兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究_1

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究作者：张福勇，吴小涛，王运涛，鲍军平，朱磊，邱匀峰【摘要】目的：初步探讨骨髓间充质干细胞与纤维环细胞的共培养对细胞增殖及主要细胞外基质的影响，进一步确定BMMSCs移植对椎间盘退变的预防和治疗作用。方法：分别培养兔的BMMSCs与AF细胞，将两种细胞按1∶1的比例混匀，利用离心管培养技术培养3周后取材，大体观察并行HE染色；使用荧光染料Hoechst33258检测细胞增殖；通过实时荧光PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多

2、糖含量进行测定。结果：在体外培养3周后，细胞团体积达到最大，涂片染色显示共培养组细胞致密，细胞增殖较对照组明显，实时荧光PCR检测结果显示Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达增强。结论：在离心管内三维培养条件下，BMMSCs与AF细胞共培养能够促进增殖，增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量。【关键词】骨髓间充质干细胞；纤维环细胞；生物医学工程；细胞培养；兔下腰痛是一种常见的骨科疾患，发病率高，75%～80％的人在其一生中的某个阶段都会受到下腰痛的困扰。椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因，临床常用的手术及保守治疗虽然能够取得一定的治疗效果，但并非针对椎间盘退变本身，目前的治疗方法并不能够阻止椎间盘的退

3、变［1］课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果。椎间盘退变的合理解决方法就是对退变的椎间盘进行生物学修复。椎间盘有外层的纤维环、内部的髓核及上下终板构成。在椎间盘退变防治研究中,AF的生物学作用越来越受到人们的重视,维持和修复AF的完整性有着重要的意义［2］。本研究观察骨髓间充质干细胞与AF细胞共培养后是否可以促进细胞增殖及蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达，达到阻止和抑制椎间盘退变的目的。

4、1材料与方法实验仪器与材料实验仪器包括721分光光度计(上海市仪器厂)，高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)，倒置荧光相差显微镜(德国ZEiss公司)，5%CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)，数码照相机(日本Canon公司)；实验材料有木瓜蛋白酶(公司)，100%胎牛血清(杭州四季青生物公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，台盼蓝试剂(美国Sigma公司)，塑料离心管(Corning公司)，LG-DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶、Hoechst33258和CalfThymusDNA等试剂;新西兰大白兔由江苏省农业科学院提供。实时荧光PCR委托上海拓科生物技术有限公司检测。实验步

5、骤取材BMMSCs的分离取1月龄新西兰大白兔30只,雌雄不拘,体重～，1%戊巴比妥钠按ml·kg-1课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果的剂量施以全身麻醉，无菌操作下切取兔的股骨,两端剪断,用PBS液冲洗,收集细胞,离心后用15％的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,然后于3℃、5％CO2、100％饱和湿度条件下培养。d后第1次换液，以后每隔d换液1次，培养至第3代［3］。AF

6、细胞的分离取1月龄新西兰大白兔54只，雌雄不拘，体重～，同上法麻醉后无菌条件下取出兔的脊柱，剔除周围软组织，取出椎间盘，放入含有PBS的培养皿内，用眼科剪去除终板及髓核组织，将AF的最外层及最内层去除，留取中间部分，用PBS液冲洗3遍后，用眼科剪将组织剪成1mm3大小，移入含有20mlⅡ型胶原酶的培养皿内消化6～h，120目过滤器过滤后PBS液洗涤3遍，用15％的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,置3℃、5％CO2、100％饱和湿度条件下培养。d后第1次换液，以后每隔d换液1次，培养3周后待用［4］。图1终板及髓核被清除后的AFFig1AFafternucleuspulposusa

7、ndendplatewereremoved共培养模型的建立及分组单层培养的细胞经胰酶消化后，按照每管含5×10BMMSCs、AF细胞或1∶1的比例混合细胞，将细胞悬液移入1ml塑料离心管内，再加入DMEM培养液至ml，其中含10％的胎牛血清、100U·ml-1青霉素、100课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课