应用胰岛新生相关蛋白（ingap）体外诱导胰岛新生

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南京医科大学硕士学位论文中英文缩写对照表INGAPIsletneogenesisassociatedprotein胰岛新生相关蛋白ILCsIslet—likecellclusters胰岛样细胞团CKl9cytokera恤19细胞角蛋白19PDX．1PancreaticduodenalTGF-131EGFbFGFhomeodomain-containingprotein1Transforminggrowthfactor-131Epidermalgrowthfactor胰腺十二指肠同源盒1转化生长因子p1表皮生长因子Basicfibroblastgrowthfactor碱性成纤维细胞生长因子FBSFetalbovineserumBSABovineserumalbuminDTZDithizoneFITCFluoresceinisothiacyanateELISAGSIS胎牛血清牛血清白蛋白双硫腙异硫氰酸荧光素Enzyme—linkedimmunoabsorbent酶联免疫吸附测定assayGlucosestimulatedinsulinsecretion葡萄糖刺激的胰岛素释放STZStreptozotocin3试验链脲菌素 南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明本论文座题遮鱼堑生担差蛋鱼(丛鱼△里)佳处透昱遮垒堑生是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专业：内匆冷疑心嘛者签名：叩氯吻参日期：!墨：!兰!!论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：堡：堕刷币签日期：塑!星：!坌：7 南京医科大学硕士学位论文应用胰岛新生相关蛋白(INGAP)体外诱导胰岛新生中文摘要第一部分大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养和鉴定目的建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法。方法V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织，并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织，然后培养于含10％胎牛血清的RPMll640培养液，而后加入EGF(表皮生长因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)继续培养，7天可形成单层细胞，用0．25％胰酶．EDTA消化并传代培养。取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CKl9、Pdx．1、Nestin、insulin及glucagon的表达。结果经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮，再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织，可使胰腺导管细胞得到较好的纯化。免疫荧光结果示胰腺导管细胞CKl9、Pdx．1和Nestin染色呈阳性，阳性细胞率分别为(88．6±6．2)％，(84．6±8．6)％，(79．3±10．5)％，而insulin及glucagon染色为阴性。RT-PCR结果显示该细胞表达CKl9、Pdx一1和Nestin基因。结论该方法可较好的分离出胰腺导管细胞，经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性。关键词胰腺；导管细胞；干细胞；细胞培养4 南京医科大学硕士学位论文第二部分应用INGAP体外诱导胰腺导管干细胞向胰岛D细胞分化目的建立体外诱导胰腺干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，应用胰岛新生相关蛋白(INGAP)建立新的诱导分化体系，实现体外胰岛新生。方法体外分离培养SD大鼠胰腺导管干细胞，选取第2～6代干细胞进行分步诱导分化，并于分化后期进行分组培养，INGAP组加入INGAP多肽，而对照多肽组加入对照多肽，诱导结束后收获两组新生类胰岛样细胞团(ILCs)分别行免疫荧光染色和RT-PCR检测insulin和glugagon的表达，并通过葡萄糖刺激的胰岛素释放试验(GSIS)评价新生ILCs的胰岛素分泌能力。结果第2～6代胰腺导管干细胞经过体外四步诱导分化，INGAP组和对照多肽组均可形成ILCs，免疫荧光染色结果显示ILCsinsulin牙口glucagon染色均为阳性，RT-PCR检测结果也证明INGAP组和对照多肽组ILCs均有insulin和glucagon基因的表达，其中insulin基因的相对表达量INGAP组为0．324±O．09，对照多肽组为o．102士O．04，两组比较差异有统计学意义(P胰岛内>胰岛外，提示Pdx．1和INGAP在胰岛新生中有同等重要作用。DelZotto等【8】报道，INGAP阳性细胞群主要位于胰岛周围，同时表达细胞角蛋白(CK)，后者是胰腺导管细胞的标志，在胰岛新生过程中观察到胰腺INGAP阳性细胞群明显增加，提示INGAP可能是胰腺导管多能干细胞诱导分化胰岛前体细胞过程中所必需。而以往的胰腺导管上皮细胞体外诱导分化体系中，只注意到Pdx．1表达是不可缺少的，并没有考虑到INGAP可能所起的关键作用，对于分化效率低和新生细胞增殖率低的问题一直没能解决。因此我们提出假设，目前体外诱导分化体系中忽略了INGAP的作用，其表达量不足可能是导致诱导分化效率偏低的原因，因此我们拟设计引入INGAP建立新的诱导分化体系，以希增加诱导分化率和分化后细胞增殖率，从而为解决胰岛移植来源问题提供新的途径。参考文献1ShapiroAM，LakeyJR，RyanEA，eta1．Islettransplantationinseven 南京医科大学硕士学位论文patientswithtype1diabetesmellimsusingaglucocorticoid—freeimmunosuppressiveregimen．NEnglJMed，2000，343：230-238．2AtoufF，ChoiY，FowlerMJ，eta1．Generationofislet-likehormone—producingcellsinvitrofromadulthumanpancreas．CellTransplant，2005，14：735—748．3Bonner—WeirS，TanejaM，WeirGC，eta1．Invitrocultivationofhumanisletsfromexpandedductaltissue．ProcNatlAcadSciUSA，2000，97：7999—8004．4BaeyensL，DeBreuckS，LardonJ，eta1．Invitrogenerationofinsulin—producingbetacellsfromadultexocrinepancreaticcells．Diabetologia，2005，48：49—57．5ZulewskiH，AbrahamEJ，GerlachMJ，eta1．Multipotentialnestin—positivestemcellsisolatedfromadultpancreaticisletsdifferentiateexvivointopancreaticendocrine，exocrine，andhepaticphenotypes．Diabetes，2001，50：521—533．6RosenbergL，VinikAI，PittengerGL，eta1．Islet-cellregenerationinthediabetichamsterpancreaswithrestorationofnormoglycaemiacanbeinducedbyalocalgrowthfactor(s)．Diabetologia，1996，39：256—262．7GagliardinoJJ，DelZottoH，MassaL，eta1．PancreaticduodenNhomeobox··1andisletneogenesis·-associatedprotein：apossiblecombinedmarkerofactivateablepancreaticcellprecursors．JEndocrinol，2003，177：249-259． 南京医科大学硕士学位论文8DelZottoH，MassaL，RafaeloffReta1．Possiblerelationshipbetweenchangesinisletneogenesisandisletneogenesis-associatedprotein-positivecellmassinducedbysucroseadministrationtonormalhamsters．JEndocrinol，2000，165：725-733．14 南京医科大学硕士学位论文第一部分大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养和鉴定目前胰岛移植的一大障碍是胰岛来源的匮乏，许多研究表明，无论任何种属，体外培养其胰岛收获率均有限，远远不能满足移植的需求，因此，寻找可供替代的其他来源的D细胞已成为研究的焦点，尤其是对于胰腺内存在的干／前体细胞的鉴定。Seaberg等‘11认为胰腺干细胞不仅存在于胰腺导管，也存在于胰岛本身，因为二者都可以独立的作为前体细胞的来源。成体胰腺的导管上皮细胞作为胰腺前体细胞已得到证实，并且已分别从小鼠和人导管获得胰岛样结构【2刁】。但目前研究对于胰腺导管干细胞的分离、培养方法还不甚成熟。本文以SD大鼠作为实验对象，成功分离并培养出胰腺导管干细胞，对其鉴定该细胞具有胰腺干细胞的特性。材料与方法一、材料1．实验动物SD大鼠，清洁级，8～9N龄，200～2509，雌雄不限，购自江苏省实验动物中心。2．实验材料与主要试剂25cm2细胞培养瓶、96qL板(德国Greiner公司)，p一巯基乙醇、V型胶原酶、小鼠抗大鼠CKl9单抗、insulin单抗、glucagon单抗(美国Sigma&'-司)，兔抗KPDX—l多抗(美国Chemicon／娴)，兔抗大鼠Nestin单抗(美国SantaCruz&)，羊抗小鼠、羊抗兔FITC荧光抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，RT-PCR 南京医科大学硕士学位论文试剂盒(美国Promeg讼司)，RPMll640、胎牛血清、青霉素．链霉素、丙酮酸钠、0．25％胰酶．EDTA(美I訇Gibco公司)，EGF、bFGF(美国InvitrogenJAX-司)，HEPES(美国Amesco公司)，BSA(美Roche讼X-司)，大鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)。3．实验设备生物安全柜(美国SterilGARD公司)，C02培养箱、．800C深低温冰箱(美国Thermo公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，低温离心机(德国eppendorf公司)、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统(美国BIORAD公司)，荧光倒置显微镜Axiovert200(德国Ziess公司)。二、方法1．胰腺导管干细胞的体外分离(1)麻醉SD大鼠3只，称重并计算麻醉剂的剂量，用1％戊巴比妥钠腹腔麻醉(O．3～O．5ml／1009)。(2)固定、术区消毒将麻醉好的SD大鼠腹部朝上，四肢和头部固定于手术板(酒精擦拭手术板)，碘伏和酒精消毒腹部。(3)j但-总管穿刺选正中切口，依次切开皮肤、肌肉层乖腹膜层，将肝脏向上翻起充分暴露胰腺和胆总管，钳夹胰管末端，用1号丝线结扎侧支胆管，5号半头皮针(针体弯折90。)穿刺入胆总管，丝线结扎固定。(4)胆总管逆行灌注胶原酶破心放血处死大鼠，灌注预冷的胶原酶溶液(0．5mg／m1)10ml左右，直至整个胰腺充分膨胀，包括胰尾部。(5)分离胰腺依次将胰腺从小肠、盲肠、胃分离，用眼科镊将肠提 南京医科大学硕士学位论文起，逐段将胰腺从肠分离下来，再从胃分离胰腺，提起脾并将胰腺从肠系膜切除，完整摘取胰腺，拎起与胰腺相连的脾，将胰腺放入含5ml胶原酶溶液的50ml离心管内，同时切去脾。(3只胰腺放同一离心管)(6)消化将分离胰腺立即置38。C水浴静止消化约10min，取出置于冰浴中用眼科镊轻轻撕碎胰腺(很容易撕碎表示已达到消化的要求)。用手腕的力量用力振荡或用漩涡混合器振荡15s使其呈细沙状。(7)终止消化向离心管内加含10％FBS的冷Hank、S30ml(FBS3m1)，置冰上沉降5min。(8)过筛网将漏斗放一新50ml离心管上，并将40目不锈钢筛网置于其上，过滤，去除淋巴结、肠系膜等组织。1000rpm4。C离心2min，弃去上清，沉淀加4。CHank、S洗涤，同法离心洗涤，弃上清。(9)Ficoll密度梯度离心沉淀加15ml大鼠淋巴细胞分离液(密度为1．083)，其上沿管壁缓慢加入等体积(15m1)Hank、s，2000rpm4℃离心20分钟．可见管内分上中下底四层。(10)接种将中间云雾状胰岛层用吸管吸去，上下层移入新管离心，1000rpm4"C离心2min，弃去上清，沉淀加基础液，重悬，接种至25cm2细胞培养瓶，37"C5％C02培养。2．胰腺导管干细胞的培养胰腺导管细胞分离后接种于25cm2细胞培养瓶，37。C5％C02培养，4天后待导管细胞聚集物长出，改用含10％FCS，100U青霉素．链霉素，20ng／mlEGF、bFGF，10mmol／1HEPES，lmmol／1丙酮酸钠，17 南京医科大学硕士学位论文71．5}tmol／1D一巯基乙醇的扩增RPMll640培养基继续培养，3天换液1次。原代培养的胰腺导管细胞用0．25％胰酶一EDTA消化并按1：2传代，以后按1：3～1：4传代培养。3．免疫荧光细胞化学染色选取第2代胰腺导管细胞以1×105／孔铺96孔板，待细胞融合达80％，进行免疫荧光染色。(1)吸去各孔培养液，PBS冲洗3次，每次5min；(2)固定以4％多聚甲醛溶液固定10～15min，用PBS冲洗3次，每次5min；(3)加0．3％TritonX．100，室温放置15min，PBS冲洗3次，每次5min；(4)封闭加5％牛血清白蛋白(BSA)，放湿盒内37。C封闭30min；(5)加一抗各孔滴加稀释的一抗(PBS稀释)，放4。C冰箱过夜，PBS冲洗3次，每次5min；(6)加二抗滴加适当的荧光标记的二抗，放湿盒中，370C避光孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min。(7)观察荧光倒置显微镜观察并拍照。注：空白对照组以PBS替代一抗，其余条件与上述相同。各一抗浓度以及所用二抗浓度如(表1—1)所示。荧光染色阳性细胞计数：借鉴张中明掣钾计算病毒转染率的方法分别计算CKl9、PDX．1和Nestin染色阳性的细胞数以及阳性细胞率。18 南京医科大学硕士学位论文表1．1免疫荧光染色所用抗体及浓度4．RT-PCR检测胰腺导管干细胞基因的表达4．1Trizol法提取细胞总RNA(1)取融合达90％的胰腺导管干细胞1瓶，吸去旧培养液，PBS冲洗3遍；(2)加lmlTrizol，反复吹打后将细胞混悬液转移至新的1．5mlEP管，室温静置5min；(3)加入1／5体积(约200u1)体积的氯仿，旋涡混合器振荡15s，室温静置5min；(4)4℃12000rpm离心15min，小心转移上层水相(约400-500u1)于另一新1．5mlEP管中；(5)加入等体积的异丙醇(约400．500u1)，混匀后置．20。Clh(或常温静置10min)；(6)4℃12000rpm离心10min，弃上清；(7)沉淀加lml冰预冷的75％乙醇(用高压后的DEPC水配)；(8)4。C7500rpm离心5min，小心弃上清，置超净工作台开风机干燥19 南京医科大学硕士学位论文5-10min；(9)v：Z20ulDEPC水溶解。紫外分光光度计比色测定提取的总RNA浓度，要求A260／A280比值在1．8—2．0之间。4．2反转录一合成cDNA第一链(1)将相当于llag总RNA的量牙口1．2kb卡那霉素阳性对,N,,RNAh口o．5ml凄j心管中并于70℃温育10min，短暂离心后置于冰上。(2)依照所列顺序加入以下试剂，反应体系为20卜tl。(依据RNA的量，反应体积可以增减)：试剂使用量MgCl2(25mM)反转录10xBufferdNTP混合物(10mM)重组的RNasin⑧核糖核酸酶抑制剂AMV反转录酶(高浓度)Oligo(dT)15引物或随机引物阳性对照RNA／总RNA(1ug)RNaseFreeH20总体积4p．12pl2“lO．5pllul2ul21al6．5ul20}tl(3)按以下条件合成cDNA第一链20 南京医科大学硕士学位论文温度时间42℃95℃5℃50min5minCKl9PDX一1NestininsulinglucagonD．actin上游引物579acctgcgtcccttatccct37258下游引物57accgcgtcctccgacatagc37上游引物5799tgccagagttcagtgctaa37249下游引物57ccagtctcggttccattc93，【5】上游引物579cggggcggtgcgtgactac37524TN-ijI物57aggcaagggggaagagaaggatgt3，【6】上游引物57ccaatgagcactttctgcagaccta37321TN-2；l物tagtcagggttgaggctagcaa37上游引物57atcttcacaacatctcctgcca937279TN-i；1物57taatccaggtgtcgtgactgcgat37上游引物57ccaaggccaaccgcgagaagatga37587TN-i；1物57agggtacatggtggtgccgccaga374．32PCR扩增 南京医科大学硕士学位论文(1)无核酸酶gqT?-将第一链cDNA合成反应的体积稀释到100pl。(2)依次加入以下试剂，反应体系为50“l试剂使用量dNTP混合物(10mM)MgCl225raM反转录10xBuffer上游引物(10mM)下游引物(10mM)TaqDNA聚合酶模板cDNARNaseFreeH20总体积O．9p13．75pl4．9“l2．5pl2．5肛l0．25p11O肛l25．2ul50“l(3)按以下条件扩增目的DNA温度时间94℃40～61℃72℃3min30slmin5min30个循环，4。C保温注：其中Nestin、D—actin退火温度为56。C，PDX一1退火温度为40℃，insulin退火温度为52。C，其余为61℃。 南京医科大学硕士学位论文4．33电泳及图像扫描(1)制胶琼脂糖O．459溶于30mlO．5×TBE(1．5％琼脂糖凝胶)，微波炉加热至完全溶解，冷却至60"C以下，倒入已封好并插上梳子的模具内，室温放置30～45min，小心拔出梳子，轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放倒电泳槽内，加样。(2)加样样品：5pl样Yr,DNA+1p1LoadingBuffer混匀后依次加入孔中Marker：llalMarker+1“lLoadingBuffer+4“lTBE混匀于塑料膜上，加入孔中。(3)电泳关上电泳槽盖，接好正负电极插头，设置电压：80V，时间：35min。(4)观察结果在凝胶成像系统上扫描并拍照。三、统计学处理所有计量资料均以均数±标准差(_±s)表示。结果一、胰腺导管干细胞的分离、纯化胆总管原位逆行插管缓慢灌注V型胶原酶后，可观察到整个胰腺逐渐膨胀，呈胶冻状(图1—1)。经过密度梯度离心后，可观察到中间云雾状的胰岛层，将此层弃去，其余各层上清离心后于管底可见一沉淀，即为较纯的胰腺导管上皮细胞。 南京医科人学硕}：学位论文图卜1V型胶原酶溶液灌注膨胀充分的胰腺二、胰腺导管干细胞的培养去除了胰岛的胰腺组织用含10％胎牛血清的RPMll640培养液培养4天，可见导管细胞聚集物长出，呈贴壁状态，但形态不均，呈多形性，改用添加了EGF、bFGF的1640培养基培养，细胞扩增速度较前明显加快，形态均一，呈长梭形，细胞之间相互连接，l周左右可形成单层细胞(图l一2)，用0．25％胰酶一EDTA消化并传代，培养条件同前，此后约7天可传1代。本实验室条件下原代培养细胞连续传至第6代仍可保持干细胞特性。AB图1—2胰腺导管干细胞倒置显微镜下形态观察(×200)24≯＼ 南京医科人学硕lj学位论义A：接种第3天胰腺导管干细胞形态；B：接种第7天胰腺导管干细胞形态免疫荧光染色结果取第2代胰腺导管细胞行CKl9、PDX一1、Nestin染色均呈阳性，细胞阳性率分别为(88．6±6．2)％，(84．6±8．6)％，(79．3±10．5)％，而insulin及glucagon染色为阴性(图1—3)ACB图1—3胰腺导管干细胞的免疫荧光染色(FITC．绿色，x100)A：CKI9染色阳性细胞；B：PDX一1染色阳性细胞；C：Nestin染色阳性细胞四、RT-PCR结果RT-PCR结果示第2代胰腺导管细胞表达CKl9、PDX一1和Nestin25 图1-4CKl9、PDX一1、Nestin、insulin及glucagon基因的表达M：DNAmarker；1：CKl9；2：PDX一1；3：Nestin；4：insulin；5：glucagon；6：6一actin讨论本实验借鉴胰岛的分离纯化方法对成年大鼠的胰腺导管上皮细胞的分离纯化进行了探索，并对培养出的导管干细胞进行了鉴定，证实所培养细胞具有干细胞的特性。胰腺导管干细胞的分离主要有两种方法，一种是将大鼠胰腺直接摘取后剪切消化，但这种方法对胰腺组织损伤比较大，所得导管细胞量很少，故目前更多的是采用从胆总管向胰腺内灌注胶原酶再进行消化的方法，该方法使胰腺组织与胶原酶充分接触，可更好的消化胰腺结缔组织，分离出更多的导管细胞。实验中我们发现，良好的灌注是胰腺能够得到较好消化的前提。所谓良好的灌注我们的体会是灌注胶原酶时要使整个胰腺包括胰尾部都得到充分均匀的充盈。为了得到较纯的导管细胞，消化后还需进行纯化，如果不对胰腺，6 南京医科大学硕上学位论文组织进行纯化，所培养细胞将混杂有少量胰岛，这将对结果产生影响。对于导管细胞的纯化，本实验借鉴了纯化胰岛的方法(包括连续和不连续密度梯度离心)，不同的是胰岛纯化最后要的是胰岛层，而我们的目的是分离出胰岛层从而更好的剔除之，最终得到较纯的导管。不连续密度梯度离心是从不同密度界面层收集胰岛，如MoriniS掣7】的研究是用1．039，1．096，1．108这三个密度将胰岛集中起来，可得到较纯的胰岛，但需要配制不同密度的分离液，较复杂。另外，根据Bonner-Weir等【31的研究，经密度梯度离心后，几乎全部胰岛和大量的导管组织主要集中于所分离的两个密度层面，管底沉淀主要是腺组织。本实验采用单一密度的分离液，即用一个密度来集中收集胰岛，而将其剔除，再收集剩余上清，离心后得到的即是较多的导管组织。此外，本实验也对纯化时用的分离液进行了比较，一个是人的淋巴细胞分离液，密度为1．077，另一个是大鼠的淋巴细胞分离液，密度是1．083。二者经密度梯度离心后，所得胰岛层后者明显比前者厚，说明后者分离效果更好。将经二者分离纯化的细胞接种3天后观察，贴壁细胞簇后者约为前者的10倍(数据未提供)。此外，本实验还对贴壁3天的细胞进行了DTZ(双硫腙)染色，没有细胞着色，说明贴壁细胞并没有混杂胰岛。去除胰岛的组织重悬于含10％胎牛血清的RPMll640培养液，在导管细胞贴壁前，残余的胰岛组织因悬浮不贴壁，可经换液除去。在原代培养第4～5天，可观察到导管细胞长出，贴壁状，并且我们发现导管细胞呈集落样生长(图1-2A)，形态似鹅卵石样，但不均一。 南京医科大学硕士学位论文第5天，将细胞用0．25％胰酶一EDTA消化重新接种，并改用添加了EGF、bFGF的扩增培养基培养，细胞迅速增多，形态变为均一的长梭形(图1—2B)，一周即可形成连续单层。此后约7天可传1代。第2代以后细胞可达到稳定增殖。目前研究还未能完全确定胰腺导管干细胞的标志物，并且缺乏成熟的检测手段，可以作为胰腺干细胞表面标志的主要有CKl9、PDX．1和Nestin。近年研究表明，胰岛细胞的形成来源于具有导管样的前体细胞团，其从具有导管的胰岛细胞胚芽产生【8】o而且，在胰岛膨胀分离后有大量的导管样组织存在，这些潜在的CKl9阳性细胞在合适的外界刺激因素作用下可转分化为胰岛细胞，而导管组织覆盖的细胞基质有助于其向新的胰岛细胞分化【9】。因此，CKl9被认为是胰腺导管上皮细胞向干细胞转化的标志。PDX一1是一个表达于早期胰腺发育、胰岛细胞分化和D细胞成熟过程中的一个转录因子【10】。其在调节胰岛素基因的表达上也是至关重要的，所EZPDX．1可能在导管干细胞向p细胞分化中起作用。r而Nestin最初在鉴定神经干细胞方面具有特异性，但后来发现Nestin阳性细胞也可作为胰腺干细胞，在向p细胞分化时也起到重要作用。因此，本实验主要对这三个主要的胰腺干细胞表面标志物进行了鉴定。SeebergerKL等【111研究证实在原代导管细胞聚集物中舍有81．3±9．6％的CKl9阳性细胞，随后该表面标志的表达逐渐减少，到第5代检N']和]CKl9的表达。本实验对特性稳定的第2代导管细胞进行了免疫荧光检测，CKl9、PDX一1、Nestin的细胞阳性率都在大约80％一90％，说明该细胞可以表达胰腺干细胞的表面标志，从 南京医科大学硕士学位论文RT—PCR结果看，在基因水平也有CKl9、PDX一1、Nestin的表达。有趣的是，无论是免疫荧光还是IH．PCR结果，我们均发现Nestin的表达均I：hCKl9或PDX．1的表达弱，推测原因可能有二：一是Nestin虽然存在于大鼠和人的胰岛和胰腺导管，但主要在胰岛中表达，二是在大鼠胚胎发育11天时Nestin开始在神经管中表达，胚胎16天在大脑皮层达到高峰，成年NNestin的表达逐渐下降并局限于特定部位【12】。倪雪峰等【13l对胚胎、新生及成年大鼠胰腺峙'Nestin的表达做了研究，也证实了随大鼠胰腺的生长发育，胰岛Nestin阳性细胞数呈下降趋势。综上所述，本实验通过两种方法即免疫荧光和RT-PCR同时证实所培养的细胞均有这三种表面标志的表达，说明该细胞即是胰腺干细胞。此外，为了排除培养细胞混杂胰岛，我们应用了抗insulin和glucagon的抗体进行免疫荧光检测，结果染色呈阴性。相同的，我们也设计了大鼠insulin和glucagonN引物进行了RT-PcR的检测，二者也没有相应条带出现，说明该贴壁细胞未混杂胰岛，是较纯的导管上皮细胞。由于胰腺干细胞主要来源于胰腺导管，少量存在于胰岛本身，因此成功分离胰腺导管上皮细胞就可获得大量的具有分化潜能的干细胞。本实验通过借鉴胰岛分离纯化方案从而分离出较纯的胰腺导管上皮细胞，并在体外进行培养，经鉴定该细胞具有胰腺干细胞的特征，这将为以后诱导胰腺干细胞向胰岛p细胞分化以及提高诱导分化率奠定基础。 南京医科大学硕士学位论文参考文献SeabergRM，SmuklerSR，KiefferTJ，eta1．Clonalidentificationofmultipotentprecursorsfromadultmousepancreas豳afgenerateneuralandpancreaticlineages．NatBiotechnol，2004，22：115—1124．2RamiyaVK，MaraistM，ArforsKE，eta1．Reversalofinsulin—dependentdiabetesusingisletsgeneratedinvitrofrompancreaticstemcells．NatMed，2000，6：278—282．3Bonner—WeirS，TanejaM，WeirGC，eta1．Invitrocultivationof45humanisletsfromexpandedductaltissue．ProcNatlAcadSciUSA，2000，97：7999—8004．张中明，姜波，董红燕，等．低氧反应元件对低氧复氧状态下心肌细胞转染人血管内皮生长因子165基因表达的调控作用．中华实验外科杂志，2005，22：1510—1512．武晓泓，刘翠萍，茅晓东，等．大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞的潜能．中国临床康复，2005，9：1—3．6ZulewskiH，AbrahamEJ，GerlachMJ，eta1．Multipotentialnestin—positivestemcellsisolatedfromadultpancreaticisletsdifferentiateexvivointopancreaticendocrine，exocrine，andhepaticphenotypes．Diabetes，2001，50：521-533．7MoriniS，BraunM，OnoriP，eta1．Morphologicalchangesofisolatedratpancreaticislets：astructural，ultrastmcturaland30 南京医科大学硕士学位论文morphometricstudy．JAnat，2006，209：381—392．8BouwensL．Isletmorphogenesisandstemcellmarkers．CellBiochemBiophys，2004，40：81-88．9Bonner．WeirS．Stemcellsindiabetes：whathasbeenachieved．HormRes，2003，60Suppl3：10．10CerfME．Transcriptionfactorsregulatingbeta-cellfunction．EurJEndocrinol，2006，155：671—679．1SeebergerKL，DufourJM，ShapiroAM，eta1．Expansionofmesenchymalstemcellsfromhumanpancreaticductalepithelium．LabInvest，2006，86：141-153．12LendahlU，ZimmermanLB，McKayRD．CNSstemcellsexpressanewclassofintermediatefilamentprotein．Cell，1990，60：585—595．13倪雪峰，彭韬，程志祥，等．巢蛋白和胰岛素在大鼠胰腺不同发育阶段的表达．南京医科大学学报(自然科学版)，2004，24：97—99．31 南京医科大学硕士学位论文第二部分应用INGAP体外诱导胰腺导管干细胞向胰岛13细胞分化胰岛新生相关蛋白(INGAP)属于再生蛋白RegIII的家族成员。INGAP基因主要在正常地鼠、小鼠和人类的导管和腺泡中表达，而胰岛中也有部分表达[1，21。近来，研究证实INGAP与胰岛新生关系密切，INGAP不仅具有诱导胰岛新生，刺激p细胞增生的作用，还可以逆转糖尿病的高血糖状态[3】，因此INGAP极有可能成为临床治疗糖尿病的又一新的策略。本文即对在体外应用INGAP诱导胰腺干细胞分化为胰岛素分泌细胞进行了相关研究。材料与方法一、实验动物清洁级SD大鼠，8～9周龄，200～2509，雌雄不限，购自江苏省实验动物中心和南京中医药大学实验动物中心。二、主要试剂RPMll640、低糖DMEM、胎牛血清(FCS)、青霉素一链霉素、丙酮酸钠(美国Gibco公司)，表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(美国Invitrogen公司)，V型胶原酶、insulin单抗、glucagon单抗、尼克酰胺、exendin．4(美国Sigma公司)，INGAP多肽和对照多肽(吉尔生化(上海)有限公司合成)，TGF—D1(美国R&D公司)，羊抗小鼠、羊抗兔FITC荧光抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，RT-PCR试剂盒(美国Promega公司)，大鼠／小鼠胰岛素ELISA试剂盒(美国Linco公司)。 南京医科大学硕士学位论文三、实验方法1．胰腺导管干细胞的分离培养SD大鼠3只，胰腺导管原位逆行插管灌注V型胶原酶溶液，使胰腺充分膨胀并完整分离胰腺组织，然后采用密度梯度离心法分离纯化胰腺导管干细胞，于37。C5％C02条件培养，待细胞贴壁后添加入EGF和bFGF进行扩增培养【4】。胞2．应用INGAP体外诱导胰腺导管干细胞分化为胰岛素分泌细选取第2—6代胰腺导管干细胞，待生长融合达100％后进行诱导分化，更换培养基为低糖DMEM，诱导分四步进行：第一步：低糖DMEM培养液，添加入I％FCS，1％青霉素．链霉素，10mmol／1尼克酰胺，培养5d；第二步：在第一步基础上添加10nmol／1exendin．4，培养5d；第三步：在前一步基础上进行分组培养，INGAP组：添加10I_tg／mlINGAP多肽，对照多肽组：添加10}tg／ml对照多肽，培养5d；第四步：在以上基础上两组再添加入10ng／mlTGF．p1，培养5d。(表2—1)。此后，培养基可更换为扩增的RPMll640培养基(不合EGF、bFGF)培养1周。33 南京医科大学硕士学位论文表2—1INGAP组扣对照多肽组所用分化因子以及浓度分组分化剂INGAP组尼克酬eA按(10mmol／1)+exendin．4(10nmol／1)+INGAP多)呔(10ixg／m1)+TGF—p1(10ng／m1)对照多肽组尼克酰胺(1Omm01／1)+exendin一4(10nmol／1)+对照多)Ik(1099／m1)+TG．F—D1(10ng／m1)3．电镜取生长状态良好的胰腺导管干细胞2瓶(25cm2细胞培养瓶)，按下述步骤收集于EP管：(1)吸去旧培养液，PBS洗1遍；(2)0．25％胰酶一EDTAlml消化约30s．1min，加Hank、S终止消化，吸管吹打；(3)将细胞悬液移入一15ml离心管，1500rpm离心5min；(4)弃上清，PBS洗2遍；(5)将离心管倒扣于滤纸上，吸干残留液体。沿管壁缓慢加约lml2．5％戊二醛固定(4"C保存)，送电镜室。(6)PBS洗3遍，1％四氯化锇4"C固定30min；(7)梯度酒精脱水；(8)样品包埋；(9)厄M．1010(日本JEOL公司)透射电镜观察并拍照。注：新生ILCs无需消化，直接移至15ml离心管离心收集于EP管，以2．5％戊二醛固定。 南京医科大学硕士学位论文4．免疫荧光染色收集诱导后的新生ILCs，均匀铺至多聚赖氨酸处理的96孔板内，24h后吸去各孔培养液，按照免疫荧光染色操作步骤先后滴加稀释的一抗(insulin和glucagon均按1：1000稀释)和二抗(羊抗小鼠一FITC按1：50稀释)，操作结束后于荧光倒置显微镜下观察并拍照。空白对照组以PBS替代一抗。5．RT-PCR检测Triz01分别提取胰腺导管干细胞和诱导后INGAP组、对照多肽组新生ILCs以及正常胰岛的总RNA，按照试剂盒说明，两步法合成目的DNA。引物序列：insulin上游引物57ccaatgagcactttctgcagaccta37，下游引物57tagtcagggttgaggctagcaa37，预计扩增产物321bp；glucagon上游引物57atcttcacaacatctcctgcca937，下游引物57taatccaggtgtcgtgactgcgat37，预计扩增产物279bp。内参照为p-actin上游引物57ccgcgagaagatgacccagat37，下游引物57gaagcatttgcggtggacga37，预计扩增产物780bp。反应条件：94"C3min，94。C30s，52～61℃30s，72。Clmin，72。C5min，30个循环。1．5％琼脂糖凝胶电泳观察结果。6．GSISILCs和新鲜分离的胰岛同时用含IO％FCS的RPMll640培养基培养24h后，Hank7S洗两遍，以40个ILCS／孑L(40胰岛／孔)放24孔板，分别用含糖3．3mmol／1和16．7mmol／1的RPMll640培养液于3735 南京医科大学硕士学位论文℃孵育2小时，收集上清，．204C冻存。ELISA法测定上清中胰岛素含量，并计算胰岛素释放指数。附：LINCORat／MouseELISA试剂盒步骤所有试剂预热至室温!(1)用450ml去离子水稀释每瓶10x的洗液。(2)将需要的条板取出，其余的封好放2—8"C。将所需条板放于一空板框，每孔用300ul稀释的洗液洗3遍，将孔内液体扣干。保证在进行下一步时孔的湿润。如果用的是自动洗板机，参照机器说明清洗板。(3)NSB孔和每一个样品孔加10ulAssayBuffer(参照第1X部分)．(4)如果样品是血清或血浆，则向NSB，标准和对照孔加10ulMatrixSolution(OptionB)．如果样品不舍血清基质成分，则加10ulAssayBuffer到以上各孑乙。(5)向合适的孔加10ulRatInsulinStandard，设复孔。(6)向合适的孔加10ulQCl和Qc2。(7)依次向剩余的孔加10ul样品。(8)向所有的孔加80ulDetectionAntibody。为确保得出最好的结果，所加试剂最好在lh内完成。封好板，摇床室温下孵育2h，摇床速度大约在400—500rpm。(9)去掉封膜并倒掉孔内液体。如前法扣干。(10)稀释洗液洗3遍，每孔300ul，扣干。(11)每孔加100ulEnzymeSolution。封板摇床孵育30min。(12)去处封膜，倒掉液体并扣干。 南京医科大学硕士学位论文(13)稀释洗液洗6遍，每孔300ul，倒掉液体并扣干。(14)每孔加100ulSubstrateSolution，封好，摇床孵育大约15min。标准孔会出现蓝色并随浓度加深。注意颜色变化快或慢取决于当时的室温。观察颜色变化以便把握最佳孵育时间。(15)去掉封膜并加入100ulStopSolution。轻扣板边缘使终止液充分终止反应，蓝色会变为黄色。于450nm和590nm处读取吸光值，并于5min内读完。注意不要让孔内有气泡。四、统计学处理应用SPSSl5．O统计软件，所有计量资料均以均数±标准差(_±s)表示，两组比较采用论验，多组比较采用单因素方差分析，EZP<0．01为差异有统计学意义。结果一、胰岛导管干细胞的培养最初胰腺导管干细胞贴壁长出后形态并不均一，呈多形性，改用添加了EGF、bFGF的1640培养基培养后，可观察到细胞扩增速度较前明显加快，形态趋于均一，呈长梭形，细胞之间相互连接，1周左右可形成连续的单层。用0．25％胰酶一EDTA消化并传代，培养条件同前，此后约7天可传1代(图2．1)。 AB图2一l胰腺导管干细胞倒置显微镜下形态观察(×100)A：P2胰腺导管干细胞传代后1天贴壁长出，呈长梭形；B：P2胰腺导管干细胞形成连续单层，融合达100％二、体外诱导胰腺导管干细胞分化为胰岛素分泌细胞第2～6代胰腺导管干细胞形成连续单层后更换为分化液，最初在尼克酰胺的作用下，细胞间空隙变大，细胞形态发生改变，细胞核突出，四周出现放射状细丝，加入exendin一4后，细胞间逐渐出现少量小的细胞团，但仍呈贴壁状态，而后加入INGAP多肽的INGAP组可观察到细胞团数量增多且增大，并可观察到似正常胰岛样的分泌小泡，而对照多肽组细胞团数量较INGAP组少且形态较小，最后在TGF．p1作用下两组均可形成立体结构的ILCs(图2-2)。38 南京医科人学硕L学位论文4CBD图2—2应用INGAP多肽诱导胰腺导管干细胞分化为新生ILCs过程A：诱导第2天，细胞之间出现出现空隙，细胞核突出，四周出现放射状细丝(×400)；B：诱导第9天，细胞间出现少量小的细胞团(×200)；C：添加INGAP多肽，诱导第15天，细胞团数量增多且增(x400)D：诱导第18天，新生ILCs(×400)三、胰腺导管干细胞和新生ILCs电镜下观察诱导前胰腺导管干细胞内可见丰富的粗面内质网和线粒体，粗面内质网扩张较明显，并可见少量线粒体空泡化。诱导后的新生ILCs内可见较多分泌颗粒，主要为O【细胞和p细胞(图2．3)。 南京医科人学硕}j学位论文AB图2．3诱导前胰腺导管干细胞和诱导后新生ILCs电镜下形态观察(x6000)A：诱导前胰腺导管干细胞，细胞内可见丰富的粗面内质网和线粒体，粗面内质网扩张较明显，并可见少量线粒体空泡化；B：诱导后新生ILCs内可见较多分泌颗粒，主要为仪细胞和p细胞四、新生ILCs的免疫荧光染色对诱导后的新生ILCs进行免疫荧光染色，结果显示ILCs的insulin及glucagon染色均为阳性，且insulin主要在胰岛中间表达，而gluca20n主要在胰岛外周袁达(图2—4)．ABrErrkrp．一 南京医科人学硕士学位论文图2—4诱导后新生ILCs免疫荧光染色(FITC一绿色，×100)insulin染色阳性细胞；B：glucagon染色阳性细胞五、诱导前胰腺导管干细胞和新生ILCs的RT-PCR检测诱导前胰腺导管干细胞insulin和glucagon基因均不表达，而诱导后INGAP组和对照多肽组的新生ILCs均可表达insulin和glucagon基因(图2-5)；INGAP组insulin和glucagon基因相对表达量均比对照多肽组多(P95％。后者已被证实不具有INGAP生物学活性【101。本实验即在诱导分化体系中引入INGAP多肽，同时以对照多肽(与INGAP具有相同氨基酸数量而序列不同的多肽阴)作为对照，观察了INGAP多肽在诱导胰腺导管干细胞分化为胰岛素分泌细胞过45 南京医科大学硕士学位论文程中的作用。在降低了血清和葡萄糖浓度并添加分化因子后，干细胞不再增殖，而是朝分化方向发展，形态逐步发生改变。诱导初期，加入尼克酰胺和exendin．4【8】后，细胞间隙变宽，干细胞逐渐减少，细胞间出现少量小的细胞团。分组后，我们发现，INGAP组细胞团数量明显增多且增大，并可观察到似正常胰岛样的分泌小泡，而对照多肽组细胞团数量较INGAP组少且形态较小，最后在TGF—p1191作用下两组均可形成立体结构的ILCs。通过电镜观察对比，诱导前胰腺导管干细胞和诱导后ILCs差别较大，诱导前细胞表面可见长短不一的微绒毛，胞浆内细胞器较丰富，可见大量的线粒体、粗面内质网；诱导后胞浆内分泌颗粒增多，经鉴别主要为a细胞和p细胞。说明本诱导方案诱导出的类胰岛样细胞团(ILCs)具有胰岛的主要结构。进一步，我们也通过免疫荧光证实了诱导后的ILCsinsulin和glucagon染色均为阳性，另一方面，RT-PCR也证实了新生ILCs有insulin和glucagon基因的表达，且INGAP组的insulin和glucagon基因的表达量均显著多于对照多肽组(P<0．01)，而同正常胰岛比无显著差异，说明本方案诱导的ILCs在转录水平上更接近正常胰岛。GSIS结果进一步证明本方案诱导的ILCs不仅具有胰岛样结构，且具有胰岛素分泌功能，可对葡萄糖刺激作出反应。体外诱导胰腺干细胞分化产生胰岛素分泌细胞为胰岛移植提供了新的来源，因为INGAP是一种内源性蛋白，可以刺激产生自身新生胰岛细胞，所以避免了免疫排斥的问题。在分化体系中引入INGAP 南京医科大学硕士学位论文多肽无疑增加了诱导分红率，产生更多有功能的胰岛，这将为解决供体来源缺乏问题提供了新的更有效的途径。参考文献BorelliMI，DelZottoH，FloresLE，eta1．Transcription，expressionandtissuebindinginvivoofINGAPandINGAP—relatedpeptideinnormalhamsters．RegulPept，2007，140：192—197．2GagliardinoJJ，DelZottoH，MassaL，eta1．PancreaticduodenNhomeobox--1andisletneogenesis·-associatedprotein：apossiblecombinedmarkerofactivateablepancreaticcellprecursors．JEndocfinol，2003，177：249—259．3RosenbergL，LipsettM，YoonJW，eta1．Apentadecapeptide4fragmentofisletneogenesis··associatedproteinincreasesbeta-·cellmassandreversesdiabetesinC57BL／6Jmice．AnnSurg，2004，240：875—884．陈海燕，张强，吴英等．成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定．南京医科大学学报(自然科学版)，2008，28：273—277．5D’AlessandroJS，LuK，FungBP，eta1．Rapidandefficientinvitrogenerationofpancreaticisletprogenitorcellsfromnonendocrineepithelialcellsintheadulthumanpancreas．StemCellsDev，47 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南京医科大学硕士学位论文小结一、结论1．胰腺导管干细胞的分离纯化是整个实验的关键环节之一，良好的灌注是胰腺能够得到较好消化的前提。2．通过借鉴胰岛分离纯化的方案可以分离出较纯的胰腺导管上皮细胞。3．本实验所培养的干细胞具有胰腺干细胞的特征，为诱导胰腺干细胞向胰岛p细胞分化以及提高诱导分化率奠定基础。4．通过在诱导分化体系中引入INGAP多肽可以提高诱导分化率以及新生类胰岛样细胞团(ILCs)数量，所获ILCs不论形态上还是功能上均与正常胰岛接近。二、本研究的不足之处1．本课题由于实验条件的限制，未能利用流式细胞仪对诱导前的胰腺导管干细胞进行细胞表面抗原分析，从而对其生物学特征做更进一步鉴定。2．本课题对诱导前的胰腺导管干细胞和诱导后的新生类胰岛样细胞团(ILCs)仅做了基因转录水平的半定量检测，而未进行实时定量检测。三、展望本课题需要进一步研究从胰腺导管干细胞诱导为新生胰岛过程的机制；摸索更有效的人胰腺干细胞体外诱导胰岛新生的诱导方案。49 南京医科大学硕士学位论文附录一：一、在读期间发表及撰写的论文23陈海燕，张强，吴英等．成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定．南京医科大学学报(自然科学版)，2008，28：273—277．陈海燕，张强，吴英等．应用INGAP多肽体外分步诱导胰岛新生研究，中国糖尿病．(已投稿，评审中)陈海燕，杨涛．胰岛新生相关蛋白与胰岛新生，中华内分泌代谢杂志．(已投稿，评审中)4HYChen，Q．Zhang，YWu，eta1．Isletneogenesisassociatedprotein：Itsapplicationintheinductionofpancreaticisletregenerationinvitro，Diabetes．(拟投)二、参加课题基金项目名称：国家自然科学基金青年基金项目编号：3040021950 南京医科大学硕士学位论文附录二：综述及参考文献[综述一]胰岛新生的研究进展摘要近来研究表明，在一定条件下，胰岛具有新生能力。即胰腺干／前体细胞可向胰岛D细胞分化，形成新的胰岛。目前已有多种动物模型证实了这种新生现象，并且已有研究者建立了体外诱导分化体系。这将有可能极大程度地解决胰岛移植来源不足的问题，以更好地治疗糖尿病。关键词胰岛新生；胰腺干／前体细胞；诱导分化1型糖尿病是内分泌胰腺的胰岛素分泌细胞自身免疫攻击的结果。由于胰岛p细胞破坏，胰岛素绝对缺乏。目前治疗1型糖尿病的主要方案是一天多次监测血糖并皮下注射胰岛素。然而这种依赖外源性胰岛素注射的方案并不能从根本上治疗糖尿病。理想的方法是建立内源性胰岛分泌系统来恢复胰岛p细胞的数量和功能。胰岛移植给糖尿病治疗带来了新的希望。2000年Shapiro等的Edmonton方案的出现，使胰岛移植成功率大大提高，但同时由于胰岛供体来源的缺乏，免疫排斥等问题限制了其在临床上的应用和推广。因此，寻找可供替代的其他来源的p细胞成为研究的焦点。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。通过诱导干细胞使其向胰岛p细胞分化，从而促进体内胰岛新生将是更为理想的途径。胚胎干细胞由于涉及伦理学问题，使得人们将主要精力转向成体于细胞的研究。同其它组织和器官一样，胰腺也存在自身的干细胞一胰腺干细胞。近年研究表明，胰岛p细胞 南京医科大学硕士学位论文处于一个动态平衡状态。随生长、发育以及妊娠、肥胖等生理状态的改变而改变。当胰腺损伤，组织破坏，可出现胰岛新生现象。1胰岛新生机制1．1胰岛新生过程同体内其它组织一样，胰岛D细胞也处于增殖、新生和凋亡的动态平衡中，可随生理需求和病理状态而改变，如妊娠、肥胖或胰岛素抵抗，p细胞表现为肥大、超常增生和新生。D细胞新生即从胰岛前体细胞形成新的p细胞。可能通过两条途径：一个是胰岛干／前体细胞的激活，再一个是成体胰腺细胞的分化。前者指的是表达原始标记的休眠细胞向胰岛p细胞分化。但这类胰岛干细胞的存在和鉴定仍存在争议。后者指由胰腺细胞(导管或腺泡)在一定条件下分化为胰岛p细胞[11。目前认为，胰腺导管上皮细胞可看作胰岛前体细胞，体外培养人或小鼠的胰腺导管上皮细胞可分化出胰岛样结构，产生有功能的胰岛，将这些新生胰岛进行移植可逆转高血糖状态。这种成体胰岛新生的过程类似于胚胎发育过程。在正常胰腺，导管是处于休眠状态的，即静止的，受局部因子(如TGF．D)的抑制。当胰腺受到各种损伤(包括物理的、化学的和病毒的)时，可诱发胰岛前体细胞增殖并进行分化，新的胰岛从位于导管或导管附近的胰腺干／前体细胞出芽生长，最终形成新的胰岛，并且这些新生胰岛可产生分泌胰岛素的p细胞。1．2胰岛新生涉及的相关的转录因子和蛋白质胰岛新生涉及一系列的转录因子和蛋白质的调控。简述如下：1．21转录因子 南京医科大学硕士学位论文PDX．1即胰腺十二指肠同源异形盒，不仅在胰腺发育和调节胰岛素基因表达方面起重要作用，还决定了成熟胰腺的分化。PDX-1基因最初是由非洲爪蛙的基因组DNA中分离，称为XIHbox8，当胰腺再生时，PDX一1蛋白水平明显上调，但其mRNA未改变。说明其调节是在转录后水平。而且其表达随时间增加说明PDX．1对于再生的始动并不起重要作用，而可能在导管细胞向D细胞分化中起作用。近期研究已鉴定出大量除PDX．1的其它涉及胰岛分化的重要基因。包括BETA2／NeuroD、ISL一1、Pax4、Pax6和neurogenin3。BETA2／NeuroD是一个碱性的螺旋．环．螺旋转录因子，作为胰岛素基因的调节子和非洲蟾蜍胚胎的一个神经源性因子而被克隆。参与胰岛新生过程。此外，ISL一1也是胰岛细胞分化所必需，缺乏ISL一1的小鼠将不能分化为胰岛细胞。而Pax4与Pax6分别是胰岛前体细胞分化为p细胞、6细胞和0【细胞的关键因子。neurogenin3是胰腺定向分化的一个重要因子，现也被认为是胰岛的前体细胞。1．22蛋白质如早期发现的胰腺激素YY，某些酶类如酪氨酸羟化酶，胰多肽等。角朊细胞素．19(Cytokeratin．19或CK-19)是胰腺导管上皮细胞向干细胞转化的标志。近来对Nestin的认识也有突破，以往被认为是神经干细胞的特异性标志，但后来发现其也可作为胰岛前体细胞在分化中起重要作用。胰升糖素样肽．1(GLP一1)和Exentin一4能促进PDX．1基因的表达从而增加p细胞量。有认为二者可以诱导胰腺导管上皮细胞、腺细胞 南京医科大学硕士学位论文和Nestinl‘El性导管细胞向胰岛素分泌细胞分化。在胰腺胚胎发育和成体胰岛内D细胞新生过程，GLP一1都可能是重要的形态发生原‘21。胰腺新生蛋白(Reg)在切除90％胰腺的鼠类动物模型中表达上调，已证实Reg与胰岛新生关系密切。胰岛新生相关蛋白(INGAP)是Reg家族成员，是1997年Rafaeloff等在赛璐玢包裹地鼠胰头诱发胰岛新生的实验中发现的一种新的蛋白。这种蛋白只在胰腺新生时表达，正常胰腺不表达。INGAP能激发导管细胞增殖，是胰岛新生的先决条件。对胰岛新生机制的研究可帮助我们了解哪些转录因子或蛋白质在新生过程中起重要作用，以便我们利用这些因子操控胰岛新生的某些环节，在体外促使胰岛新生逆转糖尿病。如目前认为可以刺激鼠类胰岛新生的因子有INGAP、GLP．1和GLP一1受体激动剂exendin一4，以7Jkbetacellulin和activinA的联合【3】，EGF和促胃泌素的联用【4】。其中betacellulin是EGF家族成员，可以刺激p细胞增殖，NactivinA是TGF．p家族中一员，和促胃泌素一同被认为可促进D细胞分化。表1胰岛新生涉及的转录因子和蛋白质转录因子及蛋白质作用参考文献转录因子PDX．1胰腺发育，胰岛素基因表达调节，成熟胰腺分化．胰岛素基因调节子，Jonsson等，1994；Offield等，1996；Ohlson等，1993Naya等，1997 南京医科大学硕士学位论文Pax4Pax6参与胰岛新生胰岛前体细胞分化为母细胞、Sosa-Pineda等，19976细胞和c【细胞的关键因子neurogenin3胰腺定向分化蛋白质胰腺激素YY酪氨酸羟化酶CKl9胰腺导管上皮干细胞标志NestinGLP．1ExendinReg胰岛前体细胞标志St-Ongc等，1997Grapin-Botton等，2001，Jensen等，2000，Schwitzgebel等，2000Upchurch等，1994Teitelman等，1981Bonner-WeirsS，SharmaA，2002；Herrera,2000促进PDX一1基因表达增加D细胞量诱导胰腺导管上皮细胞、腺细胞和Nestin阳性导管细胞分化参与胰岛新生过程INGAP胰岛新生的先决条件Hunzinger，Stein，2000；Lumelsky等，2001；Zulewski等，2001Zhou等，1999Xu等，1999；Zhou等，1999；Otonkoski等，1994；Okamoto，1997Rafaeloff--等，19972胰岛新生的体内动物模型2．1赛璐玢包裹胰头Rosenberg最早在1983年用赛璐玢包裹叙利亚黄金地鼠胰头的动物模型证实导管上皮超常增生与胰腺肿瘤有关。而后在1988年利用这一技术成功逆转叙ff,1,3p_地鼠STZ诱发的糖尿病，7周后，手术组50％动物血糖和胰岛素水平恢复正常。1997年，Rafaeloff等从对该实验模型的研究中提取分离出一种蛋白Ilotropin，也可以逆转STZ诱发的糖尿病。Ilotropin中包含一种分子量约55 南京医科大学硕士学位论文20．45kDa，具热酸稳定性的蛋白’后命名为INGAP。它可刺激分离的胰腺导管在培养状态下增殖。INGAP在新生早期表达，认为其始动了胰岛新生过程。2．2胰腺部分切除现已有许多动物模型证实胰腺部分切除(可多达90％)后可出现内分泌和外分泌胰腺再生。胰腺切除后，增殖的导管和毛细管内皮细胞中编码胰岛素样生长因子I(IGF．1)的基因上调．说明IGF．1与胰腺新生有关，并且其mRNA表达局限于新生特定区域，在胰腺部分切除大鼠是特异的，说明IGF一1在胰腺发育或分化过程中起重要作用。此外，该模型还有研究人员发现Reg基因也与胰腺新生关系密切。但其在正常胰腺发育中的作用还有待进一步研究。2．3部分胰导管结扎Bonner-Weir于1983年做了大鼠胰腺部分切除(90％)的模型，观察到在胰腺部分切除后，导致了残余胰腺的再生和依赖葡萄糖的胰岛素释放受损。这些发现支持过量葡萄糖刺激数量减少的D细胞导致p细胞功能异常。1991年，同样模型，观察到胰腺再生时，胰岛素样生长因子．I(IGF．1)表达上调，说明IGF一1可能在胰腺组织生长或分化中起重要作用。Wang等(1995年)将成年大鼠的胰尾部结扎而胰头不结扎，发现胰头部分在组织学和细胞群体动力学方面未受到影响，而胰尾部的13细胞数量在一周内几乎翻了一倍。同时0【细胞数量也有少量增加．胰腺导管细胞标志CK20标记指数增加了十倍。由此证明外分泌导管细胞的增殖和分化为该模型胰岛新生的主要机制，同时说明在正常成年大鼠可由刺激胰腺导管细胞诱发胰岛新生。 南京医科大学硕士学位论文2．4IFN—Y转基因小鼠Sarvetnick等通过免疫破坏表达编码IFIN．Y(Ifng)基因的转基因鼠的胰岛p细胞，发现胰岛迅速出现新生过程包括导管细胞的复制和其后分化为胰岛D细胞，该过程与胰腺胰岛的发育及其类似。而导管的这种保留其增殖并分化为胰岛的能力，在正常条件下并未出现。近来研究已证明INS．Ifng转基因鼠中IFN-Y介导的胰腺新生旁路需要转录因子Pax4，Pax6，Pdx．1heislet．1(Isl．1)的参与，它们控制着初期胰腺的发育【51。对该模型进一步研究已证实新生过程中多种转录因子包括PDX．1和肝核因子3p，PAX蛋白和Isl．1的作用，显示IFN．Y转基因鼠胰腺导管中这些转录因子的合成在胰岛破坏后是必须的和持续进行的过程。该模型对于研究胰岛细胞谱系关系和成人胰腺新生非常有用。3体外诱导分化体系即在体外建立胰岛干细胞分化体系，诱导胰岛干细胞分化为胰岛胰岛D细胞。胚胎干细胞和成体干细胞均可在体外被诱导分化。3．1胚胎干细胞一胰岛D细胞胚胎干细胞具有多向分化潜能，在某些诱导分化因子的作用下，可向胰岛D细胞分化。SofiaB首次(2000年)证实了AkESCs向胰岛D细胞分化是可能的。同时证明了在低糖、尼克酰胺存在条件下可促进胰岛素分泌细胞进一步分化并形成三维胰岛样结构，且可以逆转链脲菌素(sTz)致糖尿病小鼠的高血糖。尽管这种方案成功率很低，有待更多改进，但为以后的方案开拓了一条新的道路。由于胰腺和神经系统的发育过程有许多相似性，此外，某些神经 南京医科大学硕士学位论文元和p细胞的许多表型和功能特性也存在相似性，故有人将用于获得神经元的方案经过再设计以希从ESCs产生内分泌胰腺细胞。尽管Nestin是神经外胚层组织的一个重要标志物，研究显示神经丝蛋白nestin也存在于人和鼠的胰岛细胞和导管。基于这个理论，Lumelsky等首次(2001年)建立了一个从ESCs获得胰岛素生成细胞的方案，这个方案分四步：(1)胚体形成后nestin阳性细胞的筛选；(2)含胰岛素一转铁蛋白一硒一纤维结合素(ITSFn)的培养基培养；(3)在添加了成纤维生长因子(bFGF)和B27添加剂的N2培养基中扩增；(4)撤去bFGF并加入尼克酰胺分化成胰岛素阳性细胞。但是这个方案所获胰岛素阳性细胞分泌的胰岛素含量低，并且不足于纠正STZ致糖尿病小鼠的高血糖状态。后续方案即增加了胰岛素含量和分泌量。如Hofi等【61在最后一步添加磷酸肌酸3．激酶(P13K)抑制子LY294002．P13K是细胞内一个重要的激酶，它调节许多细胞的增殖活动。用这个方案获得的细胞分泌更高量的胰岛素并且在体外表现为葡萄糖依赖的激素分泌。Moritoh等【71将一个受控于小鼠insulinII启动子的13．geo基因转染入ES细胞系也分化出胰岛素生成细胞，尽管insulinII主要表达于胰腺外组织，所获细胞不仅表达insulinII基因，也表达胰高糖素、生长抑素、PP、p48、淀粉酶和羧基肽酶A基因。其它的方法就是使nestin阳性细胞定向分化，Miyazaki等【81建立了一个大鼠的ES细胞系，用四环素载体来控制Pdx．1的表达。转染了这种结构的细胞参,N,,nestinI‘EI性细胞的培养方案，并于nestinl‘El性细胞扩 南京医科大学硕士学位论文增阶段添加角朊细胞生长因子(KGF)和表皮生长因子(EGF)，结果培养的这种细胞insulinII表达水平增高并对Ctlk表现免疫阳性。然而，分泌的胰岛素的量并不足于使STZN：糖尿病小鼠建立正常血糖调节。在此基础上，另一个方案[91，构建了另外一个载#(CMV．Pax4)，可持续表57s．．Pax4，同样培养方案，产生insulin，Isl．1，Ngn3，胰岛淀粉样多肽和葡萄糖转运体一2(GLUT．2)阳性的细胞聚集物。将这些细胞移植入脾可恢复糖尿病小鼠血糖正常水平。以上这些方案均是基于nestinFEl性细胞作为胰岛p细胞的前体细胞进行扩增。但是仍存在一些问题如内源性胰岛素产生少，再有就是这些培养方案中胰岛素的主要生成者是神经外胚层前体细胞。而后，又有研究者在上述方案基础上做了改进，即在筛选和扩增nestin阳性细胞时改用无血清但舍有尼克酰胺和层粘连蛋白的培养基，所收获细胞的胰岛素、C肽和CKl9FE)性并且有葡萄糖刺激的胰岛素分泌【101。此外，还有方案在最后一步添加activinp—B或exendin．4等[1II。近期研究注意到胰腺从胚胎内胚层分化时维甲酸(RA)信号通路的作用，在胚体培养时加2x．RA，通过三步诱导方案获得的胰岛D细胞，移植后可使STZ诱导的糖尿病小鼠血糖恢复正制121。尽管ESCs作为新的p细胞的一个来源很有前景，但分化出的p细胞与正常p细胞的相似性，即能否在基因表达、生长潜能和分泌功能方面达到和正常细胞相同还需进一步证实。晚近，在一些国家，用．K．ESCs进行研究因受法律禁止而限制了其工作进展。3．2成体干细胞一胰岛D细胞成体组织中存在的成体干细胞 南京医科大学硕士学位论文(ASCs)可作为ESCs的替代用于产生胰岛p细胞。尽管其增殖潜力有限，而且具有特定细胞表型，但具有自体移植优势即可避免免疫排斥。在体内、体外均可分化为胰岛p细胞。3．2．1胰腺成体干／前体细胞成体胰腺的导管上皮细胞作为胰岛前体细胞已得到证实，并且已分别从小鼠和人导管获得胰岛样结构：Ramiya等(2000年)从尚未发病的成年NOD小鼠胰腺导管上皮细胞诱导分化得到产生胰岛的干细胞(IPSCs)，这些干细胞可长期培养，由IPSCs进一步分化出有功能的胰岛组织。具体方法是胶原酶消化胰腺导管组织，先在含2％正常鼠血清无糖培养基中培养4．5周形成上皮样细胞聚集，然后在o．5％．ff-常鼠血清，2．5mM葡萄糖培养基培养形成IPSCs，继续分化为胰岛素生成细胞，并可最终分化为三维立体结构的胰岛样细胞团，包含0【，p和6细胞，且表达一系列胰岛标志，在葡萄糖刺激下可分泌胰岛素，将这些细胞移植入NOD小鼠后可逆转其胰岛素依赖型糖尿病。Bonner-Weir等(2000年)分离人胰腺经酶消化并进行密度梯度离心纯化收集导管上皮细胞进行培养，在含胰岛素、转铁蛋白、硒(ITS)，尼克酰胺，KGF的无血清培养基中扩增导管，待形成上皮样细胞后，在其上铺一层Matrigel继续培养即可得到三维结构的胰岛样细胞团，免疫荧光染色显示该细胞团由CKl9F日性的导管细胞和激素(胰岛素、胰高血糖素、生成抑素和胰多肽)阳性的胰岛细胞组成。胰岛素分泌试验表明，该细胞团在20mmol／L葡萄糖诱导下产生的胰岛素是在5mmol／L葡萄糖诱导下的2．3倍，说明其对葡萄糖刺激具有 南京医科大学硕士学位论文反应能力。Lin等【13】】也进行了人胰腺导管干细胞的培养研究，不同于Bonner的方案，其方法是分离人胰腺导管组织消化后，于含IO％FBS的CMRLl066液中培养2天，收集悬浮细胞离心后培养于无血清ITSFn培养基，重复上述过程2次以除去悬浮细胞，然而将悬浮细胞团培养于改良的无血清ITSF涝养基，可见梭形推测的胰腺干细胞(PSCs)，其可表达PDX一1和nestin，并可分化为胰岛素、胰高血糖素和生成抑素阳性的细胞，同未分化的PSCs3fO比，分化的PSCs胰岛素含量／分泌量明显增加。荧光激活细胞分选术(FACS)结果显示CD29，CD44，CD51，CD81，SH2andSH3这些间充质干细胞标志也同样表达于PSCs，并且CD38，CD49b，Cd49d，CD50，CD58，CD62E和CDGFR．alph雄PSCs中高强度表达。虽然以上方案都成功诱导出胰岛D细胞，但仍存在增殖率低和胰岛素分泌量低的问题。另一方面，导管外存在的p细胞前体细胞还未证实，最近一项研究对从导管或其它前体细胞新生p细胞的观点提出了质疑，他们用胰岛素阳性细胞谱系示踪的方法证实，体内新的D细胞很可能是已有D细胞复制的结果，而并未出现胰岛新生，即没有p细胞新生的其它机制参与[14】。然而Bonner—WeirS新近的研究显示，20．31天龄的大鼠，30％新生成的p细胞并不是从已存在的D细胞衍生而来【15】。这就出现了矛盾，因为体内研究很难观察和确定D细胞新生。再者，前体细胞来源很可能并非唯一，不同的细胞类型包括导管细胞、腺细胞和已存在的D细胞都有可能是成熟p细胞的前体细 南京医科大学硕士学位论文胞。3．2．1非胰腺干／前体细胞骨髓、外周血细胞也被认为有很大的分化潜能。已证实从骨髓分离的间充质干细胞可分化为胰岛p细胞【161。此外，从外周血分离的人单核细胞通过暴露于也．3和巨噬细胞集落刺激因子，再添加入EGF，肝细胞生长因子(HGF)和尼克酰胺，可向胰岛p细胞分化，将所获细胞移植入糖尿病小鼠可在短时间内恢复血糖正常【171。尽管很有前景，然而循环多能干细胞还未被鉴定，C肽含量很低，并且这个方案只有2／3血液样品有效(原因不明)。所以还需进一步在多种动物模型验证这些细胞的分化潜能及纠正高血糖的效应。4展望尽管目前认为胰腺的新生能力是有限的，却极大鼓舞了人们通过各种动物模型来研究新生的机制，以构建体外诱导分化体系。如果在体外培养胰岛干细胞并对其在基因水平和蛋白水平进行干预，施加诱导分化，从而产生能够分泌胰岛素的D细胞，将很大程度上解决胰岛移植面临的来源匮乏的难题，同时若在体外进行一些手段对0细胞进行保护，也将有希望降低甚至是避免免疫排斥的问题。参考文献1LipsettM，AikinR，CastellarinM，eta1．Isletneogenesis：Apotentialtherapeutictoolintype1diabetes[J]．TheIntemationalJoumalofBiochemistry&CellBiology，2006，38：498-503．2AbrahamEJ，LeechCA，LinJC，eta1．Insulinotropichormone 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南京医科大学硕士学位论文stemcellspromotesdifferentiationofnestin-positiveprogenitorandinsulin-producingcells[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2003，100：998-1003．10KaniaG，BlyszczukP，WobusAM．Thegenerationofinsulin—producingcellsfromembryonicstemcells-——adiscussionofcontroversialfindings[J]．IntJDevBiol，2004，48：1061-1064．11．KuHT，ZhangN，KuboA，eta1．Committingembryonicstemcellstoearlyendocrinepancreasinvitro[J]．StemCells，2004，22：1205-1217．12ShiY，HouL，TangF，eta1．Inducingembryonicstemcellstodifferentiateintopancreaticcellsbyanovelthree—stepapproachwithactivinAandall—transretinoicacid[J]．StemCells，2005，23：656-662．13．Han—TsoLin，Shih-HwaChiou，Chung—LanKao，eta1．Characterizationofpancreaticstemcellsderivedfromadulthumanpancreasductsbyfluorescenceactivatedcellsorting[J]．WorldJGastroenterol，2006，12：4529—4535．14DorYBrownJ，MartinezOI，MeltonDA．Adultpancreaticbeta—cellsareformedbyself-duplicationratherthamstem-celldifferentiation[J]．Nature，2004，429：41—46．15Bonner—WeirS，SharmaA．Aretherepancreaticprogenitorcellsfromwhichnewisletsformafterbirth[J]?NatClinPracEndocrinolMetab，2006，2：24心41．16ChenL．B，JiangX．B，YangL．Differentiationofratmarrow 南京医科大学硕士学位论文mesenchymalstemcellsintopancreaticisletbetacells[J]．WorldJGastroenterol，2004，10：3016-3020．17RuhnkeM，UngefrorenH，NusslerA，eta1．Differentiationofinvitro-modifiedhumanperipheralbloodmonocytesintohepatocyte—likeandpancreaticislet—likecells[J]．Gastroenterology，2005，128：1774-1786．65 南京医科大学硕士学位论文[综述--]胰岛新生相关蛋白(INGAP)与胰岛新生摘要胰岛新生相关蛋白(INGAP)是RegIII家族的一员，近来研究表明，INGAP参与胰岛新生过程，并可以逆转糖尿病动物模型的高血糖状态，有望成为治疗糖尿病的又一新的药物。关键词胰岛新生相关蛋白；INGAP多肽；胰岛新生1．INGAP概述INGAP即胰岛新生相关蛋白，属于再生蛋ReglII的家族成员，具有诱导胰岛新生的作用[1l。INGAP基因主要在正常地鼠、小鼠和人类的导管和腺泡中表达，而胰岛中也有部分表达【2，31。INGAP最初是在地鼠胰导管部分切除(PDO)的外科手术模型中被发现的。在该模型中，地鼠的p细胞增加，被认为是胰岛新生的所在。后来),KPDO动物胰腺中粗提出来一种称ilotropin的蛋白，其可明显引起胰腺再生并逆转化学物质导致的糖尿病。r而INGAP是ilotropin的主要组成成份，经差异mRNA-汪实INGAP在胰岛新生中表达上调，是胰岛新生的先决条件【4】o近来，多项研究从体内和体外，由动物模型到人胰腺组织到进入临床研究阶段均发现INGAP与胰岛新生关系密切，INQ心不仅具有诱导胰岛新生，刺激p细胞增生的作用，还可以逆转糖尿病的高血糖状态，因此INQ心极有可能成为治疗糖尿病的又一新的药物。本文即对INGAP与胰岛新生之间关系的研究现状做一综述。2．INGAP与胰岛新生2．1体内研究近来的两个模型证实了INGAP在体内的表达与 南京医科大学硕士学位论文定位，并推测INGAP可能与胰岛新生有关。一个是地鼠糖尿病模型该研究是给正常地鼠喂以掺入蔗糖的饮用水5周(S8)或21周($24)，对照组地鼠则喂以正常的饮用水，结果二者血糖水平无明显差异，而胰岛素水平实验组比对照组高。此外，仅在s8观察到CK标记的细胞，同时还观察到大量的INGAP阳性细胞，提示INGAP可能参与了控制胰岛新生的过程。这些INGAP阳性细胞绝大多数位于胰岛外周，同时也存在于腺泡组织，并且INGAP阳性细胞与CK阳性细胞常同时表达[51。另一个胰岛新生模型是给孕鼠喂以蔗糖水这个模型证实了血糖水平的降低和胰岛素分泌的增加有关，而胰岛素分泌增加是由于p细胞数量增加。p细胞增殖力和胰岛新生能力此时也均有显著的增加。而且INGAP表达阳性的同时导管细胞、胰岛外胰腺细胞和PDX一1阳性细胞也有惊人的增加，提示INGAP参与调节胰岛新生，在发育初期，PDX—l+／INGAP+细胞很可能是一个新的干细胞亚群，并且在新生时表达活跃。此外，这些细胞有助于导管和腺泡相关的PDX一1+细胞的增加【3】。以上研究说明在胰岛新生时，不仅有CK阳性和PDX．1阳性细胞的表达，同时也存在INGAP阳性细胞的表达，INGAP和CK、PDX．1在胰岛新生中均具有重要的作用。2．2体外研究体外研究主要是观察INGAP多肽对胰岛新生的效应。INGAP多肽是INGAP蛋白的生物核心活性部分，为104—118位15肽氨基酸序列，已证实在诱导新生胰岛形成并逆转STZ地鼠和 南京医科大学硕士学位论文小鼠糖尿病中起作用【l'6】。2．2．1正常血糖鼠类RosenbergL-等[q给正常血糖地鼠注射外源性的INGAP多肽可在10f≮．内引起胰岛新生，这种诱导p细胞增殖的作用持续了至少30天，这期间出现了一个p细胞增殖的高峰，至30天时可观察到成熟的新生胰岛。然而，p细胞数量的持续增加是不是还依赖于正常血糖的环境还是个问题。在对健康小鼠进行的为期90天的毒理学研究中，通过p细胞的定量和组织胰岛素含量的测定发现了胰岛新生的证据。观察到随剂量增加的导管和腺泡相关的单个或小的13细胞团忉。这些结构是新生的标志。峰效应出现在动物每天注射100mg／kg的INGAP多肽，而200mg／kg组无明显增加。2．2．2NOD小鼠为了评价INGAP改善l型糖尿病动物模型糖尿病的潜力，Suarez．PinzonⅥ兄等【81利用NOD小鼠模型进行了探索性研究。这些动物疾病的标志是自身免疫反应，给小鼠仅注射INQ心多肽(500Fg／d)或单用免疫抑制剂(o．1mg／kg,他克莫司+o．1mg／kgi西罗莫司)。这个研究中的小鼠逐渐出现糖尿病，在治疗前血糖>28mmol／1达6周，比其它研究中NOD小鼠急性糖尿病(在治疗前空腹血糖在10．0—13．2mmol／1达3．6天)的胰岛素抵抗更显著。结果显示INGAP多肽处理组可延长存活率并且和单用免疫抑制剂组相比，对于糖尿病状态具有积极的重要作用。2．2．3STZ糖尿病小鼠模型RosenbergL等【11还用STZ(p细胞特异性 南京医科大学硕士学位论文毒素)致糖尿病小鼠检测了INGAP多肽逆转糖尿病高血糖的能力。在这项研究中，注射过rNGAr'．多肽(500ug／d)达6周的4只小鼠的高血糖状态全部得到逆转，这和导管、腺泡相关的新生以及p细胞数量的显著增加有关。2．2．4分离的大鼠胰岛关于胰岛功能，近来一项报道称ING肿多肽足以使分离的胰岛的基础以及刺激后的胰岛素分泌增加【9】。该研究观察了在新生和成年大鼠分离的胰岛的这些效应，胰岛孵育90分钟，在掺入INQ姐多肽4天时其促分泌的效应由中到高更为显著。尽管INGAP多肽的确会引起胰岛内p细胞和非p细胞肥大，但这些效应却与细胞寿命无关。继之，该研究中心又对其机制作了进一步研究，发现INGAP多肽在增加胰岛素分泌的同时可提高一些胰岛相关基因的转录如直接或间接参与与胰岛代谢、p细胞群和胰岛新生的基因等【101。2．2．5外源性INGAP在健康猴子已有鼠类和大型非灵长类哺乳动物关于INGAP生物活性的研究，近来也有研究者给短尾猴注射INGAP多肽90天，随后评估胰岛新生、p细胞群和组织胰岛素含量。新生现象更多的出现在单个猴子，但却是显著的。一个称之为导管复合物形成的新生区域在一只注射了高剂量INGAP多肽(400mg／kg／d)的雄性猴子上观察到。这个细胞转分化区域似乎遍及整个胰腺叶并且这个区域的主要部分胰岛素免疫组织染色均呈阳性。尽管正在进行的研究样本量小，这些数据总和起来说明INGAP在正常动物具有诱导新生的作用，这在诱导新生方面可能比糖尿病鼠更具有耐受性。与其它组织相似，p细胞群在正常状态维持相对恒定， 南京医科大学硕士学位论文但具有应对生理或环境条件需要时改变的能力【11l。很可能包括多水平的调控如调节新生、增殖、肥大、凋亡牙口去分化【12】。然而，观察到注射INGAP在灵长类可诱导新生为INGAP应用于人类提供了重要的证据。2．3INGAP在人类的应用2．3．1培养的人组织JamalAM等【13】通过应用INGAP成功诱导人组织出现新生胰岛。在分离成人胰岛后，应用特殊的培养条件诱导细胞向高增殖力的导管样结构(DLS)转变，以胰岛特有激素和转录因子的消失，并出现导管上皮和前体细胞标志为标准。基于电镜和免疫荧光，转分化0【和6细胞产生DLS细胞。短期用INGAP刺激未分化的DLS可使它们再分化为胰岛样结构(ILS)。这些ILS无论是从形态学还是胰岛基因的表达、激素的产生、胰岛素含量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌均同新分离的人胰岛类似。这些观察证明INGAP可诱导人胰腺衍生的前体样组织向有功能的正常胰岛分化。值得注意的是来自地鼠蛋白的合成肽．INGAP足以引起这一效应，而人同系的对照多肽如RegIIIa、RegIII?则无此效应。而且，这个胰岛新生模型对GLPl无反应，但对胃泌素(gastrin)和HGF有反应‘14】。INGAP或rNCAP相关的RegIII蛋白在人类胰岛新生中的直接证据是一例高胰岛素血症联合胰腺移植者的新生组织中仅．INGAP抗体有较强的染色【15】。2．3．22期临床研究在34天的1b期临床研究确定安全和耐受的前提下，进行了2期的临床研究：一组是1型糖尿病人(63例)，另一组是2 南京医科大学硕士学位论文型糖尿病人(126例)。该研究为双盲多中心为期90&的研究用以评估相对于安慰剂组，INGAP多肽(300或600mgqd)的有效性和安全性【16，171。病人自己注射INGAP多肽90天，停止注射后再观察30天。在入组时、56天和120天退组时分别测定精氨酸刺激的c肽(ACP)、自我血糖测定(SMBG)和基础胰岛素用量。在1型糖尿病人，未观察到葡萄糖或胰岛素需要的改变，其中ACP在600mg组从基线到56天时显著增加达27％，并且在第120时也维持稳定(中断INGAP30天后)。有趣的是，300mg组中有22％的GAD65抗体滴度较前增高达50％。作者总结升高的GAD65抗体滴度可能说明体内新生成胰岛的胰岛抗体表达的增加。C肽明显增加证明了这点。进一步总结临床血糖或胰岛素用量相关变化的缺乏可能是未充分暴露于INGAP多肽或免疫破坏了INGAP诱导的新生胰岛，进一步研究也证实了这种推论。在2型糖尿病，HbAlc在各组均有所降低，600mg组降低更明显。600mg组SMBG平均每天血糖的改善证实了HbAlc的改变。这组的每天胰岛素用量没有改变，而安慰剂组增加3％，300mg组降低3％。安慰剂组和300mg组在第56天和120天时ACP降低，而600mg组在第56天和120天时ACP是升高的。作者总结600mg组随平均血糖降低有一个信号效应，这一点由第90天时HbAlc下降证实。他们推测这是由于随着ACP增加和胰岛素剂量不变引起的13细胞功能放大所致。他们总结更长时间的暴露可能会观察到13细胞新生的更为确切的证据。71 南京医科大学硕士学位论文两项研究的所有主要终点均未达统计学差异，但这解释了两组间病人每项结果的统计学的不同。例如，在1型糖尿病研究中，ACP不同有统计学意义而HbAlc的改变仅显示出一种趋势。2型糖尿病的研究也是这样。在1型糖尿病研究中ACP检测的变异性要远远小于2型糖尿病研究。HbAlc检测的变异性在两者研究中相似，不过2型糖尿病研究例数要比1型糖尿病多大约50％。这样，1型糖尿病研究更有利的证明了ACP的改变，而2型糖尿病更有利的证明了HbAlc的改变。考虑到两型糖尿病人群13细胞群缺乏的差异，胰岛功能的微小改变在1型糖尿病者中更易检测出。另一方面，代谢效应在2型糖尿病者中可能更突出，尤其是如果INGAP多肽对于胰岛没有新生营养作用。3．展望综上所述，在胰岛新生时，INGAPI咱性细胞与cK阳性和PDX．1阳性细胞均有表达，说明INGAP和CK、PDX一1在调节胰岛新生过程中均具有重要的作用。以上研究也证实了INGAP多肽，即INGAP蛋白的生物活性部分无论在正常还是糖尿病动物模型均具有诱导胰岛新生、刺激p细胞增生的作用，并可逆转糖尿病的高血糖状态。近来的临床研究结果均支持外源性的给予玳GAP多肽可增加内源性的胰岛素，并改善血糖控制。然而由于缺乏组织学的评估，这些临床试验的结果不能充分证明INGAP多肽诱导胰岛新生。但随着有效性和耐受性的改善，即通过持续的或是一天多次注射mC；AP多肽，可以预见今后临床试验将会更进一步的改善血糖。 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