实验四 植物DNA的大量提取与Southern杂交

《实验四 植物DNA的大量提取与Southern杂交》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验四植物DNA的大量提取与Southern杂交第一天一、植物DNA的大量提取CTAB法：CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。Tris-

2、HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中。β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。材料：转基因植株步骤：1)取20mLCTAB提起液于50mL离心管中，65℃预热。71)取5克新鲜幼嫩叶片，加液氮磨成粉末，转入盛有预热提起液的离心管内，迅速搅拌均匀。2)于65℃水浴提取1h。冷却至

3、室温。3)加等体积氯仿-异戊醇（24∶1），充分混合均匀。4)离心（4000r/min，15分钟）。5)上清液用等体积氯仿-异戊醇抽提1次（4000rpm，15min）。6)上清液中加入2/3体积的异丙醇，摇匀。此时应有絮状DNA出现。7)挑出DNA，置于10mL离心管中。加76％乙醇浸泡1h8)离心（3000g，4℃）15min9)沉淀DNA用76%乙醇洗2次，自然晾干10)沉淀加入5mL1mol/LpH8.0TEbuffer，5µLRNaseA（1.0mg/mL），56℃温浴至全部溶解11)加入预冷的等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，摇匀，4°C静置10min，离心(3

4、000g,20min)12)上清液加入1/10体积5mol/LNaAc，2倍体积乙醇，-20oC放置1h或过夜。13)离心(12000g,20min)，沉淀用75%洗2次14)转移至95％的乙醇中，浸泡5min71)将DNA自然晾干，溶于1mol/LpH8.0的TE溶液中，贮于4℃待用。第二天二、DNA浓度的测定及调整待DNA完全溶解后，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量。取2μLDNA溶液加98μLH2O，混合。取5μL进行琼脂糖凝胶电泳，以λ/HindIII为标准，凝胶扫描后估算DNA含量。通过稀释将DNA浓度调至250－300ng/μL左右。三、DNA的酶切、电泳、So

5、uthern转移1.浓度调至250－300ng/μL的DNA用常见的限制性内切酶（EcoRI）进行酶切，取总DNA2.5-3μg，8U的限制性内切酶，特异的酶切缓冲液1.7μL，用ddH2O使总体积为17μL，37℃酶切过夜。PstⅠ/EcoRⅠ/BamHⅠ样品编号内切酶Buffer类型17μL反应体系中各成分用量（μL）DNABufferenzymeRNaseH2OTotal1EcoRI31.70.517第三天72.取2μL酶切反应混合液进行电泳检测，3.当酶切完全后进行酶切片段的电泳分离。电泳时琼脂糖浓度为0.8％，电压40V，待溴酚蓝指示带到达前缘后停止电泳。4.转膜

6、1)用0.2mol/LHCl变性8分钟，2)用0.4mol/LNaOH作转移液将凝胶中的酶切片段通过虹吸作用转移至HybondN＋尼龙膜上（约需24h）。第四天3)将膜用2×SSC洗2次，每次5min，置于干净滤纸上晾干，晾干的膜于已预热至85℃左右的干燥箱中烘干（约3h），或紫外照射3min。保存于4℃备用。四、Southern杂交原理North2South®生物素标记和化学发光检测Kit采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dCTP掺入到合成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂

7、交实验的高活性DNA探针。杂交洗膜后，DNA上的生物素与链亲和素标记的HRP结合，最后与Pierce的化学发光底物发光检测，灵敏度可以与732P相媲美。步骤：1）预杂交在65℃水浴中预热杂交液，将准备好的膜置于杂交盒中，加入预热的杂交液10mL（将膜完全淹没，每平方厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65℃外，其他的都用55℃），盖好盖子，置于55℃杂交箱中预杂交1h。2）探针准备：A将1µL生物素标记的N4-dCTP与4µL的5×dNTP混合物充分混合备用（总量5µL）；B在离心管中稀释约50ng