兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

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1、兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究作者：张福勇，吴小涛，王运涛，鲍军平，朱磊，邱匀峰【摘要】目的：初步探讨骨髓间充质干细胞（BMMSCs）与纤维环（AF）细胞的共培养对细胞增殖及主要细胞外基质的影响，进一步确定BMMSCs移植对椎间盘退变的预防和治疗作用。方法：分别培养兔的BMMSCs与AF细胞，将两种细胞按1∶1的比例混匀，利用离心管培养技术培养3周后取材，大体观察并行HE染色；使用荧光染料Hoechst33258检测细胞增殖；通过实时荧光PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖含量进行测定。结果：在体外培养3周后，细胞团体积达到最大

2、，涂片染色显示共培养组细胞致密，细胞增殖较对照组明显，实时荧光PCR检测结果显示Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达增强。结论：在离心管内三维培养条件下，BMMSCs与AF细胞共培养能够促进增殖，增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量。【关键词】骨髓间充质干细胞；纤维环细胞；生物医学工程；细胞培养；兔下腰痛是一种常见的骨科疾患，发病率高，75%～80％的人在其一生中的某个阶段都会受到下腰痛的困扰。椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因，临床常用的手术及保守治疗虽然能够取得一定的治疗效果，但并非针对椎间盘退变本身，目前的治疗方法并不能够阻止椎间盘的退变［1

3、］。椎间盘退变的合理解决方法就是对退变的椎间盘进行生物学修复。椎间盘有外层的纤维环（AF）、内部的髓核及上下终板构成。在椎间盘退变防治研究中,AF的生物学作用越来越受到人们的重视,维持和修复AF的完整性有着重要的意义［2］。本研究观察骨髓间充质干细胞（BMMSCs）与AF细胞共培养后是否可以促进细胞增殖及蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达，达到阻止和抑制椎间盘退变的目的。1材料与方法1.1实验仪器与材料实验仪器包括721分光光度计(上海市仪器厂)，高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)，倒置荧光相差显微镜(德国ZEiss公司)，5%CO2细胞

4、培养箱(德国Heraeus公司)，数码照相机(日本Canon公司)；实验材料有木瓜蛋白酶(E.Merck公司)，100%胎牛血清(杭州四季青生物公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，台盼蓝试剂(美国Sigma公司)，塑料离心管(Corning公司)，LG-DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶、Hoechst33258和CalfThymusDNA等试剂（Gibco公司）;新西兰大白兔由江苏省农业科学院提供。实时荧光PCR委托上海拓科生物技术有限公司检测。1.2实验步骤1.2.1取材1.2.1.1BMMSCs的分离取1月龄新西兰大白兔30只,雌雄

5、不拘,体重0.5～0.6kg，1%戊巴比妥钠按2ml·kg-1的剂量施以全身麻醉，无菌操作下切取兔的股骨,两端剪断,用PBS液冲洗,收集细胞,离心后用15％的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,然后于37℃、5％CO2、100％饱和湿度条件下培养。5d后第1次换液，以后每隔3d换液1次，培养至第3代［3］。1.2.1.2AF细胞的分离取1月龄新西兰大白兔54只，雌雄不拘，体重0.5～0.6kg，同上法麻醉后无菌条件下取出兔的脊柱，剔除周围软组织，取出椎间盘，放入含有PBS的培养皿内，用眼科剪去除终板及髓核组织，将AF的最外层及最内层

6、去除，留取中间部分（图1），用PBS液冲洗3遍后，用眼科剪将组织剪成1mm3大小，移入含有20mlⅡ型胶原酶的培养皿内消化6～8h，120目过滤器过滤后PBS液洗涤3遍，用15％的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,置37℃、5％CO2、100％饱和湿度条件下培养。5d后第1次换液，以后每隔3d换液1次，培养3周后待用［4］。图1终板及髓核被清除后的AFFig1AFafternucleuspulposusandendplateoved1.2.1.3共培养模型的建立及分组单层培养的细胞经胰酶消化后，按照每管含5×105BMMSCs、A

7、F细胞或1∶1的比例混合细胞，将细胞悬液移入15ml塑料离心管内，再加入DMEM培养液至5ml，其中含10％的胎牛血清、100U·ml-1青霉素、100μg·ml-1链霉素，pH7.4，以20×g的离心力低速离心5min形成微球，置于37℃、5％CO2、100％饱和湿度下培养，由此形成3个观察组，即BMMSCs组、AF细胞组和共培养组。5d后第1次换液，以后每隔3d进行半量换液，培养至第21天对各项指标进行检测［4］。1.2.2观察指标1.2.2.1组织学检查取离心管内培养的细胞团，大体观察并涂片、固定，然后行HE染色，观察细胞形态和

8、组织结构。1.2.2.2DNA含量测定培养3周后，组织块用20U·ml-1的木瓜蛋白酶消化过夜，采用Hoechst33258荧光法测定各离心管内细胞的DNA含量。20μl标本中加1μg·ml-1的Hoechst33258