的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀。e.离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。29---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文f.加入10ul(1/10量)的3mol/lNaOAC(pH5.2)。g.加入250ul的冷无水乙醇，－20℃放置30～60分钟。h.离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。i.用适量DEPC处理水溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA。③RNA的反转录a.RNA(2ug)2ugPrimer（oligodT）1ulRNase抑制剂0.5ul补DEPC水至终体积10ul。轻轻混匀并在微量离心机低速将混合液收集在底部。b.离心收集混合液至管底。c.每个反应管中顺序加入以下试剂：5XRTBuffer4uldNTPMix(10mmol/leach)1ulRNase抑制剂0.5ulDEPCH2O*3.5ulMMLVReverseTranscriptase(100units/ul)1ul42℃空气浴孵育1h，99℃5min。d.cDNA的荧光定量PCR扩增30ul体系荧光定量反应体系及反应条件:所加试剂浓度体积反应条件荧光定量MasterMIX(含SYBR27ul95℃3min荧光染料)95℃20s正义链25pmol1ul61℃20s×50个循环反义链25pmol1ul72℃30s模板1ul72℃5min总体积30ul---- -------30---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文RT-PCR特异性引物的设计合成HO-1基因正义链:5'-TCCCAGACACCGCTCCTGCGA-3'反义链:5'-GGATTTGGGGCTGCTGGTTTC-3'GAPDH正义链:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’反义链:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’16.7Western-Blot检测HO-1蛋白表达：1.1.试剂一级抗体：HO-1兔抗鼠多克隆抗体（Stressgen公司），稀释比例1：3000二级抗体：Anti-rabbit（康成生物工程公司），稀释比例1:5000β-actin（康成生物工程公司），稀释比例1:10000细胞及组织总蛋白抽提试剂盒（上海康成生物技术有限公司）BCA蛋白质定量试剂盒（上海康成生物技术有限公司）丙烯酰胺双丙烯酰胺10%SDS(w/v)Tris-Cl1.5mol/lpH8.8Tris-Cl1.0mol/lpH6.810％APSTEMED生物素的标记的蛋白分子量标准甘油β巯基乙醇溴酚蓝10X电泳缓冲液(Tris碱30.3g,甘油144g,SDS10g,双蒸水调至体积为1L)Tris碱31---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文甘氨酸甲TBST：1×TBS(TrisBufferedSaline),0.1％吐温－205％BSA溶液化学发光试剂盒（上海康成生物技术有限公司）显影液（冠龙照相器材有限公司）定影液（冠龙照相器材有限公司）X光胶片（冠龙照相器材有限公司）16.7仪器酶标仪（Thermo）电泳仪（北京六一仪器厂）电泳、转移装置（BIO-RAD）磁力搅拌器（英国JENWAY公司）脱色摇床（丹麦HETO公司）扫描仪（上海天能仪器有限公司）16.8步骤①蛋白质抽提a.组织称重置入管中。b.配制含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5ul蛋白酶抑制剂混合液，5ulPMSF和5ul磷酸酶混合液）。c.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。d.用匀浆器每次30s低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1min，至组织完全裂解。e.裂解液于预冷的离心机中14000g离心15min。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。②BCA蛋白质定量每孔需配置200ul的BCA工作液。以50份BCA试剂A加1份BCA试剂B（50：1，试剂A：试剂B）的比例混合以配置BCA工作液（WR）。如10个孔的实验需要用2ml试剂A混合40ul试剂B。32---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文a.分别吸25µl标准品到微孔板的对应孔中(浓度为0～2000µg/ml)。b.分别吸取2.5µl待测样品至微孔板对应孔中，并加入22.5ul稀释液。c.每孔加入200µlWR，震板30s以彻底混合均匀。d.盖好微孔板，37℃孵育30min。e.冷却至室温。f.测量562nm附近（540～590nm皆可以使用）的各孔吸收值。g.测得的每个标准孔和待测样品孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值.h.以校正过的BSA标准蛋白562nm测量值对其浓度（ug/ml）做图绘制标准曲线。使用标准曲线定量待测样品蛋白浓度。③SDS-PAGE电泳a．制备分离胶(pH8.8):凝胶浓度10％30:0.8％w/v丙烯酰胺：双丙烯酰胺2.5ml16.7mol/lTris-ClpH8.83ml10％SDS38uldH2O1.9ml混合，灌胶前加入APS和TEMED10％APS36ulTEMED5ul总体积l7.5ml用注射器将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上覆盖乙醇或水坝，放置1h左右至聚合完全。b．制备积层胶(pH6.8):4％积层胶配合<10％的分离胶使用，6％积层胶配合>10％的分离胶使用。积层胶浓度4％30:0.8％w/v丙烯酰胺：双丙烯酰胺660ul33---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文1mol/lTris-ClpH6.8630ul10％SDS25uldH2O3.6ml混合，灌胶前加入APS和TEMED10％APS25ulTEMED5ul总体积5ml使用Whatman3mmol/l滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用10ml注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1h左右。c．样品准备:上样染液(Laemmli上样染液)3X储存液1mol/lTris-ClpH6.82.4ml20％SDS3ml甘油(100％)3mlβ巯基乙醇1.6ml溴酚蓝0.006g总体积10ml(储存于4℃)准备1X上样缓冲液的样品液：如6ul蛋白样品加入3ul3X上样染液储存液。每孔配制含50ug总蛋白样的样品液。上样前煮沸3～5min。d．加入电泳缓冲液，上样：凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1X电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1～2cm。BioRad电泳槽中需加入500ml的1X电泳缓冲液(50ml的10X储存液+450mldH20)。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中。e．电泳：使用BioRad电泳装置，样品首先在80V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端。然后160V恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4℃。34---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文④蛋白质转移a.准备好Bio-Rad蛋白转移装置夹板，凝胶用1X转移缓冲液稍微清洗。b.吸水纸，滤纸（比凝胶稍微大一些）用1X转移缓冲液预湿，如下顺序装配于转移装置上。吸水纸－滤纸－凝胶－PVDF膜或NC膜－滤纸－吸水纸c.30mA恒流条件下，4℃转移过夜。1X转移缓冲液Tris碱15.14g甘氨酸72.07g甲醇1L加水至总体积为5L⑤膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1h以封闭膜上的非特异结合。TBST洗膜3次，每次5min。b．封闭过的膜加入一级抗体4℃过夜或室温1.5h，抗原抗体结合。TBST洗膜3次，每次5min。c．加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1h。TBST洗膜4次，每次5min。⑥结果检测a．化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液。b．将膜置于反应液中室温孵育5min。c．去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光。d．图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。16.7糖刺激试验：手捡新鲜分离的胰岛（对照组）、经最适CoPP剂量和最佳诱导时间诱导的胰岛（实验组）及高剂量诱导的胰岛（高剂量组）（200µm左右）行糖刺激试验，方法同第一部分。35---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文16.7统计学处理：数据以均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较用团体t检验。结果1.1.剂量－效应关系：各组均能检测到HO-1mRNA，与CoPP共培养能诱导HO-1mRNA上调。CoPP剂量为5mmol/l（B组）、25mmol/l（C组）、50mmol/l（D组）、75mmol/l（E组）时，HO-1mRNA相对表达量为对照组（A组）的1.1、1.67、2.48、1.88倍。可见诱导剂量为50mmol/l时HO-1mRNA表达最强（图6）。HO-1蛋白表达情况与mRNA相似，D组条带深于其余4组；各组β-actin均有表达（图7）。41.2.4831.887.26721.1 110A组B组C组D组E组图6：不同CoPP剂量时胰岛HO-1mRNA表达情况Fig6TheexpressionofHO-1mRNAfordifferentdosesofCoPP36---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文A组B组C组D组E组HO-1β-actin图7：不同CoPP剂量时胰岛HO-1蛋白表达情况Fig7TheexpressionofHO-1protienfordifferentdosesofCoPP2．诱导时间－效应关系：诱导时间为12h、24h、36h及48h时，HO-1mRNA相对表达量为诱导时间为6h的1.6、2.4、3.6及3倍（图8）。可见诱导时间为36h时HO-1mRNA表达最强。HO-1蛋白表达情况与mRNA相似，组4条带深于其余4组；各组β-actin均有表达（图9）。53.6 342.41.6 31 210组1组2组3组4组5图8：不同诱导时间下胰岛HO-1mRNA表达情况Fig8TheexpressionofHO-1mRNAunderdifferentinducingtimeofCoPP37---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文组1组2组3组4组5HO-1β-actin图9：不同诱导时间下胰岛HO-1蛋白表达情况Fig9TheexpressionofHO-1protienunderdifferentinducingtimeofCoPP3．糖刺激试验：实验组在低糖及高糖刺激下胰岛素分泌量为（30.52±2.04）µIU/ml及（104.60±5.10）µIU/ml均显著高于对照组的（20.35±1.79）µIU/ml及（62.39±2.50）µIU/ml，且两组刺激指数分别为（3.47±0.06）及（3.10±0.08），有显著差异（P<0.05）。胰岛在CoPP剂量为75mmol/l，诱导时间为36h时（高剂量组）胰岛素分泌量为（14.57±2.41）µIU/ml及（43.67±7.40）µIU/ml，显著低于对照组（P<0.05）（表2），说明胰岛功能已受损。表2：体外胰岛素释放试验结果Tab2Insulinreleaseofratislets组别低糖（mIU/L）高糖（mIU/L）刺激指数（高糖/低糖）对照组16.7±1.7962.39±2.503.10±0.08实验组1.1.±2.04104.60±5.103.47±0.06高剂量组7.2±2.4143.67±7.403.00±0.12---- -------38---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文论讨近年来诸多分析均表明HO-1是一种细胞保护性物质，具抗炎、抗凋亡及抗氧化等作用，被认为是决定移植物长期存活的重要物质[12]，将其应用于异种胰岛移植国内尚未见报道。目前我们还未掌握HO-1诱导剂CoPP的作用特点，且HO-1的作用在一定范围内与其表达量呈正相关，表达过低，发挥作用不明显，诱导其过表达则会因诱导剂量过大对供体产生毒性作用而削弱移植物功能[11]，因此有必要对CoPP的作用特点做一分析。本实验通过剂量及诱导时间两方面对CoPP的诱导效应进行分析，结果显示HO-1的表达量与CoPP剂量及诱导时间有关。RT-PCR及Western-Blot结果均提示HO-1表达的峰值出现在CoPP剂量为50mmol/l及诱导时间为36h时。有文献报道[13]HO-1在新鲜分离的大鼠胰岛中无表达,仅在培养20h后开始表达。我们分析发现CoPP在与胰岛共培养6h后HO-1即出现表达，说明CoPP是HO-1强有效的诱导剂。此外，为确定CoPP的诱导作用对胰岛功能的影响，我们将胰岛与50mmol/lCoPP共培养36h后行糖刺激实验，结果却显示胰岛素分泌功能不但未受损反而得到加强，提示CoPP体外诱导胰岛适度表达HO-1对胰岛功能具促进作用，可能与HO-1的催化产物CO通过鸟苷酸环化酶－cGMP－蛋白激酶系统刺激胰岛素释放有关[14]。本实验还得出与其它体内实验相同的结果。体内实验证实胰岛素分泌功能障碍的Goto-Kakizaki(GK)大鼠胰岛中HO-1活性和CO含量明显降低，胰岛素分泌能力亦减退，若体内注射HO-1诱导剂后其胰岛素释放率与正常大鼠无差异[15]。同样，糖尿病大鼠腹腔内给予CoPP后发现血糖水平得到更好地改善，进一步分析发现胰岛移植同时受体内注射CoPP，比单独胰岛移植控制血糖作用更强[16]，说明受体内注射CoPP可改善移植后的胰岛功能。我们实验证实若CoPP剂量增加至75mmol/l，胰岛功能则明显减退，胰岛素分泌显著低于未经诱导的对照组，说明CoPP剂量在一定范围内可促进胰岛功能，若超出此范围则对胰岛产生毒性作用。本分析确定了CoPP体外诱导大鼠胰岛HO-1适度表达的最适诱导剂量为50mmol/l，最佳诱导时间为36h，在这一条件下诱导的胰岛其功能得到明显改善。39---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文第3部分HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护作用HO-1作为一种重要的细胞保护物质可延长诸如肝脏、心脏及肾脏等移植物的存活时间，但对异种胰岛移植物是否具有相同效果我们不得而知。第二部分实验中我们已掌握HO-1诱导剂CoPP的作用特点，在此基础上我们将探索CoPP诱导HO-1适度表达能否保护异种胰岛移植物。材料和方法16.7材料1.1.动物：供体为雄性SD大鼠（240～260g），受体为雄性C57BL/6受体鼠（23～27g），由中国科学院上海实验动物中心提供。术前大鼠禁食12h，但不禁水。1.2.试剂及仪器：试剂同第一、第二部分。血糖仪及试纸购于罗氏公司16.8方法7.2大鼠胰岛分离纯化：同第一部分。7.3糖尿病模型小鼠的建立：受体鼠禁食16h，但不禁水。腹腔注射200mg/kg链脲霉素，连续2次随机血糖>20mmol/l认为成模[11]。7.4分组：成模后5d给予胰岛移植，按术前不同处理方式随机将分离纯化的胰岛分为3组，A组胰岛体外培养36h；B组胰岛与50mmol/lHO-1诱导剂CoPP共培养36h；C组胰岛与50mmol/lCoPP及50mmol/l诱导阻断剂ZnPP共培养36h。受体鼠也随机分40---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文为3组，每组11只，分别接受上述3组胰岛。采用左肾包膜下移植法[17]，移植量为500IEQ/只。术后每日尾静脉采血，血糖仪监测血糖，连续2d随机血糖>20mmol/l认为发生排斥。移植后3天每组取3只受体鼠经球后静脉采血并处死，取胰岛移植物组织，并分离血清，用于第四部分的实验。16.7RT-PCR检测胰岛HO-1mRNA：方法同第二部分。16.8Western-Blot检测胰岛HO-1蛋白表达：方法同第二部分。16.9统计学方法：数据以均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较用团体t检验，Kaplan-Meier法进行生存分析。结果1.1.受体鼠术前血糖：A组受体鼠术前血糖为（22.38±2.39）mmol/l，B组为（23.10±1.94）mmol/l，C组为（22.35±2.18）mmol/l。A、B两组、A、C两组、B、C两组分别比较差异均无统计学意义（P值分别为0.34、0.49及0.34）。1.2.胰岛HO-1mRNA和蛋白的表达：每组各进行3次实验，A组胰岛HO-1mRNA相对表达量为（1），B组为（3.326±0.251），C组为（0.724±0.139）。A、B两组比较差异有统计学意义（P=0.02），B、C两组差异有统计学意义（P=0.005），A、C两组差异无统计学意义（P=0.08）（图10）。B组蛋白表达高于A、C两组（图11）。41---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文416.7326±0.25132110.724±0.1390A组B组C组图10：三组胰岛HO-1mRNA表达情况Fig10HO-1mRNAexpressioninthethreegroupsA组B组C组HO-1β-actin图11：三组胰岛HO-1蛋白表达情况Fig11HO-1protienexpressioninthethreegroups1.1.受体鼠正常血糖维持时间：各组受体鼠正常血糖维持时间见表3。其中A组受体鼠正常血糖维持时间为(9.88±2.17)d，B组为(14.63±1.19)d，C组为(9.38±1.60)d。B组分别与A、C两组比较差异均有统计学意义（P值分别为0.003及0.0005），A、C两组差异无统计学意义（P=0.46）（图12）。42---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文表3：三组受体鼠正常血糖维持时间Tab3Timeofnormoglycemiaofthethreegroups组别时间（d）平均时间（d）A6，8，10，10，12，10，10，139.88±2.17B15，13，13，16，15，14，16，1514.63±1.19C10，12，9，8，7，9，9，119.38±1.60图12：三组受体鼠血糖维持正常时间Fig12Theremainingtimeofnormoglycemiainthethreegroups讨论HO-1是应激蛋白的一种，作为血红素降解的限速酶可将其降解为胆绿素、游离铁和CO，HO有三种同工酶：HO-1、HO-2和HO-3。HO-1属诱导型，热休克蛋白或应激蛋白，对能引起氧化应激和其它致病理反应的刺激物十分敏感，包括血红素、血红蛋白、重金属、过氧化物、紫外线及缺氧等，其主要分布于肝脏、脾脏、肾脏及心脏。其作为一种重要的细胞保护物质可延长诸如肝脏、心脏及肾脏等同种移植物的存活时间。HO-1能否在异种胰岛移植中发挥相同作用呢？我们对此进行了初步探索。在第二部分的实验中我们证实CoPP诱导HO-1表达时峰值出现在剂量为5043---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文mmol/L，诱导时间为36h。因此我们以50mmol/L为HO-1诱导剂量，36h为诱导时间。实验中CoPP诱导HO-1表达的作用可被ZnPP所抵消，经CoPP体外诱导的胰岛存活时间显著长于未经诱导及经ZnPP阻断的胰岛，这直接证明了HO-1对异种胰岛移植物具保护作用。业亦证明异种胰岛移植的急性排斥反应是以CD4＋T细胞及巨噬细胞浸润为特征的炎症反应[18]。实验证明移植后促炎症因子引起的级联反应可严重损害移植物，趋化中性粒细胞聚集，上调细胞粘附分子-1(ICAM-1)、P选择素等内皮粘附分子的表达，HO-1则通过下调粘附及趋化分子来抑制炎症细胞聚集[2]，同时HO-1催化产物CO可有效降低炎症因子表达。Otterbein等[19]证明CO可选择性降低炎症因子TNF-α、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白-1的表达，增加体内外IL-10表达，而IL-10的抗炎效应依赖于CO通过有丝分裂原介导的P38激活蛋白激酶途径[20]。最新分析还表明HO-1抑制急性排斥反应的作用是其诱导CD4＋T细胞发生Fas介导的活化诱导的细胞死亡(activation-inducedcelldeath,AICD)[21]及抑制诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)活性所致的结果。iNOS过表达被认为与急性排斥有关[22]。HO-1催化产物CO能抑制iNOS活性，游离铁则能下调iNOS的转录过程，从而通过抑制NO系统发挥作用。此外，胰岛凋亡与排斥反应有关，Günther等[23]发现HO-1催化产物CO可通过鸟苷酸环化酶活化、环磷鸟苷(cGMP)产生及cGMP依赖性蛋白激酶激活而延缓胰岛β细胞凋亡。Tobiasch等[24]分析显示HO-1可使胰岛受TNF-α介导的凋亡率从75％降至5％。HO-1催化产物胆绿素能阻断IL-2转录所需的NK-Kb、NF-AT等因子，从而抑制与急、慢性排斥有关的T细胞活化[25]。综上所述，我们认为诱导胰岛适度表达HO-1可显著延长异种胰岛移植物的存活时间，但HO-1在异种移植中的具体机制尚有待进一步分析。44---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文第4部分HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护机制我们在第三部分实验中已证明HO-1对异种胰岛移植物确具保护作用，但其中机制相对复杂，本部分仅对该作用机制做一初步探讨。材料和方法16.7材料1.1.受体鼠血清及胰岛移植物已在第三部分获得。1.2.试剂及仪器：IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1βELISA检测试剂盒（上海晶美生物技术有限公司）酶标仪（BIO-RAD公司）16.8方法7.2受体鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β的检测：ELISA法检测IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β：建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100µl，反复对比稀释。加样：待测品孔每孔各加入待测样品（100µl/孔）。将反应板充分混匀后置37℃，90min。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，在滤纸上印干。每孔中加生物素化抗体工作液100µl，将反应板置37℃，60min。每孔加酶标抗体工作液100µl，置37℃，暗反应30min。每孔加入显色剂100µl，置37℃，反应10－15min。每孔加入100µl终止液，在450nm处测吸光值，所得OD值都减去空白值后计算。以标准品OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线，根据标准曲线读出待测样品的数值。7.3RT-PCR检测IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1βmRNA的表达：743.6体系中各组分的体积（每组各进行3次实验）45---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文项目每反应厂家超纯水16.7ulInvitrogen10Xpcrbuffer5ulInvitrogen镁离子(25mmol/l)3ulInvitrogendNTPs(25mmol/l)0.4ulTaKaRa上游引物（10uM)1ul上海英骏Sybr(50X)1ulInvitrogen下游引物（10uM)1ul上海英骏Taq酶（5u/ul)1.1.ulPlatinumTaq模板7.2ul总体系50ulIFN-γ正义链：5'-AGGGAAGCACCAGGTGTCAA-3'反义链：5'-CCAAGCGGCTGACTGAACTC-3'TNF-α正义链：5'-CATTGCACCTCAGGGAAGAA-3'反义链：5'-CCTCTCATGCACCACCATCA-3'IL-10正义链：5'-CCAAGGAGTTGTTTCCGTTAGC-3'反义链：5'-AGCTCCAAGACCAAGGTGTCTA-3'IL-1β正义链：5'-TTCATCCCCCACACGTTGAC-3'---- -------反义链：5'-TCCTTAGTCCTCGGCCAAGA-3'46---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文GAPDH正义链：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’反义链：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’反应条件：95℃2min变性95℃5sec退火60℃15sec×40个循环延伸72℃30sec16.7步骤：1.1.总RNA提取（Trizol法）①将组织磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％。②研磨液室温放置5min，然后按每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s。③取上层水相于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min。④弃去上清液，按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5min。⑤小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5～10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，55～60℃水溶10min。⑥对抽提的RNA进行OD260、OD280及其比值的测定。1.2.反转录①取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,每个样本加入如下成分得到mix1。ComponentAmountUpto5ugtotalRNA3ul47---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文Primer50uMoligio(dt)1ul10mmol/ldNTPMix1ulDEPC-treatedwaterto10ul②把mix165℃温浴5min，然后立即放冰2min。③在mix1里加入如下成分。得到mix2共20ul体系。ComponentAmount10xRTbutter2ul25mmol/l镁离子4ul16.7mol/ldTT2ulRNaseout40u/ul1ulSuperScripIIIRT（200u/ul）1ulmix110ulTotal20ul④50℃处理50min。⑤85℃处理5min。立即放置到冰上。⑥在每管mix2中加入1ul的RNaseH，37℃处理20min。1.1.．病理学检查（HE染色）：①移植物标本用10％福尔马林固定24小时，石蜡包埋后切为4µm薄片。②切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。③苏木素染色5min，自来水冲洗。④盐酸乙醇分化30s。⑤自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。⑥置伊红液2min。⑦常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）1min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙48---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。16.7．统计学方法：数据以均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较用团体t检验。结果1.1.3组受体鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β的量：各组受体鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β的量见表3，其中B组受体鼠血清中IL-10的量与A、C两组比较差异有统计学意义（P值分别为0.005及0.02），而A、C两组比较差异无统计学意义（P=0.06）。各组血清中IFN-γ、TNF-α及IL-1β的量无显著差异（P>0.05）（表4）。表4：三组受体鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β的量Tab4TheconcentrationsofIFN-γ、TNF-α、IL-10andIL-1βinserumofthethreegroups细胞因子A组(pg/ml)B组(pg/ml)C组(pg/ml)IFN-γ164.67±16.96171.62±22.14179.96±11.60TNF-α37.48±0.5838.25±6.7439.71±7.93IL-1030.57±3.9472.97±9.74＃45.55±8.26IL-1β79.39±6.4679.39±3.4176.21±8.22注：B组受体鼠血清中IL-10的量著高于A、C两组，＃P<0.05；而A、C两组间无差异，P>0.05。而3组受体鼠血清中IFN-γ、TNF-α及IL-1β的量无显著差异P>0.05。1.2.3组受体鼠移植物中IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1βmRNA的相对表达量：B组受体鼠胰岛移植物中IL-10mRNA的相对表达量为（5.71±1.02）与A、C---- -------49---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文的（1）及（1.61±0.77）比较差异有统计学意义（P值分别为0.007及0.03），而A、C两组比较差异无统计学意义（P=0.15）（图13）。各组胰岛移植物中IFN-γ、TNF-α及IL-1βmRNA的相对表达量无显著差异（P>0.05）。876516.771±1.02431.1.61±0.771 210A组B组C组图13：三组胰岛移植物组织中IL-10mRNA表达情况Fig13TheexpressionofIL-10mRNAingrafttissueofthethreegroups7.2病理学检查结果：B组移植物组织中淋巴细胞浸润明显轻于A、C两组（图14）。图14：三组胰岛移植物组织HE染色（箭头所指处为胰岛）Fig14TheHEstainingofisletgrafts(arrow)ofthethreegroups50---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文讨论本分析结果表明HO-1在保护异种胰岛时受体内IL-10升高，提示组织细胞因子表达以Th2型为主。在排斥反应过程中，Th1型应答起重要作用，而Th2型应答则参与免疫耐受过程。IL-10是一具多种生物学效应的细胞因子，参与机体多个生理及病理反应，如炎症反应、肿瘤免疫应答及移植免疫应答等[26]。其生物学作用包括：①作为Th2型细胞因子，能促B细胞激活、分化，介导体液免疫；②抑制前炎症因子表达；③抑制单核细胞表达MHCⅡ类分子和共刺激分子；④抑制Th1细胞增殖及IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF等细胞因子合成。故IL-10是另一种负性免疫调节因子。众所周知，免疫排斥反应的关键是白细胞向移植物趋化、浸润导致移植物毁损，而前炎症因子的表达更成为排斥反应中不可获缺的重要环节。其可通过上调胰岛内可诱导的一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)过表达引起急性排斥反应[27]。HO-1则通过代谢血红素生成CO下调iNOS并上调IL-10，使能抑制抗原递呈/辅助细胞的IL-10发挥强有力的炎症抑制作用[28]。该作用依赖于CO通过有丝分裂原介导的P38激活蛋白激酶途径[29、30]。此外，Lee等[20]发现HO-1过表达能抑制脂多糖诱导的前炎症因子表达，并促巨噬细胞释放IL-10。Otterbein等[19]报道低浓度CO能在体内外选择性增强脂多糖诱导的IL-10表达。以上结果均提示IL-10的抗炎作用依赖于HO-1的过表达和内源性CO的生成。病理结果显示B组移植物组织中淋巴细胞浸润明显轻于A、C两组，说明HO-1抑制了淋巴细胞的作用。McDaid等[31]用CoPP预处理小鼠脾细胞上调HO-1表达，通过克隆清除机制诱导外周同种CD4+T淋巴细胞凋亡，这种T淋巴细胞活化诱导的自身死亡作用是通过上调CD95/FasL信号途径产生的。Woo等[32]利用CoPP诱导小鼠HO-1高表达，可显著抑制脾脏T淋巴细胞及自然杀伤细胞介导的细胞毒作用，减弱细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的增殖及分化。虽然本实验发现HO-1在保护异种胰岛时受体内IL-10升高，但HO-1在异种移植中的作用机制相对复杂，目前尚不清楚，还有待进一步阐明。51---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文结论16.7改良后的分离纯化方法分离大鼠胰岛可获得高纯度高活率的胰岛细胞，且细胞形态正常、功能良好。本改良技术在保证胰岛产量和质量的基础上简化了实验流程、规范了操作细节。16.8CoPP体外诱导大鼠胰岛HO-1适度表达的最适诱导剂量为50mmol/l，最佳诱导时间为36h。16.9CoPP体外诱导HO-1适度表达对异种胰岛移植物具保护作用。16.10HO-1适度表达对异种胰岛移植物的保护机制可能与IL-10有关。52---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文参考文献16.7RedaelliCA,TianYH,SchaffnerT,etal.Extendedpreservationofratlivergraftbyinductionofhemeoxygenase-1.Hepatology,2002,35:1082-1092.16.8SoaresMP,BrouardS,SmithRN,etal.Hemeoxygenase-1,aprotectivegenethatpreventstherejectionoftransplantedorgans.ImmunolRev,2001,184:275-285.16.9NathKA,VercellottiGM,GrandeJP,etal.Hemeprotein-inducedchronicrenalinflammation:suppressiveeffectofinducedhemeoxygenase-1.KidneyInt,2001,59:106-117.16.10TulliusSG,Nieminen-KelhaM,BuelowR,etal.Inhibitionofischemia/reperfusioninjuryandchronicgraftdeteriorationbyasingle-donortreatmentwithcobalt-protoporphyrinfortheinductionofhemeoxygenase-1.Transplantation,2002,74:591-598.16.11HaanBJ,FaasMM,SpijkerH,etal.Factorinfluencingisolationsoffunctionalpancreaticratislet.Pancreas,2004,29:e15-e22.16.12TianXH,BaiSL,TongH.Theisolation/purificationandidentificationofwistarrat’sislet.ActaAnatomSin,2007,38:356-359.16.13李光伟,叶丽亚,李静，等.小鼠胰岛α细胞的缺失对移植胰岛功能的影响.中华医学杂志，2002，82:1-4.16.14李永翔,李戈,谭建明，等.大鼠胰岛分离纯化技术的改进.复旦学报医学版，2006,33:266-268.16.15ZhangH,ChenH,ZhangZ,etal.Efficacycomparisonofratisletpurificationbetween---- 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-------上海交通大学医学院硕士学位论文综述血红素氧和酶－1与胰岛移植近十年来，糖尿病患病率在世界各国急剧上升，已成为全球性卫生保健问题。为了糖尿病病人长期健康，通过移植的胰岛细胞替代胰腺分泌功能，增加病人胰岛素分泌，可有效地控制血糖，减少和改善糖尿病并发症。近年来胰岛细胞移植在技术上取得了令人鼓舞的成绩：①胰腺切取时向腹主动脉灌注UW液后再用冰盐水浸没网膜囊及整个胰腺，迅速分离胰腺体尾部，提高了胰岛产量、活性及功能，②在胰岛细胞分离、纯化方面，采用Ficoll或Dextran密度梯度离心将胰岛从消化了的胰腺组织中分离，可获取75％～95％纯度的胰岛细胞；通过静脉导管向门静脉注入胰岛细胞不但操作简单、安全而且能使胰岛细胞更好地发挥功能。因门静脉内为高氧和高营养环境，且肝脏是胰岛素的主要效应器官，利于糖代谢的调节。至2000年10月，全球共进行胰岛细胞同种异体移植493例，其中的237例为C肽阴性的Ⅰ型糖尿病病人,移植物1年存活率仅41％。在405例完整随访资料中，保持胰岛素非依赖性超过1个月、3个月、6个月、12个月、24个月、36个月、48个月的例数仅占12.3％、11.6％、10.1％、8.1％、4.9％、2.2％、0.7％。总结文献资料，造成如此低的成功率主要与缺血再灌注损伤、免疫排斥反应及胰岛细胞凋亡有关。缺血再灌注损伤(ischemicalreperfusioninjury,IRI)是胰岛细胞移植中无法克服的难题。胰岛细胞植入肝门静脉后逐步产生自身毛细血管，血流再灌注，此时氧自由基大量生成，胰岛移植物内氧超负荷。胰岛组织受到氧自由基攻击时，移植物毛细血管腔内出现红细胞溶解，导致血红素释放。同时，胰岛细胞膜受到氧自由基和细胞内氧化还原能力的双重损害，导致循环血红素进入细胞。血红素是过氧化氢酶和过氧化物酶的辅基，本身具强大的催化氧化能力；高度亲脂性使其既能直接攻击移植物细胞膜脂质双层、细胞骨架、代谢酶类和DNA，又可通过产生氧自由基造成间接损伤。此外，大量积聚的氧自由基还可攻击移植物毛细血管内皮细胞，导致毛细血管内皮细胞损伤甚至坏死、凋亡，同时促进MCP-1、VCAM-1、ICAM-1和IL-1β56---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文等细胞因子表达，使白细胞趋化、浸润于移植物内，进一步造成炎症损伤[1]。免疫排斥反应是导致胰岛细胞移植失败的另一重要原因。胰岛移植物被受体抗原呈递细胞摄取后激活同种异体CD4＋T细胞，进一步激活巨噬细胞，活化的巨噬细胞分泌TNF-α等前炎症细胞因子和IL-10等抗炎症因子。由于抗原刺激持续存在，巨噬细胞长期活化，造成胰岛移植物纤维化，最终失功能。此外，细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)介导的胰岛细胞凋亡也是导致移植物被排斥的重要原因。CTL通过两条途径攻击植入的胰岛细胞：①通过穿孔素和颗粒酶B途径。胰岛移植后发生急性排斥反应时，激活的CTL含大量颗粒，颗粒中主要包含穿孔素和颗粒酶B。穿孔素不仅增加了胰岛细胞膜通透性，且与颗粒酶B协同使颗粒酶B进人胰岛细胞内，激活内切酶系统，导致DNA断裂，使细胞凋亡。②通过Fas/FasL系统的相互作用，其机制有以下两个方面：通过CTL的FasL与胰岛细胞表面的Fas抗原相结合，介导其凋亡；胰岛细胞自身表达Fas及FasL，通过自身构象变化发生凋亡。由此可见，缺血再灌注损伤、免疫排斥及细胞凋亡大大降低了胰岛细胞移植的成功率。随着在肝、肾等传统移植领域中分析的不断深入，血红素氧和酶-1(hemeoxygenase1,HO-1)被证实与器官移植中细胞保护作用有关。HO-1是体内的一种抗氧化酶，主要分布于肝脏和脾脏，为血红素分解代谢限速酶，催化血红素降解为胆绿素、一氧化碳(CO)和游离铁，另称为热休克蛋白32(hotshockprotein32,HSP-32)。HO-1在多数组织内低水平表达，可被多种损伤性刺激包括高血红素、高氧、缺氧、热休克、内毒素、过氧化氢、细胞因子、紫外线、重金属和NO等诱导产生高水平表达。HO-1具抗细胞氧化、抗炎、抗细胞凋亡作用，并在器官移植冷保存损伤[2]及急、慢性排斥反应中起细胞保护作用[3]。Nath等[4]应用HO-1基因敲除肾损伤动物模型证实HO-1的表达是阻止肾小管间质炎症反应及炎症因子基因表达所必需的物质。最近分析表明，若缺血再灌注发生前应用诱导剂诱导HO-1表达可减轻肝脏、心脏和肾脏缺血再灌注损伤，保护这些脏器的结构，改善脏器功能[5-7]。Tullius等[8]在大鼠同种异体肾移植缺血再灌注损伤模型中证实急性排异反应可诱导HO-1表达，再灌注前应用钴原卟啉(CoPP)诱导HO-1过表达可减轻移植肾的损伤，延长移植肾存活时间。57---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文HO-1细胞保护作用主要与其功能有关，目前认为HO-1催化作用的产物是HO-1发挥功能的主要效应分子。1.抗氧化作用再灌注早期阶段，许多类型的细胞都将受到OFRs破坏，最初表现为影响非特异性前炎性反应和随后的抗原特异性免疫反应。HO-1系统保护细胞作用的最主要步骤是降解血红素（见图1A）。血红素联结蛋白（HPX）是一种60-kDa血浆脂蛋白，与血红素以1：1的分子比例结合，并以细胞介导的方式结合。转导时细胞占据血红素而脂质血红素联结蛋白又回到血液循环中[9]，HPX可减轻大鼠肝脏的缺血再灌注损伤和降低OFR产物[10]，通过HO-1系统蚕食血红素是预防缺血再灌注损伤的第一步。缺血使ATP耗竭并通过糖酵解途径进入无氧代谢，结果在再灌注早期阶段，氧供远远大于实际需求，多余的氧则充当氧化酶的底物，这些氧化酶包括黄嘌呤氧化酶和细胞色素P-450，它们产生具有破坏作用的OFRs，包括HO-1在内的氧化进程包括一系列的转换，其中3分子O2和7个电子。因此，通过HO-1系统的氧分子消耗将提供间接细胞保护作用，这样可降低氧化压力。另外HO-1可蚕食反应性氧介质（包括羟基、氧和氢氧化物），从而起到保护细胞的作用。胆绿素及其降解产物胆红素被认为是内源性保护细胞免受氧化损伤的重要物质（见图1D）[11]，在生理供氧情况下，胆绿素和胆红素能预防多链不饱和脂肪酸的氧化。铁是HO-1的另一个代谢产物，具调节作用，特别是转铁蛋白合成期间（见图1C）。虽然游离血红素和Fe++都是氧化介质的前体，但释放的铁较少聚集在细胞膜内并通过多种途径使铁重新分配和使铁离子中性化[12、13]。2.维持微循环CO能下调HO-1的表达，调节血流量[14]。反之，CO还可通过与NO相似的途径激活鸟苷酸环化酶（sGC），包括血红素与铁的结合和分离。诱导和激活起催化作用GC部位。源自内皮细胞的CO和NO可扩散进入邻近的平滑肌细胞，致细胞内cGMP水平增高[15]，使平滑肌松弛。HO-1可抑制再灌注节段的血管收缩，因而能维持微循环血流[16]。与缺血再灌注损伤或排斥相关的微血管血栓形成常破坏移植物内的微循环[17]。58---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文而在体外和异种心脏移植模型中CO通过cGMP途径抑制了血小板聚集（见图1B）[18]。另外在肺部低氧血症模型中也发现吸入CO能抑制血浆激活抑制因子-1（plasminogenactivatorinhibitor-1），从而减少肺血栓的形成。图116.7细胞循环的调节器官再灌注后凋亡是诱导最初炎症反应的主要原因之一。有证据表明HO-1高度表达或CO刺激能避免或减轻缺血再灌注损伤。低氧血症和高氧血症，慢性排斥和异种排斥中常伴随着凋亡的减少[19]。近来，Brouard等[20]通过内皮细胞培养发现HO-1抗凋亡作用是通过CO调节的有丝分裂原激活的p38介导的蛋白激酶途径。另一方面，时间过长的低氧血症可促使血管重新塑型，表现为血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移，同时沉积在动脉壁上。Duckers等认为无论在体内还是体外，HO-1表达均抑制VSMC生长，导致细胞终止于G1/S阶段，向上调节cyclin激酶抑制物P21。若CO产物的增加或使细胞暴露于外源性CO，均将导致生长反应减弱，伴随E2F-1受抑制，同时将累及c-myc、cyclins和DNA多聚酶基因调节中与细胞循环老化的过程。CO是保守地限制IRI和慢性排斥反应中VSMC的过分增殖[21]。16.8抗炎作用59---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文血红素代谢和HO-1过分表达将直接或间接影响供体对宿主的炎症反应（见图2）。粒细胞浸润是局部炎症的病理表现和移植后免疫反应的中心环节，而血管内皮细胞则起着相反的作用。HO-1系统将通过内皮细胞黏附和趋化因子调节来影响中性粒细胞和单核细胞的迁移。血红素将显著增加血管通透性并促使粒细胞在肝脏、胰腺、小肠和脾脏聚集，这与ICAM-1、P-选择素和纤维蛋白结合素（fibronectin）的上调有关。Vachharajau等[22]观察到HO-1和胆绿素将以内毒素模式改变在肺、肾脏、肝脏和小肠中P-选择素和E-选择素的表达，从而调节粒细胞浸润；而胆绿素也能在体外抑制人体补体的产生和发挥其生理作用[23]，微血管内皮细胞中HO-1过分表达将减轻氧化性损伤和粒细胞黏附[24]。虽然诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）过分表达与急性排斥反应有关[25]，但NO系统在移植病理生理中的作用仍有争议。通过iNOS的下调（iNOS包含微量的血红素-铁），HO-1抑制NO系统；而在血红素代谢过程中所释放的CO并不能激活已存在的iNOS[26]，而释放的铁能进一步下调iNOS转录水平[27]。可以这样认为，在HO-1诱导细胞保护、抵抗肝脏缺血再灌注损伤过程种，下调iNOS表达也是一个重要的步骤。HO-1介导的细胞保护作用可减少粒细胞对心脏、肝脏和肾脏等移植物的浸润，在正常大鼠肝脏缺血再灌注损伤的模型中，HO-1上调能显著改善门静脉血流、胆汁量和减轻肝细胞损伤。冷缺血保存较长的肝脏是否能维持较好的功能与T细胞浸润和激活减少有关，这可能是因为T细胞缺乏或CD154缺乏，导致小鼠HO-1被诱导[28]。移植后粒细胞的迁移也受到各种趋化因子、细胞因子和化学因子的调节，而这些因子来源于单核细胞、内皮细胞和实质细胞。白细胞（LTs）受抑制常导致移植物生存时间延长，这与心脏和肝脏移植物中单核细胞浸润减少有关[29、30]。CO能降低支气管肺泡介质前列腺素E2和LTB4的表达[31]。Minanio等[32]观察到HO-1Tg小鼠在低氧血症时，肺组织中IL-1β、IL-6、单核细胞化学趋向蛋白-1和巨细胞炎症蛋白-2水平明显下降。我们认为用氯化亚甲基治疗大鼠，氯化亚甲基代谢进入CO能改变组织因子表达，而这种组织因子表达使源自Th1型细胞（肿瘤坏死因子-α、干扰60---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文素-γ和白介素-2）转变成Th-2型细胞（IL-4和IL-10）。Otterbein等[33]认为暴露于低浓度（250ppm）的CO可选择性降低脂多糖诱导的前炎性反应细胞因子（肿瘤坏死因子-α、IL-1β和巨细胞炎症蛋白-1），增加体内和体外IL-10表达。令人感兴趣的是，Lee和Chan[34]认为IL-10抗炎症效应依赖于HO-1表达和CO通过有丝分裂原介导的P38激活蛋白激酶途径。因此在抗炎症反应中IL-10和HO-1系统之间有未被阐明的反馈。移植病人中所产生的细胞外游离血红素不仅影响移植物本身，且通过血液循环产生全身性效应（见图2），因此通过HO细胞外血红素降解可阻止移植后继发性淋巴组织中淋巴细胞增殖。事实上，受抑制的T细胞和细胞介导的自然杀伤细胞的细胞毒性可经CoPP预处理而显著下降，CoPP可降低淋巴增殖自身反应和细胞毒T细胞分化。Hashiba等[35]也报道Ad-HO-1基因转换可减轻流感病毒介导的肺损伤，和降低巨噬细胞/中性粒细胞的浸润和游走。图2国外学者观察到抗内皮细胞抗体能激发内皮细胞的保护基因表达，并发现α半乳糖凝聚素与半乳糖表位的结合能够上调几种热休克蛋白的表达，其中就包括HO-1，61---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文而Th2细胞及其细胞因子能促进保护基因的上调，并能抑制抗移植物细胞毒性抗体。Hancock等分析显示：诱导保护基因HO-1阻止同种异体器官移植物的慢性排斥反应。Amersi等应用钴-原卟啉（CoPP）诱导或含HO-1cDNA腺病毒载体转染使HO-1基因过度表达，则可减弱I／R损伤和延长肥胖Zucker大鼠脂肪肝同种异体移植后的存活时间。Vulapalli等通过观测心脏缺血再灌注（I/R）损伤后HO-1能否抗心肌细胞凋亡和预防心肌功能障碍，发现转基因小鼠在缺血后，HO-1的转录物和蛋白质在心脏中显著增加且转基因小鼠的心脏功能恢复较快。Katori等对I／R模型分析亦发现：CoPP诱导HO-1基因上调表达可延长心脏同种异体移植物的存活时间。与对照组相比，抗凋亡蛋白Bcl-2/Bag-1的表达在CoPP组中明显增加，从而进一步证明了HO-1基因的生理性上调表达可延长心机细胞免遭I/R损伤。Soares和Brouard等的分析进一步指出HO-l基因与NF-κB依赖的抗凋亡基因协同作用可防御内皮细胞凋亡，而这一效应取决于HO-1激活p38MAPK信号转导途径的能力，从而抑制炎症前基因的诱导和内皮细胞的激活，有助于防止移植物排斥反应的发生。2002年Wang等分析表明：延迟或相对低水平的XabIgM能激活器官内保护基因的表达，有助于器官的“适应”。尽管HO-1具体的作用机制不甚明确，但分析显示HO-1与器官的适应密切相关，并在移植排斥反应中起重要作用。5.抗细胞凋HO-1抗细胞凋亡主要表现在三方面：①HO-1抗氧化及炎症作用。②胆红素作为强效抗氧化剂发挥抗细胞凋亡作用。Fang等[36]将高表达HO-1的鼠肝癌AH136B细胞与HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)共同孵育后发现AH136B细胞凋亡显著增加，而将其与胆红素及ZnPP一同孵育凋亡则明显减少。③CO具抗细胞凋亡作用。Liu等[37]证实在血管平滑肌细胞内CO可激活可溶性鸟苷酸环化酶而阻止细胞凋亡，且CO对可溶性鸟苷酸环化酶的活化作用强于NO。线粒体细胞色素C是诱导细胞凋亡的重要成分，CO也可通过抑制该物质的活性而发挥作用。④HO-1通过抑制Fas等凋亡基因表达来减少细胞凋亡。此外，Inguaggiato等[38]发现过度表达HO-1可上调P21而抑制细胞凋亡。HO-1系统介导的细胞保护作用对移植物功能和宿主全身免疫反应均有益。因此62---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文HO-1系统在新的脏器移植中扮演重要的角色。通过借鉴HO-1在肝、肾等器官移植中的细胞保护作用、HO-1的生物学功能及其发挥功能的具体机制，大胆将其运用于胰岛细胞移植领域以提高胰岛细胞移植的成功率是有科学依据的。虽然当前此类研究还不够多也不够深，但已有学者通过实验分析证实HO-1及其催化作用的产物在胰岛细胞移植中发挥着积极作用。Pileggi等[39]在分析β细胞株及分离纯化后的大鼠胰岛细胞在体外被CoPP诱导后过表达HO-1与胰岛细胞凋亡及大鼠胰岛细胞同种异体移植后功能间的关系时发现过表达的HO-1在大鼠体外能显著抑制由前炎症因子介导的细胞凋亡，并能明显改善移植入大鼠体内的胰岛细胞功能。Günther等[40]发现HO-1催化作用的产物CO对β细胞具有保护作用，并能明显延缓其发生凋亡。且此保护作用是通过鸟苷酸环化酶活化、环磷鸟苷(cGMP)产生及cGMP依赖性蛋白激酶激活而完成的。此外，Günther还观察了小鼠同种异体胰岛细胞移植后移植物的功能，结果显示术前移植物CO暴露组小鼠的胰岛细胞功能显著优于未暴露组。Wang等[41]在同种异体小鼠胰岛细胞移植前将CO引入实验组供体体内，而对照组供体内则不引入CO，并在移植后观察移植物存活情况。结果发现实验组受体移植物存活时间明显长于对照组。而且实验组小鼠体内诸多前炎症因子及凋亡基因表达明显减少，其中包括TNF-α、iNOS、颗粒酶B及Fas/FasL等。他们还证实在小鼠胰岛细胞移植前供体体内引入胆红素也被证实能有效延长移植物的存活期,且与胆红素的抗炎、抗氧化作用有关[42]。可见，将HO-1运用于胰岛细胞移植的设想勿庸置疑。且能有效地解决胰岛细胞移植后生存期短的不足，从而提高移植的成功率。总结全文，当今胰岛细胞移植虽有所成功但影响其疗效的因素不少，如缺血再灌注损伤、免疫排斥及细胞凋亡等。然而，随着HO-1在器官移植中的作用不断被阐明，HO-1在胰岛细胞移植中的价值随之显现。但现今针对HO-1的分子结构、催化反应机制、调控系统、三个降解产物之间的相互作用及HO-1对胰岛细胞保护作用的分析甚少，尚有待进一步探索。相信随着分析的不断深入，HO-1必将在胰岛细胞移植中发挥日益重要的作用。63---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文参考文献16.7CamaraNO,SoaresMP.Hemeoxygenase-1(HO-1),aprotectivegenethatpreventschronicgraftdysfunction.Jfreeradbiomed,2005,38:426-435.16.8RedaelliCA,TianYH,SchaffnerT,etal.Extendedpreservationofratlivergraftbyinductionofhemeoxygenase-1.Hepatology,2002,35:1082-1092.16.9SoaresMP,BrouardS,SmithRN,etal.Hemeoxygenase-1,aprotectivegenethatpreventstherejectionoftransplantedorgans.ImmolRev,2001,184:275-285.16.10NathKA,VercellottiGM,GrandeJP,etal.Hemeprotein-inducedchronicrenalinflammation:suppressiveeffectofinducedhemeoxygenase-1.KidneyInt,2001,59:106-117.16.11KatoH,AmersiF,BuelowR,etal.Hemeoxygenase-1overexpressionprotectsratliversfromischemia/reperfusioninjurywithextendedcoldpreservation.AmJTransplant,2001,1:121-128.16.12KatoriM,BuelowR,KeB,etal.Hemeoxygenase1overexpressionprotectsratheartsfromcoldischemia/reperfusioninjuryviaantiapoptoticpathway.Transplantation,2002,73:287-292.16.13YoneyaR,NagashimaY,SakakiK,etal.Hemolysatepretreatmentamelioratesischemicacuterenalinjuryinrats.Nephron,2002,92:407-413.16.14TulliusSG,Nieminen-KelhaM,BuelowR,etal.Inhibitionofischemia/reperfusioninjuryandchronicgraftdeteriorationbyasingle-donortreatmentwith---- 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-------上海交通大学医学院硕士学位论文致谢在本论文完成之际，衷心感谢我的导师周光文教授对我的悉心关怀和教导。从课题选题、设计、实施到论文撰写，无不浸透着导师大量的心血。三年中，您不仅在科研工作中给我指明方向，而且在生活上也给予我无微不至的关心和关怀。能拜于您的门下是我求学生涯最大的幸运，导师豁达的胸襟、科学严谨的治学精神、精深广博的知识、敏捷的思维、精湛的医术都为我树立了做人治学的典范，将使我铭记在心、受益终身。在此，学生衷心向您道一声：导师，谢谢您！衷心感谢师母陈曦教授，是您给我们创造了非常温馨的实验室学习环境。工作中，您的孜孜不倦是对我们无声的鞭策，您的谆谆教导使我们备受鼓舞；从来没有听到您的喝斥，即使我们犯了错误，有的只是平和的微笑，睿智的目光，鼓励的眼神，耐心的教导。对我，您是亦师亦友，发自内心的对师长的尊敬，还有一种真挚的友情。衷心感谢顾卫琼、孙成林、顾元骏老师，时常想起一起做实验的时光，多么美好的回忆，您们对我的关心和帮助，我永远不会忘记。衷心感谢王琳师兄，苏畅同学，时间飞快，我们在一起三年美好的时光马上结束了，你们宽广的胸怀，乐于助人的精神，严谨的科研态度，刻苦的实验精神，以及我们之间的那种兄弟般的友情让我铭记心中。衷心感谢戴蒙老师。您为我们的实验室提供了巨大的便利。因为有了您井井有条的管理，我们才得以方便、快捷的开展实验。衷心感谢山爱景、姜苏原、崔斌、姜晓华、徐敏等同事在这三年中对我的友爱相助。我们是一个如此融洽的集体。当我们的实验室充溢着热火朝天的干劲，五颜六色的鲜花，开心爽朗的笑声时，我们的集体又是如此的富有和充满生机。衷心感谢杨卫平、申川、严佶祺等所有临床科室老师，您们渊博的临床知识，是我努力的方向。在课题进行过程中，得到了内分泌分析所所有老师的大力支持和帮助，在此深69---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文表感谢。感谢科研发展处夏振炜处长及徐勤毅老师的关心与指导。衷心感谢我的父母，是您们一直默默的支持鼓励我求学，无论在生活还是在学习中对我无微不至的关怀让我感到您们作为父母的用心。您们的谆谆教导以及对我的培养使我终身受益，您们不但让我学会了作人的道理，也让我学会了怎样成为了一个出色的人。衷心感谢我的女友卞陆琴，是你一直鼓励我克服困难，努力工作。我们互相鼓励，你温柔的性格包容了我急躁的脾气，从大学开始我们一起求学，孤独时，你是我最好的听众；困苦时，是你鼓励我努力上进；欢乐时，是你和我一起分享品尝；以后的风风雨雨，让我们携起手来，继续勇敢面对。衷心感谢我的挚友刘日钲、俞杨俊、熊湘江、韩睿、朱立。是你们一直鼓励支持我完成硕士阶段的学习，虽然我们已相识10年之久，但我们的友谊、友情以及亲情将会持续永远。你们给我的包容、帮助、以及学习的便利使我永生难忘。最后感谢上海交通大学医学院给我提供了继续求学的机会；感谢瑞金医院良好的科研环境和技术平台，使我受益匪浅。2008年4月70---- -------上海交通大学医学院硕士学位论文发表论文16.7张正筠,周光文。细胞因子在肝细胞肝癌侵袭转移中的分析进展。外科理论与实践,2006,11(5):457-460.16.8张正筠,周光文。无功能性胰腺内分泌肿瘤外科诊治的分析进展。国际外科学杂志,2007,34(8)：556-558.16.9张正筠,周光文,申川,等。肝移植治疗胰腺生长抑素瘤肝转移一例。中华外科杂志,2007,45(15):1075-1076.16.10ZhangZY,WangL,ShenC,etal.Thediagnosisandtreatmentofpancreaticsomatostatinoma.ChineseMedicalJournal.（待发表）16.11张正筠，陈曦，苏畅，等。血红素氧化酶-1保护异种胰岛移植物及机制分析.外科理论与实践.（待发表）16.12张正筠，陈曦，苏畅，等。血红素氧化酶-1对异种胰岛移植物的保护作用.中华实验外科杂志.（已接受）16.13张正筠，陈曦，苏畅，等。血红素氧化酶-1的适度表达对异种胰岛移植物的保护作用.中华器官移植杂志.（已接受）16.14苏畅，张正筠，陈曦，等。大鼠胰岛分离、纯化技术改良。外科理论与实践,2007,12(5):460-463.71----